Abstract
Tip60 (KAT5) er en histon acetyltransferase (HAT enzym) som er involvert i flere cellulære prosesser inkludert transkripsjonsregulering, DNA-skade reparasjon og cellesignalisering. I prostata cancer, aggressive tilfeller over-uttrykke Tip60 som fungerer som en androgen reseptor ko-aktivator ved direkte acetylering av lysinrester i KLKK motiv av reseptoren hengselregionen. Hensikten med denne studien var å identifisere og karakterisere en Tip60 Acetylase inhibitor. Høy throughput screening viste en isothiazole som hemmet både Tip60 og p300 HAT aktivitet. Dette stoffet (opprinnelig identifisert som 4-metyl-5-bromoisothiazole) og andre isothiazoles ble syntetisert og analysert mot Tip60. Selv om en autentisk prøve av 4-metyl-5-bromoisothiazole var inaktive mot Tip60, i en
in vitro
HAT-analyse, 1,2-bis (isotiazol-5-yl) disulfane (NU9056) ble identifisert som en relativt potent inhibitor (IC
50 2 mm). Cellulær aktivitet ble bekreftet ved analyse av acetylering av histon og ikke-histonproteinene i en prostatakreft-cellelinje-modell. NU9056 behandling inhiberte cellulær proliferasjon i et panel av prostatacancercellelinjer (50% veksthemning, 8-27 uM) og induserte apoptose via aktivering av kaspase 3 og caspase 9 i en treringstrinnet og tidsavhengig måte. Også, redusert androgen reseptor, prostata spesifikt antigen, p53 og p21 protein-nivåer ble påvist i respons til behandling med NU9056. Videre forbehandling med NU9056 inhiberte både ATM-fosforylering og Tip60 stabilisering som respons på ioniserende stråling. Basert på aktiviteten av NU9056 og spesifisiteten av forbindelsen mot Tip60 i forhold til andre HAT-enzymer, har disse kjemisk biologiske studier identifisert Tip60 som et potensielt terapeutisk mål for behandlingen av prostatakreft
relasjon:. Coffey K, Blackburn TJ, Cook S, Golding BT, Griffin RJ, Hardcastle IR, et al. (2012) Karakterisering av en Tip60 spesifikk hemmer, NU9056, i prostatakreft. PLoS ONE 7 (10): e45539. doi: 10,1371 /journal.pone.0045539
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østerrike
mottatt: 18 april 2012; Akseptert: 21. august 2012; Publisert: 08.10.2012
Copyright: © Coffey et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funding var levert av Cancer Research UK (CRUK) (C240 /A7409, C29821 /A10348) (www.cancerresearchuk.org) og Medical Research Council (MRC) MELDING (G0100100 /64424) (www.mrc.ac.uk). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. KH ble ansatt i OSI Pharmaceuticals, Inc. Forbindelser omtalt i denne artikkelen er ikke patentert i utvikling eller som markedsføres av dette selskapet. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Histone acetylering og deacetylering er viktige hendelser i reguleringen av kromatinstruktur. Histone acetyltransferases (HATS) katalyserer tillegg av acetylgrupper til ε-amino endestasjonen lysinresidier innen histoner. Acetylering resulterer i en åpen struktur kromatin ved å fjerne positive ladninger fra histoner, og dermed indusere protein konformasjonsendringer, som tillater transkripsjonen maskineri for å få tilgang til DNA og fremme transkripsjonen aktivitet. Histone deacetylases (HDAC) motsette seg denne prosessen ved å fremme en lukket kromatinstruktur, som er transcriptionally trykt. Videre kan histone acetylering merkene fungere som tilkoblingssider for andre proteiner for å tolke «histone kode»; for eksempel, ble det tredelte motiv inneholdende 24 (TRIM24) har nylig beskrevet som en «leser» protein, som gjenkjenner både umodifisert histon H3 lysin 4 og histon H3 acetylert ved lysin 23 på samme histon halen som resulterer i økt genekspresjon [1] . I tillegg er ikke-histonproteinene så som p53 [2], [3], ataxia telangiectasia mutated (ATM) [4] og androgenreseptoren (AR) [5], [6] kan også bli acetylert resulterer i endrede proteinaktivitet. Derfor kan proteiner acetylering og deacetylering ha betydelige effekter på celle-funksjon, og for celler for å opprettholde normal vekst og differensiering er det viktig at disse to funksjoner opprettholde likevekt. Til støtte for dette konseptet, har HDAC-inhibitorer blitt funnet å ha bred som strekker seg cellulære effekter og klinisk aktivitet in leukemi [7], [8], med Vorinostat (Saha) er godkjent for klinisk bruk i denne sykdommen. Modulering av histone acetylering har klart terapeutisk potensiale.
Tip60, nylig omdøpt KAT5, er medlem av Myst familien av HAT enzymer først identifisert i 1996 [9]. Siden da har mange cellefunksjoner er blitt funnet å bruke dette proteinet. Tap av Tip60 resulterer i nedsatt DNA-reparasjon, da dette HAT er aktivert i respons til ioniserende stråling (IR), forårsaker acetylering av histoner og aktivering av p53 og minibank [4]. Hemming av Tip60 bør derfor bevisst celler til DNA-skadelige stoffer som brukes som kreftbehandling. Tip60 også funksjoner i NF-kB reaksjonsvei, via interaksjon med B-celle CLL /lymfom 3 (BCL-3) [10] og cAMP-avhengig signalisering [11]. Videre kan Tip60 fungere som en ko-aktivator for et antall av steroid-hormonreseptorer, inkludert AR, som er involvert i utvikling og progresjon av prostatacancer (CAP). Studier har vist at AR kan acetyleres ved en rekke HAT enzymer, inkludert p300, p300 /CBP-assosiert faktor (PCAF) og Tip60, for å øke transkripsjonen aktivitet [6], [12]. AR acetylering er tenkt å regulere rekruttering av co-aktivatorer til transkripsjonsmaskineriet androgen responsive gener [13]. I tillegg er Tip60 funksjonelt oppregulert i kliniske Cap prøver og uttrykk korrelerer med sykdomsprogresjon [14]. I motsetning til en rapport antydet at Tip60 er nødvendig for å uttrykke metastase suppressor KAI1 i Cap cellelinjer, noe som tyder på at Tip60 er en tumor suppressor [15]. Tilsvarende vil en Tip60 genet knockout studie foreslått Tip60 som haplogruppene-utilstrekkelig tumor suppressor på forhånds og tidlig-tumor stadier av lymfom, bryst og hode og nakke kreft [16]. Men studier på kliniske prostata prøver motsi dette forslaget og støtte Tip60 som et onkogen i Cap [13], [17]. Dermed rettet mot Acetylase aktiviteten Tip60 kan være et nyttig terapeutisk strategi i Cap.
Et lite antall HAT-hemmere er rapportert. Kobling av en histon H3 peptid til CoA å danne en bisubstrate inhibitor av HAT-aktivitet har blitt beskrevet; Imidlertid har forbindelsen dårlig cellemembranen permeabilitet [18]. De naturlige produktene anacardic syre og garcinol er HAT-hemmere som er celle gjennomtrengelig; de sensibilisere celler overfor IR, som kan være nyttig som en kombinasjonsterapi for behandling av kreft. Andre hemmere av HAT-funksjonen inkluderer alfa-metylen butyrolactones [19], benzyliden acetones [20] og alkyliden malonater [21]. Mer nylig, isotiazoloner, som kovalent binder til det aktive sete HAT tiol, har blitt beskrevet som en effektiv utgangspunkt for molekylær modellering-baserte metoder for å generere mer potente og spesifikke inhibitorer [22] – [24]. I denne studien benyttet vi en høy gjennomstrømming screening tilnærming for å identifisere selektive hemmere av Tip60. Basert på ledelsen molekylet, strukturelt beslektede forbindelser ble generert og testet for HAT hemming og Tip60 spesifisitet for å identifisere en molekylær verktøy for studier i cellelinje modeller av hetten.
Resultater
høy gjennomstrømning Screen (HTS) og Hit Validering
en høy throughput screening kampanje for Tip60 hemmere ble utført ved OSI Pharmaceuticals Ltd. Analyser basert på ALPHA ™ skjerm og DELFIA ™ formater den ble utviklet og brukt til å undersøke et strukturelt mangfoldig sammensatt samling (~80,000 medlemmer). Et antall treff ble identifisert fra den primære ALPHA ™ skjerm. Men de fleste av disse ikke viste betydelig aktivitet i annenhånds skjermen. En enkelt forbindelse OXA-10 (opprinnelig identifisert som 4-metyl-5-bromoisothiazole, 1), ble identifisert som et treff i begge skjermene, og aktiviteten ble replikert med repurchased materiale. Kjøpt tilbake OXA-10 viste aktivitet mot Tip60 (IC
50 1,1 mikrometer – figur 1) og P300 (IC
50 2,7 mm) (tabell 1), men ikke andre histone acetyltransferases, f.eks PCAF og GCN5 (IC
50 100 mm). LC-MS-analyse av det kjøpt tilbake prøve av OXA-10 indikerte tilstedeværelse av ~80% 4-metyl-5-bromoisothiazole 1, men viste at den inneholdt ~ 20% av en ukjent urenhet. For å validere en som aktiv hemmer av Tip60 i OXA-10, ble syntesen av en foretatt, sammen med analoger, for å utvikle strukturaktivitetsforhold. Detaljer om kjemisk syntese (figur 2) kan bli funnet i Supplementary Information.
For å vurdere aktiviteten mot Tip60 HAT,
in vitro
HAT analyser ved hjelp av
3H acetyl-CoA ble gjennomført ut ved hjelp av histoner som underlag. Analyser ble utført i fire eksemplarer og gjentatt to ganger. For forbindelser som produserer 50% inhibering ved 100 uM, IC
50-verdier ble beregnet. Individuelle IC
50 verdier presenteres. For andre forbindelser til% hemming på 100 mikrometer blir presentert.
Spesifisitet av NU9056 for Tip60 acetyltransferase
NU9056 (7), samt forbindelser 5 og 6, ble testet for
in vitro
aktivitet mot et panel av rekombinante HAT enzymer, inkludert P300, PCAF og GCN5, for å bestemme om de viser større spesifisitet overfor Tip60 enn forbindelse 1. ICR CCT129182, som har vist seg å ha hemmende aktivitet mot P300 og PCAF, ble også testet i [24]. En rekke forbindelser ble funnet å inhibere aktiviteten av Tip60 ved lave mikromolare konsentrasjoner (figur 1; Opplysning Figur S1). Imidlertid spesifisitet overfor Tip60 i forhold til andre testede HAT enzymer ble funnet å være størst med forbindelse 7 (NU9056) som vist i tabell 1 (16.5-, 29- og 50 gangers selektivitet for for Tip60 spissen PCAF, p300 og GCN5 hhv ).
NU9056 hemmer protein acetvlering i Prostate Cancer Cell Lines
Tip60 acetylates histonproteinene, spesielt histoner H4 og H2A, i en nukleosomale sammenheng [25]. Videre
in vitro
undersøkelser har vist at Tip60 kan også acetylere kjerne histoner H2A (Lys 5), H3 (Lys 14) og H4 (Lys 5, Lys 8, Lys 12 og Lys 16) [26], [27]. For å teste om NU9056 kunne hemme acetylering av endogene proteiner målrettet av Tip60 ble LNCaP celler brukt som disse er en representativ modell av androgen avhengige Cap. Acetylering status av histon H4 ved lysin 8 (H4K8) og 16 (H4K16) og histon H3 lysin 14 (H3K14) ble undersøkt i disse cellene ved hjelp av Western blotting. I tillegg ble nivået av Tip60 vurdert ved behandling med NU9056 og kontrollforbindelsen, 1,2-bis (4-pyridyl) etan (figur 3A) som viser at Tip60 nivåer selv er upåvirket. Som basale nivåene av disse acetylert histon merkene er ganske lav, ble det HDAC-inhibitoren trichostatin A (TSA) innført for å fjerne innvirkningen av HDAC aktivitet på acetylering i det cellulære assay. I nærvær av TSA alene, ble øket acetylering ved H4K8, H4K16 og H3K14 (figur 3B), i samsvar med tidligere rapporter [28] – [30]. Økende konsentrasjoner av NU9056 resultert i reduserte nivåer av acetylert histon H4K16, H3K14 og H4K8, mål for Tip60-mediert acetylering (Figur 3C). Videre er kontrollforbindelse, 1,2-bis (4-pyridyl) etan, ikke påvirke noen av de histonmodifikasjonene studert
Del 1 -. Syntese av forbindelser 4-7. Del 2 – Syntese av forbindelser 1 og 11.
LNCaP-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av NU9056 eller kontrollforbindelse, 1,2-bis (4-pyridyl) -etan i 24 timer. (A) Nivåer av Tip60 ble vurdert ved Western blotting. (B) LNCaP-celler ble behandlet med 2 uM TSA i 6 timer, og nivåer av histon H4 acetylert-lysin 16, ble histon H4 acetylert-lysin 8 og histon H3 acetylert lysin 14 vurdert ved Western blotting. LNCaP-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av NU9056 eller kontrollforbindelse i 2 timer, deretter behandlet med HDAC-inhibitoren TSA (2 uM) i ytterligere 4 timer. (C) Nivåer av histon H4 acetylert-lysin 16, histon H4 acetylert-lysin 8 og histon H3 acetylert lysin 14 ble vurdert ved Western blotting. (D) LNCaP-celler ble behandlet med 24 uM NU9056 over 4 dager, og nivåene av acetylert tubulin ble vurdert ved Western blotting. (E) LNCaP-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av NU9056 eller kontrollforbindelse i 2 timer, deretter behandlet med HDAC-inhibitoren TSA (2 uM) i ytterligere 4 timer. Nivåer av acetylert tubulin ble vurdert ved Western blotting. Alfa-tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. Representative blotter vises etter like eksperimenter.
For å definere ytterligere HAT hemmende aktivitet av NU9056, acetylering av den ikke-histone protein α-tubulin ble også undersøkt. Når LNCaP-celler ble inkubert med NU9056 (24 uM) i 24 timer ble det observert en reduksjon av tubulin acetylert. Men ved 72 timer acetylering hadde returnert til basale nivåer (Figur 3D). For å bekrefte at denne effekten skyldes NU9056 ble acetylert tubulin overvåket, men ingen endring i nivåene ble observert innen 6 timer i motsetning til endringer histonmodifikasjonene (Figur 3E). Densitometry for alle vestlige blotter er vist i Supplemental Figur S2.
NU9056 Hemmer cellevekst
Vi observerte at knockdown av Tip60 i LNCaP celler resulterte i en hemming av celleproliferasjon med ca 33% (p -verdi = 0,0019) (figur 4A). Effektiv knockdown av Tip60 mRNA i disse cellene ble bekreftet av real-time PCR (figur 4B, 70% knockdown, p-verdi = 0,0313) og Western blotting (Figur 4C). Hvis NU9056 handlingen ble mediert via inhibering av Tip60 enzymatisk aktivitet, vil hemming av celleproliferasjon ved NU9056 forventes. Faktisk, proliferasjon ble funnet å være redusert i nærvær av NU9056 i alle Cap-cellelinjene som ble testet som målt ved hjelp av sulforhodamin B (SRB) analyse (tabell 2, figur Supplerende S3, S4). Interessant LNCaP celler, som er androgen responsive og uttrykker et mutert, men funksjonelt AR samt villtype p53, og bein metastase avledet PC3 celler som ikke uttrykker et funksjonelt AR og er p53 null, vises tilsvarende GI
50 konsentrasjoner (24 uM ± 2 og 27 ± 2 uM for LNCaP og PC3-celler, henholdsvis). Men LNCaP-AI celler, en sub-linje av LNCaP celler serielt opprettholdt i steroid-utarmet media, som fortsatt uttrykker en funksjonell AR og er en modell av kastrering sikre korken post androgen ablasjon terapi, har en lavere GI
50 ( 24 uM ± 2 og 16 ± 1 uM for LNCaP og LNCaP-AI, henholdsvis). Andre cellelinje modeller av androgen uavhengighet, f.eks LNCaP-CdxR, som er serieopprettholdes i nærvær av bikalutamid og CWR22rv1, viser signifikant større følsomhet for NU9056 enn den paren LNCaP-cellelinjen (GI
50 verdier på 12 pM ± 2,5 og 7,5 uM ± 0,2 (p 0,05 og p 0,0005, henholdsvis)). Tip60 nivåene ble målt ved Western blotting i disse cellelinjer (figur 4D) for å avsløre at den mest sensitive cellelinjen, CWR22rv1, faktisk uttrykker den mest Tip60.
(A) For å bekrefte at inhibering av Tip60 kan redusere cellulær spredning 2,5 nM siRNA spesielt rettet mot Tip60 i LNCaP celler eller et ikke-tie kontroll ble brukt. Proliferasjon ble bestemt ved sulforhodamin B (SRB) analyser på tre styre spredning doblingstider etter siRNA transfeksjon i normal vekstmedier. For å bekrefte Tip60 knockdown, ble RNA samlet på 96 timer fra en parallell eksperiment og vurderes for Tip60 uttrykket med (B) real-time PCR og (C) Western blotting. (D) Tip60 nivåer i prostatacancercellelinjer ble vurdert ved Western blotting. (E) Prostatakreft celle overlevelse ble vurdert ved behandling av LNCaP-celler med 24 uM NU9056 i 24 timer og deretter belagt ved forskjellige celletettheter (3 x 10
3, 1,6 x 10
4 og 3 x 10
4 ) og tillate kolonier å danne mer enn to uker. Kolonier ble deretter fast med Carnoy er fiksativ og farget med krystallfiolett. Kolonier ble deretter talt og kolonidannende effektivitet beregnet. Gjennomsnittet av 3 forsøk ± standardavvik er vist på søylediagrammer. * P-verdi. 0,05
For å teste om NU9056 kan redusere overlevelsen av Cap celler, ble kolonidannende evne evaluert etter eksponering av LNCaP cellene til 24 mikrometer (GI
50) NU9056 i 24 timer. Kolonidannende evne ble redusert etter NU9056 eksponering, som var statistisk signifikant (p 0,05). (Figur 4E)
NU9056 behandling Årsaker apoptose via caspaseaktivering
Effektene av NU9056 på cellesyklus fase fordeling og apoptose-induksjon ble også testet i LNCaP-celler. For å vurdere apoptotiske effekter, ble FACS analyse for aktivert caspase 3 og aktivert caspase 9 benyttes. NU9056 resulterte i både kaspase 3 og caspase 9 aktivering i en tids- og konsentrasjonsavhengig måte (figur 5A, supplerende fig S5 og S6). Nivåene av apoptose ble også sammenlignet med andre HAT-hemmere som viser at NU9056, med sin større spesifisitet for Tip60 kan indusere apoptose på tilsvarende nivå til de mer promiskuøse hemmere (Supplerende Figur S7). Analyse av sub-populasjonen G1 i LNCaP-celler (Figur 5B) bekreftet at induksjon av apoptose i en tids- og konsentrasjonsavhengig måte for NU9056. Men under ingen eksponeringsforhold til NU9056 gjorde vi observere noen G1 eller G2M cellesyklus arrest i LNCaP celler; bare opphopning i sub-G1 fase ble observert (figur 5C, D). For å avgjøre om kastrat resistente cellelinjer er mer følsomme for NU9056 som foreslått av GI
50 besluttsomhet en sammenligning av LNCaP celler med LNCaP-AI og LNCaP-CdxR celler etter behandling med NU9056 i 24 timer ble utført. Faktisk, LNCaP-AI og LNCaP-CdxR cellene ser ut til å være mer følsomme for NU9056 enn LNCaP celler som vist ved en større befolkning å være i under G1 fasen av cellesyklus (figur 5E). Ved hjelp av LNCaP GI
75 dose (36 pM) en betydelig økning i under G1 ble sett i LNCaP-AI-celler (p = 0,036) sammenlignet med LNCaP-celler. Lignende tendenser ble sett for LNCaP-CdxR selv om dette ikke var statistisk signifikant (p = 0,1679).
(A) LNCaP celler ble sådd ut på 6 brønners plater i 24 timer, deretter økende doser av NU9056 ble søkt om ( i) 24 timer, (ii) 96 timer, eller (iii) GI
25 (17 pM) eller (iv) GI
50 (24 uM) ble tilført i løpet av 4 dager. Alle celler ble samlet opp og festes med cytofix /cytoperm (BD) og deretter kaspase 3 og caspase 9 undersøkelseskit (BD) ble brukt for å vurdere deres aktivitet ved strømningscytometri. Fluorescens ble påvist på FL-en kanal i FACSCAN. (B) Analyse av SubG1 populasjonen ble utført på de samme celler ved anvendelse av propidiumjodid å farge cellulære DNA. LNCaP-celler ble sådd ut på 6-brønners plater i 24 timer, deretter NU9056 ble påført for (C) ett eller (D) 4 dager. (E) LNCaP, LNCaP-AI og LNCaP-CdxR celler ble sådd ut på 6-brønners plater og NU9056 ble påtrykt i 24 timer. Analyse av SubG1 ble utført som beskrevet ovenfor. Alle celler ble samlet og festes med cytofix /cytoperm (BD) og deretter cellesyklusanalyse ble utført ved hjelp propidiumjodid- å farge cellulær DNA. All FACS data ble analysert ved hjelp WinMDI. Alle forsøkene ble utført 3 ganger, og middelverdien ± standardfeil er vist. * P-verdi 0,05; ** P-verdi 0,005; *** P-verdi. 0,001
NU9056 Behandling Reduserer PSA Expression i LNCaP celler
Tip60 har blitt rapportert som en AR co-aktivator [31], som spiller en rolle i Cap utvikling. For å bekrefte rollen Tip60 i PSA uttrykk, ble siRNA brukes til knockdown Tip60 nivåer i LNCaP celler og PSA mRNA nivåer overvåkes i respons til androgen (dihydrotestosteron (DHT)) stimulering. I nærvær av et ikke-tie siRNA PSA ble indusert ved omtrent 10 ganger i respons til DHT (figur 6A). Men etter knockdown av Tip60 (figur 6B) bare en 2,5 ganger økning ble observert (Figur 6A). For å undersøke effektene av NU9056 for AR funksjon, ble LNCaP-celler ble behandlet med 24 uM NU9056 i løpet av en 48 timers periode, hvoretter nivået av AR og PSA-protein ble vurdert ved Western blotting. I tillegg har vi undersøkt nivåene av p53 og dets mål-genet p21, som p53 er også et mål for Tip60. Vi har oppdaget at nivåene av både AR og p53 ble redusert etter 24 timer ved 2- og 3 ganger henholdsvis, og at produktene av målgener, P21 og PSA, ble også redusert med 3- og to ganger med henholdsvis (figur 6C, D). Dette resultatet tyder på at faktisk Tip60 er involvert i AR og p53 signal i denne cellelinjen og at NU9056 kan, ved å modulere Tip60 acetylering aktivitet, påvirker disse viktige nedstrøms mål.
For å bekrefte effekten av Tip60 på androgen reseptor aktivitet vi brukte 2,5 nM siRNA spesielt rettet mot Tip60 i LNCaP celler, eller ikke-tie kontroll. Knockdown ble oppnådd etter 48 timer i steroid-utarmet medium, hvoretter 10 nM DHT ble anvendt for å indusere androgen reseptor aktivitet og PSA uttrykk. RNA ble samlet opp etter 24 timer DHT stimulering, revers transkripsjon og real-time PCR utført. Uttrykk av (A) PSA og (B) Tip60 var normalisert forhold til HPRT1 uttrykk. (C) LNCaP-celler ble behandlet med 24 uM NU9056 over 48 timer og proteinprøver ble oppsamlet i SDS prøvebuffer. Protein analyse ble utført av SDS PAGE og Western blotting for p53, p21, AR, Ptil og alfa tubulin. (D) Densitometry ble utført på Western blot. Alle forsøkene ble utført to ganger og middelverdien ± standardavvik er vist.
NU9056 Hemmer DNA Damage Response i prostata kreft celler
Tip60 er kjent for å spille en rolle i DNA-skade respons [25]. Ved eksponering for IR Tip60 er aktivert, noe som resulterer i acetylering av histonproteinene og aktivering av ATM og p53 [4]. For å teste hvorvidt NU9056 kunne inhibere den DNA-skade responsen via hemming av Tip60 Acetylase-aktivitet, ble aktiveringen av ATM vurdert ved Western blotting som respons på IR etter forbehandling med NU9056. Som svar på IR, ble pATM nivåene økt dramatisk i løpet av 10 minutter. Over tid pATM nivåer gradvis falt. Imidlertid, i nærvær av NU9056 denne reduksjonen var mye raskere (figur 7A). Videre, i respons på IR nivåer av Tip60 protein ble stabilisert som resulterer i akkumulering. Celler som var forbehandlet med NU9056 viste ikke Tip60 akkumulering (figur 7B), noe som kan forklare høyere omsetning av pATM nivåer.
For å demonstrere hemming av Tip60 aktivitet ved NU9056, nivåer av pATM, Tip60 og γH2AX ble undersøkt som respons på IR i nærvær og fravær av legemiddel. LNCaP-celler ble behandlet med 24 uM NU9056 eller bærerkontroll i 1 time før 0,5 Gy IR. Protein lysater ble oppsamlet ved forskjellige tidspunkter etter IR- og analysert ved Western blotting for (A) pATM og (B) Tip60 nivåer. (C) 293T, (D) LNCaP og (E) LNCaP-CdxR-celler ble forbehandlet med NU9056 (24 uM) eller bærerkontroll i 1 time før 2 Gy IR. Cellene ble fiksert og farget for γH2AX foci over tid og brennpunkter bestemmes av immunfluorescens for 293T celler og flowcytometri for LNCaP og LNCaP-CdxR. Forsøkene ble gjentatt 3 ganger med representative bildene som vises og tallfestede data vist som middel% celler farget for γH2AX ± standardavvik.
Tip60 Acetylase aktivitet er nødvendig for å lette ubiquitin ligase UBC13-mediert ubiquitinering og påfølgende destruksjon av γH2AX [32]. Derfor vil inhibering av Tip60 Acetylase-aktivitet hindre at nedregulering av den γH2AX signal. For å teste dette, ble 293T celler behandlet med NU9056 (24 mm) eller kjøretøy kontroll for en time før IR (2 Gy) eksponering. Cellene ble deretter fiksert og γH2AX foci visualisert ved immunfluorescens. Sammenlignet med kjøretøy kontroll, ble γH2AX formasjon fortsatt klart beriket så mye som 24 timer etter at IR stimulering (figur 7C) tyder på at reparasjon av DNA-skader er svekket. Dette er også sett i LNCaP og LNCaP-CdxR celler som ble vurdert ved flowcytometri for γH2AX. I LNCaP-celler, antallet foki var betydelig høyere etter 24 timers utvinning i nærvær av inhibitor (p = 0,0277) (figur 7D), mens i LNCaP-CdxR celler en signifikant forskjell ses etter 4 timers gjenvinning (p = 0,0324) ( Figur 7E). En økning i γH2AX er også sett på 24 timer utvinning, men ble funnet ikke å være statistisk signifikant.
Diskusjoner
Protein acetylering, som en reguleringsmekanisme, viser seg å være viktig i mange cellulære trasé , ikke bare gen-transkripsjon via histone modifikasjon. Begge sett med enzymer ansvarlig for regulering acetylering, hatter og HDACs, er de-regulert i sykdomstilstander. Derfor rettet mot begge typer enzymer med små molekyl hemmere som et terapeutisk strategi er gyldig. Hemmere mot HDACs har vist seg å være vellykket i kliniske studier; men HAT-hemmere er på et tidligere stadium i utviklingen. Nylig har det vært noen antatte HAT-hemmere er beskrevet, selv om ingen synes i stand til å skille sterkt mellom de ulike HAT familiemedlemmer og ingen har blitt spesielt utviklet mot Tip60, en HAT enzym som ser ut til å spille en spesiell rolle i Cap utvikling og progresjon. For å løse dette punktet har vi identifisert en HAT-hemmer, ved hjelp av HTS og målrettet sammensatte syntese, som hemmer Tip60 fremfor andre HAT enzymer.
Kravet til fullt ut å validere HTS treffer gjennom resynthesis er allment akseptert som materiale i kommersielle sammensatte samlinger kan inneholde uidentifiserte urenheter, eller kan brytes ned på lagring, typisk som fryste DMSO løsninger, noe som gir falske positiver. I dette tilfelle, et litteratur syntese for en var ikke tilgjengelig, og en rute måtte utvikles. Den første ordningen forsøkt (del 1) ga ikke målet forbindelser, 1, eller sin desmetyl analog; men ble isocyanato og disulfid analoger 4-7 forberedt. Forbindelse 1 ble utarbeidet med suksess via en alternativ rute (del 2).
Den biologiske aktivitet observert for disulfider 5 og 7 (NU9056), bedt oss om å undersøke aktiviteten til andre enkle aromatiske og hetero disulfider. Interessant nok har disse forbindelser var blottet for Tip60 inhiberende aktivitet, noe som indikerer at Tip60 inhibering er ikke ene og alene på grunn av tilstedeværelsen av den disulfidgruppe. Tilsvarende bromtiofen analog isotiazol 1 var inaktiv.
isotiazoloner er tidligere blitt rapportert å målrette Acetylase aktiviteten til mange enzymer HAT inkludert P300 og PCAF [24]. Imidlertid har en spesifikk inhibitor for Tip60 ikke blitt beskrevet. Det er mange fordeler å hente ved å målrette dette proteinet på grunn av de ulike cellulære prosesser hvor Tip60 er innblandet. For eksempel, ikke bare gjør dette proteinet funksjon for å øke transkripsjonen aktivitet av AR og p53, men det kan også spille en rolle i DNA-reparasjon, hvor det kan acetylere histonproteinene for å markere steder av DNA-skade og aktivere ATM [25].
i denne rapporten har vi utarbeidet en isotiazolon-forbindelsen, NU9056 (7) som er rettet mot Tip60 HAT aktivitet selektivt resulterer i redusert acetylering av histonproteinene
in vitro
. Tip60 har blitt funnet å være avvikende uttrykt i en rekke kreftformer, inkludert prostata og hudkreft. Spesielt kan Tip60 acetylere AR, en nøkkel transkripsjonsfaktor i dekselet, for å fremme økt AR transkripsjonen aktivitet [6] og Tip60 ekspresjon er også blitt vist å korrelere med sykdomsprogresjon [14]. Dermed rettet mot Acetylase aktivitet av dette proteinet kan være gunstig for pasienter som lider med kastrering sikret lokk som ikke lenger reagerer på androgen deprivasjon terapi. Derfor, for å teste evnen til å inhibere NU9056 HAT-aktivitet i celler som vi har brukt med netting cellelinje modeller. I disse cellelinjene har vi demonstrert den hemmende effekten av NU9056 mot HAT aktiviteten av Tip60. Videre acetylering av ikke-histonproteinene slike som tubulin ble funnet å bli redusert i disse cellelinjene som reaksjon på NU9056. Interessant, nivåer av AR og p53 gått noe etter NU9056 behandling i LNCaP-celler som støtter tidligere rapporter at acetylering forbedrer stabiliteten av disse proteinene [33], [34]. På grunn av viktigheten av AR og p53, og deres nærvær i LNCaP-celler, kan dette forklare hvorfor både apoptose økes og spredning reduseres som reaksjon på NU9056 i en konsentrasjon og tidsavhengig måte. Likevel er det forskjeller i følsomhet mellom ulike Cap cellelinjer som ikke kan forklares utelukkende av AR eller p53 status. Denne sistnevnte observasjon tyder på at aktiviteten av Tip60 overfor AR og p53 er ikke en medvirkende faktor til den cellulære respons på medikamentet. Men i respons til DNA-skade IR, som aktiverer den Acetylase-aktivitet av Tip60, finner vi at NU9056 hemmer utviklingen av pATM signal og hindrer stabilisering av Tip60 seg selv, eventuelt via hemming av auto-acetylering. Dessuten svekker NU9056 celleoverlevelse som respons på IR og hemmer fjerningen av γH2AX merket potensielt hindrer DNA-reparasjon.
Interessant cellelinje modeller for kastrering motstand synes å være mer følsomme for NU9056. Økt nivå og stabilitet av Tip60 i androgen-insensitive celler, på grunn av kronisk vekst i androgen ablated forhold, har blitt rapportert i andre lignende cellelinje modeller [35], menneskelige cap xenografter og biopsiprøver fra kastrat resistente pasienter [14]. Det er mulig at androgen-insensitive celler er mer avhengig Tip60 nivåer for deres vekst, sammenlignet med sine androgen responsive kolleger, noe som resulterer i større følsomhet for NU9056. Faktisk, innledende studier viser at nivåene av Tip60 protein varierer mellom cellelinjene som ble testet, med flere NU9056 sensitive cellelinjer, CWR22rv1 og LNCaP-CdxR som viser de høyeste nivåene av Tip60. Forskjeller i enzymatisk aktivitet av Tip60 mellom cellelinjer kan også være viktig. Denne hypotesen må testes fullstendig i fremtidige studier i et antall cellelinjer og
in vivo
modellsystemer for å bestemme entydig mekanismen av følsomhet. Med hensyn til hvorvidt NU9056 er generelt toksisk for cellene; Vi tror at dette er lite sannsynlig for det meste. For det første var det ingen endring i γH2AX farving når NU9056 ble påført på celler som antyder ingen induksjon av DNA-skade. Dernest differensielle effekter ble sett avhengig av cellelinjen som tyder generelt toksisitet var ikke årsaken til skadelige cellulære effekter.
