Abstract
Tradisjonelt GRP78 har vært ansett som en endoplasmatiske retikulum (ER) lumenal protein på grunn av sin karboksyl KDEL retensjon motiv. Nylig er en underfraksjon av GRP78 funnet å lokalisere seg til overflaten av spesifikke celletyper, som tjener som ko-reseptorer og reguleringssignalering. Imidlertid er den fysiologiske betydningen av celleoverflaten GRP78 (sGRP78) uttrykk i kreft og dets funksjonelle interaksjoner på celleoverflaten bare dukker opp. I denne rapporten, kombinert vi biokjemiske, bildebehandling og mutasjons tilnærminger for å løse disse problemene. For påvisning av sGRP78, benyttet vi et mus monoklonalt antistoff svært potent og spesifikk for GRP78 eller epitop-tagget GRP78, kombinert med bilde og biokjemiske teknikker som tillater påvisning av sGRP78 men ikke intracellulært GRP78. Våre undersøkelser viste at bryst og prostata kreftceller som er resistente mot hormonterapi aktivt fremme GRP78 til celleoverflaten, noe som kan bli ytterligere forhøyet ved en rekke ER stress-induserende betingelser. Vi viste at sGRP78 danner kompleks med PI3K, og overekspresjon av sGRP78 fremmer PIP3 dannelse, en indikasjon på PI3K aktivering. Vi har videre oppdaget at en innførings mutant av GRP78 ved dets N-terminale domene, og samtidig beholde stabil ekspresjon og evnen til å translocate til celleoverflaten som villtype-proteinet, oppviste redusert kompleksdannelse med P85 og produksjon av PIP3. Således våre studier tilveiebringe en mekanistisk forklaring for regulering av PI3K /AKT signalering ved sGRP78. Våre funn tyder på at målretting sGRP78 kan undertrykke terapeutisk motstand i kreftceller, og tilbyr en ny strategi for å undertrykke PI3K aktivitet
Citation. Zhang Y, Tseng CC, Tsai YL, Fu X, Schiff R, Lee AS (2013 ) kreftceller Resistent mot Therapy fremme celle overflaten Relocalization av grp78 Hvilke komplekser med PI3K og Forbedrer PI (3,4,5) P3 Production. PLoS ONE 8 (11): e80071. doi: 10,1371 /journal.pone.0080071
Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA
mottatt: 02.08.2013; Godkjent: 08.10.2013; Publisert: 11.11.2013
Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institutes of Health (NIH) innvilger R01 CA027607 og P01 AG034906 til ASL; P50 CA058183 (Breast Cancer SPORE), P01 CA030195, The Breast Cancer Research Foundation og SU2C /bryst program til RS; P30 CA014089 (USC Norris Comprehensive Cancer Center Cell og Tissue Imaging Core) og P30 DK048522 (USC Research Center for Leversykdommer Cell og Tissue Imaging Core). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
78 kDa glukoseregulerte protein (GRP78), også kalt BIP /HSPA5, er en stor endoplasmatiske retikulum (eR) anstand med anti-apoptotiske egenskaper [1] og en mester regulator av eR stress signale [2], [3]. Tumorceller utsettes for ER stress på grunn av iboende faktorer av endret metabolisme og ytre faktorer av hypoksi og næringsmangel. ER stress induksjon av GRP78 i kreftceller favoriserer celleoverlevelse, tumorprogresjon [4], [5] og overfører stoffet motstand i både prolifererende og hvilende kreftceller, så vel som tumorassosierte endotelceller [6] – [11]. Derfor forstå hvordan GRP78 utøver sin pleiotropiske effekter på celleproliferasjon og overlevelse er av stor betydning.
Tradisjonelt GRP78 har vært ansett som en ER lumenal protein på grunn av sin karboksyl KDEL oppbevaring motiv [12]. Nylig ble en underfraksjon av GRP78 funnet å lokalisere seg til overflaten av spesifikke celletyper, særlig i kreftceller [13] – [16]. Celleoverflate proteomet profilering av tumorceller viste en relativ overflod av varmesjokk anstand og glukoseregulerte proteiner, inkludert GRP78 [17]. Det viktigste er at preferanse ekspresjon av GRP78 på overflaten av tumorceller, men ikke i normale organer spesifikk tumor målretting, som fører til tumor undertrykkelse uten skadelige effekter på normale vev [18] -. [21]
Evidence dukker det sGRP78 kan danne komplekser med spesifikke celleoverflateproteiner og regulere signaltransduksjon [13], [14], [16], slik som en co-reseptor for den proteinaseinhibitor α2-makroglobulin (α2-M *) indusert signaltransduksjon for cancer overlevelse og metastasering [22], [23]. Cripto, et GPI-forankret celleoverflateprotein nøkkel til humane tumorprogresjon, og sGRP78 danner et kompleks og samarbeide for å inhibere TGF-β signalering og forbedre cellevekst og PI3K /AKT-aktivering [24], [25]. I tillegg er sGRP78 nødvendig for T-cadherin-avhengige endotel celle overlevelse [26], aktivering av apoptose mediert av Kringle 5 [27], [28] og ekstracellulære Par-4 og TRAIL [29], så vel som viral inngang til verts -celler [30], [31]. Nylig har vi demonstrert celleoverflaten lokalisering av GRP78 er regulert av ER gjenfinning maskiner og forbedret ved nedbryting av Ca
2+ fra ER [32]. Kreftceller er ofte utsatt for ER stress, som blir forverret av cytotoksisk behandling som fører til resistens. Men om patologisk stress, slik som utvikling av terapeutiske motstand, fører til relocalization av GRP78 til celleoverflaten er ikke kjent.
PI3K /AKT-reaksjonsveien er aktivert i en rekke kreftformer som fører til proliferasjon og terapeutisk motstand [33]. Den PI3K har to underenheter, den P85 regulatoriske subenhet og P110 katalytiske subenheten. For PI3K aktivering, tyrosin fosforylering av P85 regulerende subenhet av PI3K lindrer dens hemmende aktivitet på PI3K, som fører til aktivering. Ved binding til aktiverte vekstfaktor-reseptor, er PI3K rekruttert til plasmamembranen. PI (4,5) P2 blir fosforylert av PI3K, hvilket ga PI (3,4,5) P3, som fremmer membran lokalisering av PDK1, som deretter fosforylerer og aktiverer AKT. Gjennom knockdown av GRP78 ved siRNA, ligering av celleoverflate GRP78 med antistoff og i genetiske modeller for kreft, GRP78 er etablert som en ny regulator av PI3K signalering både in vitro og in vivo [16], [25], [34], [35]. Selv om det kan være flere mekanismer hvorved GRP78 kan påvirke AKT-aktivering, har det blitt rapportert at antistoff rettet mot den N-terminale ende av grp78 etterligner reseptor-anerkjente former av α2-M * som en ligand og driver PI3K-avhengig aktivering av AKT og påfølgende stimulering av cellulær proliferasjon in vitro [21], [36]. Omvendt, en karboksyl-terminal domene reaktive antistoffer virker som en antagonist av α2-M * og undertrykker α2-M * -indusert AKT-fosforylering [21]. Nylig er et monoklonalt antistoff rettet mot celleoverflate GRP78 vist seg å undertrykke PI3K /AKT signalisering, tumorutvikling og metastasering i flere cancermodeller [37]. Til tross for disse fremskrittene, er lite kjent om hvordan sGRP78 regulerer PI3K aktivitet. I denne rapporten analyseres vi sGRP78 uttrykk i bryst og prostata kreft cellelinjer som er resistente mot hormonbehandling, og undersøkt sin regulering av PIP3 produksjon. Disse resultatene utvide vår kunnskap om sGRP78 og har viktige implikasjoner for kreftbehandling.
Materialer og metoder
Alle protokoller for bruk av dyr ble gjennomgått og godkjent av USC Institutional Animal Care og bruk komité. Dyret forsikring nummeret er A3518-01. Protokollen nummer er 9964.
Cellelinjer og kultur
Mus embryonale fibroblast (MEF) celler [38], humane cellelinjer, HEK293T [32] og HeLa [32], ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin /streptomycin. Humane cellelinjer, LNCaP (ATCC, Manassas, VA) og C4-2B (Viromed Lab, Minneapolis, MN), ble holdt i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin. De MCF7L parentale celler [39] ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% varme-inaktivert FBS, og 1% penicillin /streptomycin /glutamin; de MCF7L-Tamr celler i det samme medium, bortsett fra fenol rød fri (PRF) RPMI 1640 og 10% trekull strippet dekstran (CS) -FBS. Foreldre MCF7 /HER2-18 celler [40] ble dyrket i DMEM inneholdende 10% FBS, 1% penicillin /streptomycin, 0,4% geneticin (Life Technologies, Grand Island, NY) og 15 ug /ml insulin (Sigma-Aldrich, St . Louis, MO); de MCF7 /HER2-18-Tamr celler i det samme medium, bortsett fra PRF DMEM og 10% CS-FBS. De Tamr celler av både MCF7L og MCF7-HER2-18 modellene ble opprettholdt i medium inneholdende 100 nM 4-hydroxytamoxifen (Sigma-Aldrich) i den endelige konsentrasjonen. Østrogen-avhengige cellelinje, MCF-7 /BUS, ble vennlig levert av A.M. Soto (Tufts University, Medford, MA) og har blitt beskrevet [41], [42]. Isolerings og dyrkningsbetingelser for østrogen sult resistent klon MCF-7 /BUS-10, er blitt beskrevet [43]. Alle celler ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2, 95% luft. For spenning behandling ble cellene behandlet med thapsigargin (Tg) ved 300 nM, tunicamycin (Tu) ved 1,5 ug /ml i 16 timer, eller 2-deoksyglukose (2DG) ved 10 mM i 24 timer.
plasmider
byggingen av FLAG-GRP78 med en FLAG-tag satt inn etter at eR signal peptid (aa 1-18) av full lengde human GRP78 (aa 1-654) har blitt beskrevet [32]. GRP78-103F inneholder en FLAG-tag satt inn rett etter aa 103 av menneskelig GRP78 ble konstruert som følger: full-lengde human GRP78 i pcDNA3 (Life Technologies) ryggrad ble brukt som mal med QuikChange seterettet mutagenese (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Den fulle lengde human PI3K regulatorisk subenhet, P85 alfa cDNA ble forsterket av RT-PCR fra menneske HEK293 RNA og subklonet i pcDNA3 ved BamHI og Xbal nettsider.
Transfeksjon vilkår
Cellene ble dyrket 60-80% samløpet og transfektert med Biot (Bioland Scientific, Paramount, CA) å følge produsentens instruksjoner som beskrevet [32].
immunoblotanalyse
Celler ble lysert i radioimmunpresipitasjonsmålinger (RIPA) buffer supplert med kompetent proteasehemmer (Thermo Scientific, Rockford, IL). Cellelysatene ble utsatt for 10% SDS-geler og Western blot-analyser som beskrevet [32]. Antistoffer som ble brukt var: mus anti-FLAG antistoff (Sigma-Aldrich), 1:1000; mus anti-GRP78 antistoff MAb159 (gave fra P. Gill, USC), 1:2000; kanin anti-PI3K P85 antistoff (# 4292, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), 1:1000; kanin anti-PI3K p110α antistoff (# 4249, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), 1:1000; mus anti-EphB4 antistoff (gave fra P. Gill, USC), 1:1000; kanin anti-NKA α1 (Na, K-ATPase α1) antistoff (Cell Signaling Technology), 1:1000; mus anti-β-aktin-antistoff (Sigma-Aldrich), 1:5000. Forsøkene ble gjentatt 2-3 ganger. Protein nivåer ble påvist enten ved forsterket kjemiluminescens (ECL) eller fluorescens flekker, og visualisert og kvantifisert med bilde Lab (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) eller ved licor Odyssey.
immunfluorescens og konfokalmikroskopi
for påvisning av endogent sGRP78, ble C4-2B cellene sådd ut ved 5 x 10
3 per brønn i en 8-brønners kammer glider (Millipore, Billerica, Massachusetts) i 24 timer og deretter behandlet med Tg i 8 timer . Cellene ble deretter fiksert i kald 4% paraformaldehyd i 10 minutter, vasket med kald PBS og deretter blokkert med 5% BSA i PBS (BSA /PBS) på is i 30 min. Cellene ble farget med muse anti-GRP78 monoklonalt antistoff (MAb159) i 1% BSA /PBS ved 10 ug /ml ved 4 ° C over natten uten permeabiliseringen. Cellene ble vasket med kald PBS og farget med AlexaFluor-488 geit-anti-mus-antistoff (Life Technologies) i 1% BSA /PBS ved 4 ° C i 1 time. For påfølgende immunfarging for P85 som er intracellulær, ble cellene permeabilisert med 0,5% (w /v) saponin i PBS ved romtemperatur (RT) i 15 minutter. Cellene ble vasket med PBS inneholdende 0,01% saponin (PBS /Sap), og deretter blokkert med 5% BSA i PBS /Sap ved RT i 1 time. Cellene ble farget med kanin-anti-P85-antistoff (1:50, Cell Signaling Technology) i 1% BSA i PBS /Sap ved romtemperatur i 2 timer, etterfulgt av farging med AlexaFluor-594 geit-anti-kanin-antistoff (Life Technologies) i 1% BSA i PBS /Sap ved RT i 1 time.
for påvisning av ectopically uttrykt FLAG-merket GRP78 på celleoverflaten, HeLa celler ble sådd på 5 x 10
3 per brønn i 8- vel kammeret glir 24 timer før transfeksjon. Transfeksjon ble utført ved hjelp av Biot. Førtiåtte timer etter transfeksjon, ikke-permeabiliserte celler ble fiksert og sperret som beskrevet ovenfor, og deretter inkubert med mus-anti-FLAG antistoff (Sigma-Aldrich) i 1% BSA /PBS ved 4 ° C i 1 time etterfulgt av inkubasjon med AlexaFluor -488 geite-anti-mus-antistoff (Life Technologies) i 1% BSA /PBS ved 4 ° C i 30 min. For påvisning av fosfatidylinositol-3,4,5-trifosfat (PI (3,4,5) P3), ble cellene deretter behandlet med MOM ™ mus Ig Blokkering Reagent (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ved romtemperatur i 1 time for å blokkere musimmunglobulin fra muse anti-FLAG antistoff. Cellene ble deretter permeabilisert som beskrevet ovenfor, og intracellulær PI (3,4,5) P3-farging ble utført som beskrevet [35]. For påvisning av P85 i HeLa-celler, ble cellene permeabilisert og farget med det primære antistoff ved 37 ° C i 1 time og det sekundære antistoff ved 37 ° C i 30 minutter.
Alle immunfarget celler ble montert med Vectashield anti-fade medium som inneholder DAPI (Vector Laboratories), og analysert av en Zeiss LSM510 konfokal mikroskop utstyrt med LSM 510 versjon 4.2 SP1 oppkjøpet programvare (Carl Zeiss). Representative bildene ble tatt med et EF Plan-Neofluar 40 × /1,30 olje objektiv eller en Plan-Apochromat 100 × /1,4 olje DIC objektiv. Z-stack bildene ble tatt med en Plan-Apochromat 100 × /1,4 olje DIC objektiv.
Cell overflateprotein biotinylering og isolasjon
celleoverflateproteiner ble biotinylert med ikke-gjennomtrengelig biotin, lysert i RIPA-buffer og renset ved NeutrAvidin agarosekuler slik som tidligere beskrevet [32].
Co-immunutfelling assay
De transfekterte celler ble biotinylert og lysert med immunutfelling (IP) buffer (25 mM Tris- Cl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP40). Cellelysatene ble underkastet monomert avidin-kolonne (Thermo Scientific) og eluert med 2 mM D-biotin i PBS å følge produsentens instruksjoner. Eluatet ble konsentrert med Vivaspin 6 konsentratorer (10 kDa MWCO, Sartorius Stedim Biotech, Concord, CA), preklarede med 50 pl Dynabeads protein G (Life Technologies) og underkastet inkubasjon med 1 ug muse-anti-FLAG antistoff (Sigma-Aldrich) eller normal mus IgG over natten ved 4 ° C, etterfulgt av inkubering med 50 pl Dynabeads protein G i 1 time ved 4 ° C. Etter vasking ble kulene kokt i 5 min i 2 x SDS-prøvebuffer, ble prøvene underkastet 10% SDS-PAGE-elektroforese og Western blot.
fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) analyse
cellene ble løsnet med ikke-enzymatisk celledissosiasjon oppløsning (Sigma-Aldrich) ved 37 ° C i 15 min og aliquotert til 1 x 10
6 celler /rør, og inkubert med 10% normalt humant serum i PBS i 20 minutter på is for å blokkere Fc-reseptorer på celleoverflaten. Cellene ble inkubert med en mettende mengde av mus anti-GRP78-antistoff (MAb159) (1 ug) i 40 minutter på is i 100 ul flekker buffer (Dulbeccos PBS, 2% varmeinaktivert føtalt kalveserum, 0,09% natriumazid) , etterfulgt av AlexaFluor-488-konjugert geite-anti-muse-sekundært antistoff (0,5 ug, Life Technologies) og suspendert i iskald PBS inneholdende 4,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, 1 ug /ml, Sigma-Aldrich) og underkastet FACS. Dataene ble kjøpt opp av LSR II flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, California) og analysert ved hjelp av FlowJo programvare.
Resultater
Aktiv fremme celleoverflaten GRP78 uttrykk i kreftceller resistente mot hormon terapi
for å teste om utvikling av resistens mot terapeutisk behandling endrer uttrykk for sGRP78 i kreftceller, benyttet vi tre sett med kreft cellelinjer og deres derivater som har oppnådd resistens mot behandlingsregimet. Den humane brystcancer cellelinje MCF7L foreldrelinje (MCF7L-P) og et derivat tamoxifen resistent linje (MCF7L-Tamr) ble samlet ved langtidskultur av MCF7L-P-celler i PRF-medium inneholdende 10% CS-FBS og 100 nM tamoxifen (Tam) til cellevekst gjenopptatt (etter 4 mnd). I motsetning til de MCF7L-P-celler som vokste i medium inneholdende E2 men ikke i medium inneholdende Tam, MCF7L-Tamr celler viste ekvivalente vekstrater når det utsettes for enten østrogen (E2) eller Tam (figur 1A). Den menneskelige brystkreft cellelinje MCF7- /HER2-18-P som er en HER2-overuttrykk klone og dens Tam-R derivat ble isolert etter lang tids eksponering for Tam for ca 11 mnd. Det tredje paret av celler er de veletablerte androgen-sensitive humane prostata adenokarsinomceller, LNCaP, og dens derivat, androgen-uavhengig cellelinje, C4-2B.
(A) Validering av Tam resistente fenotype av MCF7L-Tamr celler. MCF7L-foreldre (P) og -TamR cellene ble pre-sultet i fenol rød-fri (PRF) medium inneholdende 5% CS-FBS for 5 d før utsettes for østrogen (E2) (1 nM) eller Tam (100 nM) behandling for åtte d. Celler ble sådd ut i quadruplicates i 96-brønns plate og antall celler ble talt ved en in situ-celle-cytometer. Etter 8 dager ble cellene farget med metylenblått som vist i det nedre panel. Feilfelt representerer standardavvik; * P 0,001, tosidig t-test, celle vekst under Tam vs. E2. (B) immunoblotter av MEF celler ved hjelp MAb159, med β-actin som lasting kontroll. Venstre kjørefelt viste MEF lysatene fra
grp78 floxed /floxed
mus. Høyre kjørefelt viste bortfall av GRP78 bandet etter infeksjon med adenovirus som uttrykker Cre-rekombinase til knockout
grp78 floxed /floxed
alleler. (C) Representative Western blot for økt sGRP78 nivå i resistente kreftceller. Sperre (P) og Tamr derivater av de humane brystkreftcellemodeller av MCF7L og MCF7 /HER2-18, samt den paren androgen følsomme LNCaP-cellelinje og androgen-uavhengig C4-2B-celler ble utsatt for biotinylering og NeutrAvidin agarose pull -ned for å berike for celleoverflateprotein. Celleoverflate GRP78 (sGRP78) og total intracellulære GRP78 (tGRP78) i cellelysatet ble analysert ved Western blot. Den totale mengde av lysat ble 10% av den mengde som brukes for avidin pull-down. β-actin fungert som lasting kontroll for tGRP78, mens membranprotein, EphB4, eller Na, K-ATPase α1 (NKA α1) tjente som lasting kontroll av celleoverflateproteiner i bryst eller prostata kreft celler (PCA), henholdsvis. Eksperimentene ble gjentatt to ganger. Proteinbåndene ble kvantifisert og de relative nivåer av tGRP78 i sperre og resistente cellelinjer ble normalisert mot β-aktin, og sGRP78 nivå er normalisert mot EphB4 eller NKA α1, henholdsvis, som er vist med gjennomsnitt ± standardavvik (SD) i grafen under. Nivåene i foreldrecellelinjer og i androgen sensitive cellelinje, er LNCaP satt som 1.
For deteksjon av GRP78, benyttet vi en høy affinitet monoklonalt antistoff MAb159 rettet mot humant GRP78 at anerkjent bare GRP78 proteinbånd (figur 1B). Ved knockout av
grp78
floxed alleler i MEFs ved infeksjon med adenovirus som uttrykker Cre-rekombinase, den GRP78 bandet ble avskaffet, bekrefter at MAb159 gjenkjenner spesifikt GRP78. For påvisning av sGRP78 ble cellene biotinylert, og de celleoverflateproteiner ble renset ved agarose NeutrAvidin pull-down. Fra Western blot-analyse av de biotinylerte proteinene og den totale lysat, var nivåene av sGRP78 og total intracellulær GRP78 bestemt for hver cellelinje, med EphB4 og NKA α1 tjener som lastende kontroller for celleoverflate-proteiner for brystkreft og prostatacancercellelinjer, henholdsvis. β-actin, en cytosolprotein, servert som lasting kontroll for de totale cellelysatene. Representant Western blot analyser for påvisning av sGRP78 og total GRP78 vises, med grp78 nivåer etter kvantifisering og normalisering til de respektive lastkontroller grafer under og vist med standardavvik (figur 1C). Fraværet av β-aktin i proteinene pull-down ved NeutrAvidin bekreftet mangelen på intracellulært protein forurensning i de proteinfraksjonene celleoverflaten. For MCF7L-P-celler som uttrykte et moderat basal nivå av GRP78, var det en 3-dobling av total GRP78 men en 7-dobling i sGRP78 i Tamr celler. For MCF7 /HER2-18-P-celler som uttrykte en høyere basal nivå av GRP78, de Tamr cellene viste bare minimal økning i total GRP78 men en 4-dobling i sGRP78. For androgen-uavhengig C4-2B celler, den totale GRP78 økning androgen-sensitive LNCaP cellene var mindre, men det var om en 7-dobling av sGRP78. Sammen er disse resultatene antyder at økningen i sGRP78 i resistente cellelinjer ikke bare parallelt økningen i den totale mengde av GRP78, i stedet for utvikling av resistens fremmer spesiell mekanisme (r) for å forbedre GRP78 lokalisering til celleoverflaten.
ER stress løfter celleoverflaten GRP78 nivået ytterligere i resistente kreftceller
Tidligere har vi rapportert at Tg, som hemmer ER ATPase forårsaker Ca
2 + utstrømming fra ER, fremmer translokasjon av GRP78 fra ER til celleoverflaten i humane embryonale nyreceller 293T [32]. Imidlertid, uansett om dette gjelder kreftcellelinjer som allerede oppviser moderate til høye nivåer av GRP78 er ikke kjent. Som kreftceller blir rutinemessig utsatt for ER stress i svulsten mikromiljøet, er det viktig å fastslå om kreftceller som har utviklet resistens overfor terapi er i stand til ytterligere løfte sGRP78 ekspresjon som reaksjon på ER stress. For å teste disse, vi behandlet resistente celler med forskjellige induserer ER stress og målt sGRP78 ved FACS samt av biokjemiske tilnærminger. I den første metode ble de MCF7L-P og Tamr cellelinjer behandlet med Tg. Celleoverflate GRP78 ble påvist ved FACS-analyse (figur 2A). For MCF7L-P cellelinje, behandling med Tg førte til en 4,8 ganger økning i sGRP78. For MCF7L-Tamr cellelinje som allerede oppviser 12 ganger høyere nivå av sGRP78 sammenlignet med foreldre MCF7L-P-celler, Tg behandlings ytterligere løfter sGRP78 uttrykk til 20 ganger (figur 2A).
(A) Sperre og tamoxifen-resistente MCF7L-celler var enten ubehandlet (Ctrl) eller behandlet med 300 nM thapsigargin (Tg) i 16 timer. Celleoverflate GRP78 ble målt ved FACS. Representative FACS profiler blir vist og prosenter av positive celler er angitt i øvre høyre hjørne. Blå stiplet linje, isotypekontrollantistoff; rødt fast stoff linje, anti-Ab GRP78. (B) Østrogen sulte sensitiv human brystcancer cellelinje MCF7 /BUS, og dens motstandsdyktige derivat klon, MCF7 /BUS-10, var enten ubehandlet (Ctrl) eller behandlet med 10 mM 2-deoksyglukose (2DG) i 24 timer. Cellene ble biotinylert og celleoverflateproteiner renset ved agarose NeutrAvidin pull-down. sGRP78 og tGRP78 ble oppdaget av Western Blot. β-actin tjente som lasting kontroll. De fold endringer i sGRP78 og tGRP78 er vist nedenfor og kontrollere tilstanden i MCF7 /buss celler ble satt som 1. (C) Samme som (B), bortsett C4-2B celler behandlet med Tg, Tu (tunicamycin) eller 2DG. NKA α1 fungert som celleoverflateprotein lasting kontroll. De relative nivåer av tGRP78 og sGRP78 er normalisert mot β-aktin eller NKA α1, henholdsvis, og uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. fra to uavhengige eksperimenter i grafen (til høyre).
I den andre fremgangsmåten, vi utnyttet østrogenavhengig cellelinje MCF-7 /BUS og dets derivat MCF-7 /BUS-10 cellelinje som har ervervet resistens mot østrogen sult [43]. Cellene ble biotinylert og celleoverflateproteiner underkastes NeutrAvidin agarosekuler pull-down. Nivåene av sGRP78 og total intracellulære GRP78 ble bestemt ved Western Blot (figur 2B). I overensstemmelse med MCF7L og MCF7 /HER2-18 cellelinjer, utvikling av resistens i MCF-7 /BUS-10-modellen i det vesentlige økte mengden av sGRP78 (ved 9-ganger), mens den totale intracellulære mengde var moderat forhøyet (med 1,3 ganger). For både foreldrenes og resistente cellelinjer, behandling av celler med 2DG, induserer ER stress via hemming av glykolyse og glykosylering, ytterligere forhøyet sGRP78 uttrykk med om lag 5,2 ganger i foreldrelinjen og 3,5 ganger i motstandsdyktig linjen (figur 2B).
Vi undersøkte neste nivået av sGRP78 og total GRP78 i androgen-uavhengig prostatacancer-cellelinje C4-2B, med eller uten ER stress (figur 2C). I disse studiene, i tillegg til Tg og 2DG behandling, tilsatte vi en annen ER stress inducer, tunicamycin (TU), som skaper ER stress ved å blokkere N-bundet protein glykosylering, og dermed forårsaker akkumulering av underglycosylated proteiner i ER. I Western blot analyse, β-aktin og NKA α1 fungerte som laste kontroller for totalt og celleoverflateproteiner, henholdsvis. Som i tilfellet for de resistente brystkreftceller, ER stress forårsaket en moderat økning i total GRP78 (etter ca. 2 ganger), da disse cellene allerede uttrykt høyt basalnivå GRP78 sammenlignet med sine følsomme parentale celler. Under alle tre ER stress forhold, økt sGRP78 nivå ved 5- til 6 ganger, sammenlignet med ikke-stresset celler. Samlet viser disse resultater at diverse ER stress stimuli er i stand til aktivt å fremme sGRP78 ekspresjon i både medikamentsensitive og resistente kreftceller, og at utviklingen av terapeutiske motstand i kombinasjon med ER stress for enda bedre sGRP78 uttrykk.
Celleoverflate GRP78 danner kompleks med PI3K
Nylige studier tyder på at endringen av sGRP78 forandrer PI3K /AKT vei, men hvor det er oppnådd er ikke godt forstått [14], [16]. For å løse dette, bestemte vi enten sGRP78 samlokalisert med PI3K på celleoverflaten. C4-2B, med høy endogen sGRP78 og relativt enkelt kultur, presenterer en passende cellemodellsystem. For å maksimere sGRP78 ekspresjon, ble cellene behandlet med Tg. I ikke-permeabiliserte celler, vil antistoffarging primært detektere GRP78 på celleoverflaten, i stedet for den meget rikelig intracellulære GRP78, som lokaliserer majorly i det perinukleære ER-regionen. Etter 8 h Tg behandling, endogen sGRP78, som visualisert ved farging med immunofluorescens den MAb159 monoklonale antistoff ble detektert spredt over celleoverflaten av C4-2B-celler (figur 3A). For å oppdage den PI3K regulatorisk subenhet P85 som er intracellulær ble MAb159 immunostained celler permeabilized etterfulgt av farging med antistoff mot P85. Som vist i representative bilder, ble observert samlokalisering av endogen sGRP78 og P85 i flere nettsteder for en underfraksjon av sGRP78 og P85 (figur 3A, piler).
(A) Konfokalmikroskopi påvisning av samlokalisering av endogent sGRP78 med P85 i C4-2B celler behandlet med Tg i 8 timer. Ikke-permeabilized celler ble først farget med anti-GRP78 antistoff (MAb159) for å oppdage sGRP78 (
grønn
) (til venstre). Cellene ble deretter permeabilisert og deretter farget med anti-P85-antistoff (
rød
). (B) Co-lokalisering av celleoverflate-F-GRP78 med P85 i HeLa-celler. Ikke-permeabilized HeLa-celler transfektert med F-GRP78 ekspresjonsvektor ble først farget med anti-FLAG antistoff for å påvise overflate F-GRP78 (
grønn
) (til venstre), deretter permeabilized og farget med anti-P85 antistoff (
rød
). Både i (A) og (B), ble kjernene farget med DAPI (
blå
) og eske områder (hvite kvadrat) av de komprimerte Z-stack-bilder (venstre paneler) ble forstørret og vist i høyre panel i enkelt konfokal seksjons fly (tykkelse 0,38 mikrometer) sikret fusjonerte bildene viste co-lokaliseringer (
gul
) fra celleoverflaten GRP78 og P85 oppdaget på flere tilsvarende områder (
hvite piler
) . Skala barer representerer to mikrometer. (C) Ordning for påvisning av interaksjonen mellom celleoverflate F-GRP78 og P85. Biotinylerte celleoverflateproteiner ble renset ved hjelp av monomert avidin-kolonne, fulgt av immunutfelling (IP) og Western blot. (D) 293T-celler ble transfektert med F-GRP78 ekspresjonsvektor. Celleoverflateproteinene eluert fra den monomere avidin-kolonne (input) som beskrevet i (C) ble underkastet immunoutfelling (IP) med enten anti-FLAG-antistoff eller isotype IgG tjener som negativ kontroll. F-GRP78, P85 og p110α nivåer i immunopresipitert komplekset ble målt ved Western blot med anti-FLAG, anti-P85 og anti-p110α antistoffer.
For å utvide disse observasjonene vi transfekterte HeLa-celler med ekspresjonsvektor for FLAG-GRP78 (F-GRP78). Bruken av GRP78 merket med FLAG-epitopen tillatt bruk av den meget spesifikke anti-FLAG-antistoff for å påvise celleoverflate GRP78-ekspresjon i ikke-permeabiliserte celler. HeLa-celler ble anvendt, siden de holder seg sterkere til mikroskopiske objektglass, som er kritisk for flere trinn av eksperimentelle manipulasjoner av de transfekterte cellene. Våre resultater viste tallrike ko-lokalisering av celleoverflate-F-GRP78 med P85 (figur 3B).
neste, for å bestemme hvorvidt biokjemisk sGRP78 dannede kompleks med PI3K, 293T-celler ble transfektert med F-GRP78. 293T-celler ble anvendt på grunn av deres høye transfeksjonseffektivitet. Anvendelse av F-GRP78 tillot oss å immunoutfelle GRP78 med høy spesifisitet og affinitet. Det eksperimentelle oppsettet er vist i figur 3C. Etter transfeksjon ble cellene biotinylert og cellelysatene ble inkubert med avidin monomere agarosekuler som tillater isolering av biotinylerte celleoverflateproteiner med mild eluering tilstand på grunn av sin svake affinitet til biotinylert protein. De eluerte celleoverflateproteiner ble immunopresipitert med anti-FLAG-antistoff eller isotype IgG-kontroll. Immunopresipitatene ble deretter underkastet Western blot og probet med antistoffer mot P85 og p110α, så vel som anti-FLAG-antistoff. Det ble observert at celleoverflate-F-GRP78 dannede kompleks med de regulatoriske (P85) og katalytisk (p110α) subenheter av PI3K, i motsetning til IgG-kontroll som viste ingen binding (figur 3D). Sammen er disse resultatene tyder på at sGRP78 direkte eller indirekte kommuniserer med P85 og p110α.
Celleoverflate- GRP78 overekspresjon stimulerer PI (3,4,5) P3 produksjon og samlokalisering
Komplekset dannelse mellom sGRP78 og PI3K antyder at det kan føre til modulering av PI3K-aktivitet. Ved aktivering PI3K lokaliserer til celleoverflaten og fosforylerer PI (4,5) P2 fører til PI (3,4,5) P3 (referert til nedenfor som PIP3) produksjon.
