Abstract
JAG1 er et hakk ligand som spiller en viktig rolle i flere signalveier. Men funksjonaliteten JAG1 i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) har ikke blitt grundig undersøkt. Ved sammenligning av genet transcripted RNA profiler i cellelinjen paret med differensial invasjon evne, identifiserte vi JAG1 som en potensiell metastaseforsterker i lungekreft. Ektopisk uttrykk for JAG1 på lungekreft celler forbedret celle migrasjon og invasjon samt metastaser
in vitro Hotell og
in vivo
. Omvendt, knockdown av JAG1 med siRNA i sterkt invasive kreftceller førte til reduksjon av migrering og invasjon. I klinisk analyse, JAG1 mRNA uttrykk var høyere i tumorer enn i tilstøtende normalt vev i 14 av 20 pasienter med plateepitelkarsinom (SCC). SCC pasienter med høyere JAG1 transkripsjon hadde dårlig total overlevelse enn de med lav transcripted JAG1. Microarray analyse indikerte at håndheves JAG1 transkripsjon var assosiert med en forhøyet HSPA2 RNA transkripsjon, som spilte en rolle i å fremme kreft celle migrasjon og invasjon. Som konklusjon, er dette den første studien som viste at JAG1 kan fungere som en potensiell prognostisk markør og JAG1 /HSPA2 akse formidler lungekreft malignitet i det minste delvis
Citation. Chang WH, Ho BC, Hsiao YJ, Chen JS, Yeh CH, Chen HY, et al. (2016) JAG1 er assosiert med dårlig overlevelse gjennom Induksjon metastaser i lungekreft. PLoS ONE 11 (3): e0150355. doi: 10,1371 /journal.pone.0150355
Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, UNITED STATES
mottatt: 28 september 2015; Godkjent: 12 februar 2016; Publisert: 01.03.2016
Copyright: © 2016 Chang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den microarray CEL filer, normaliserte data og eksperimentell informasjon har blitt deponert i Gene Expression Omnibus og er tilgjengelig ved tiltredelse antall GSE14995
Finansiering:. Denne studien ble støttet av tilskudd fra departementet for vitenskap og teknologi, Taiwan, ROC (NSC98-2314-B-002-038-MY2, NSC101-2911-I-002-303, 103-2320-B-002 -052, 104-2320-B-002 -030). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [1]. Metastase er en viktig determinant som bidrar til progresjon av kreft og dødelighet, og celle-motilitet og invasjon er det første trinnet [2]. Vanligvis kan de fleste kreft tilskrives et økende antall genetiske endringer, som inkluderer onkogen aktivering eller tumor suppressor genet inaktivering [3, 4]. I våre tidligere studier, har vi etablert en rekke lungekreft cellelinjer med variert invasivitet [5] og vi identifisert og validert flere onkogener eller tumor dempere fra disse modellcellelinjer [6-8]. Oppdagelsen av disse endringene kan ha nytte kreftpasienter som kreft markører eller druggable mål [9]. Men de fleste alter er ennå ikke klarlagt helt.
JAG1 er en av de kanoniske ligander for Notch reseptorer. Etter at interaksjonen av ligander med reseptorer, Notch-reseptorer gjennomgå proteolytiske skillelinjer, og det intracellulære domenet Notch translocate inn i kjernen og skrur på ekspresjon av Notch målgener, noe som resulterer i celle-differensiering, proliferasjon, apoptose overlevelse og [10]. I human sykdom, har JAG1 blitt rapportert å være assosiert med Alagille syndrom [11, 12]. Videre er JAG1 sterkt uttrykt i medulloblastoma og tykktarmskreft [13, 14], og forårsaker dårligere total overlevelse ved brystkreft [15]. I ikke-småcellet lungekreft, har JAG1 blitt identifisert i en ni gen-signatur som muligens kan brukes som genetiske markører [16]. På tross av disse kliniske observasjoner, den molekylære bidrag og funksjonaliteten JAG1 i neoplastiske sykdommer gjenstår å bli etablert.
I denne studien har vi utforsket virkningen av JAG1 på lungekreft invasjon både
in vitro
og
in vivo
. Den microarray analyse ble brukt for å undersøke mulige nedstrøms signalisering av JAG1. Klinisk korrelasjonen av JAG1 transkripsjon og overlevelse av NSCLC ble også analysert.
Materialer og metoder
Cell kultur
CL1-0 og CL1-5 celler ble etablert og karakterisert som tidligere beskrevet [5]. A549 og H226 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC). Celler ble dyrket i RPMI-1640 medium med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2.
plasmid konstruksjon, transfeksjon og stabile kloner
JAG1 og HSPA2 uttrykker plasmider, pcDNA3.1-JAG1-V5 og pcDNA3.1-HSPA2-V5, ble konstruert ved å klone full-lengde human JAG1 eller HSPA2 cDNA med C-terminale V5 kode i pcDNA3.1 vektor (Life Technologies, Grand Island, NY), henholdsvis. To siRNA brukes til knockdown JAG1 mRNA ble kjøpt fra Silencer
® Velg siRNA (Cat. S1175 og s1176) (Life Technologies, Grand Island, New York). Alle transfeksjon eksperimenter ble utført med Lipofectamine
® 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens protokoll. CL1-0-celler ble transfektert med pcDNA3.1-JAG1 eller pcDNA3.1 tom vektor. Etter dyrking i medium inneholdende 1 mg /ml geneticin (G418) i 2-3 uker, slått sammen stabile kloner ble isolert. Kloner som uttrykker JAG1 cDNA kodende regionen ble opprettholdt i medium inneholdende 0,5 mg /ml geneticin og brukes for videre etterforskning.
Real-time kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble isolert ved TRIzol reagens (Life Technologies, Grand Island, NY), og 1 ug total RNA ble benyttet i cDNA-syntese med tilfeldige heksamerprimere ved hjelp av Superscript II revers transkriptase (Life Technologies, Grand Island, NY). 20 ng RNA eller 10 ng cDNA ble servert som mal for mRNA uttrykk deteksjon av sanntids kvantitativ PCR med SYBER Green. Den relative mRNA uttrykk nivå av målet genet ble bestemt som -ΔCT = – [CT
target-CT
TBP]. Målet /TBP-mRNA-forholdet ble beregnet som 2-ΔCT x K, der K er en konstant. Detaljene Primersekvensen for hvert mål gen real-time kvantitativ PCR ble oppført i S1 tabell.
Immunoblotting
Utarbeidelse av hel-cellelysater og Western blot analyse ble beskrevet som tidligere nevnt [7 , 8]. Kort sagt ble cellelysatene for immunoblot fremstilt i RIPA-buffer (1% NP-40, 0,5% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5) inneholdende 1X fullstendig protease inhibitor cocktail (Roche, Indianapolis, IN). Proteinprøvene ble separert ved 8% ~ 12% SDS-PAGE, og overført til en poly (vinyliden-difluorid) membran (Merck Millipore, Billerica, Massachusetts). Proteiner ble probet med spesifikke antistoffer, visualisert ved kjemiluminescens assay kit (Merck Millipore, Billerica, Massachusetts) og detekteres av FUJIFILM LAS-3000 ECL system (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Primære antistoffer anvendt for immunblot var som følger: anti-JAG1, anti-NICD-3 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-NICD-1, anti-NICD-2, anti-NICD-4 (GeneTex, Irvine , CA), anti-β-aktin (Sigma, St. Louis, MO), og anti-V5 (Invitrogen, Carlsbad, California). Den fluorescerende immunhistokjemi flekker i pasientenes svulst biopsi ble descripted i S1 tekst.
Migrasjon og invasjon analyser
In vitro
celle migrasjon og invasjon analysene ble utført som tidligere beskrevet [ ,,,0],17] med Transwell kamre (8 mikrometer porestørrelse, Costar, Cambridge, MA). I migrasjon assay, ble 1 x 10
5-celler sådd ut på toppen av polykarbonatfiltere og inkubert i 8 timer. Filtrene ble penslet med en bomullsdott, fast med metanol og deretter farget med Giemza løsning (Sigma, St. Louis, MO). For invasjonen analysen, ble filtrene dekket med Matrigel (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), og 1 x 10
5 celler ble sådd ut på Matrigel og inkubert i 18 timer. Cellene festet til den nedre overflate av filteret ble tellet under et lysmikroskop (forstørrelse x 100).
In vivo
metastase
dyrestudie ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité National Taiwan University med IACUC nr 20080239. for metastase analyse [7], 1 × 10
6 celler ble vasket og resuspendert i 100 ul PBS. Deretter ble cellene injisert i den laterale halevenen av seks uker gammelt SCID mus (levert av Forsøksdyr Center ved College of Medicine, National Taiwan University, Taipei, Taiwan). Etter implantasjon av 10 uker, ble lungene av mus fjernet og fiksert i 10% formalin og antallet lunge-mikrometa lesjoner ble tellet under et disseksjonsmikroskop. Embedded vev ble skiver og farget med hematoksylin-eosin for histologisk analyse.
Pasienter og prøver vev
Denne undersøkelsen ble utført etter godkjenning av Institutional Review Board of National Taiwan University Hospital med NTUH-REC Nei 200812077R protokollen. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter. Alle de svulst vevsprøver var behandling naiv fordi ingen av pasientene hadde fått neo-adjuvant kjemoterapi eller strålebehandling før operasjonen. Eksemplarer av lungekreft vevet og den ikke-tumor del av lungen erholdt ved kirurgi ble umiddelbart hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C inntil bruk. Den histologiske klassifikasjon av disse svulstene var basert på World Health Organization kriterier. Tumorstørrelse, lokal invasjon, og lymfeknutemetastase ble bestemt ved patologisk undersøkelse. Den endelige staging av sykdommen ble bestemt fra en kombinasjon av kirurgi og patologiske funn, i henhold til den aktuelle tumor-metastasering node-system for lungekreft staging. Oppfølgingsdata vil bli innhentet fra pasientenes medisinske diagrammer og rapportert fra våre svulst registret service. Tilbakefall tid ble beregnet fra datoen for operasjonen til datoen for påvisning av lokalt tilbakefall eller systemisk metastasering. Overlevelse ble beregnet fra datoen for operasjonen til dødsdato. Pasienter som dør av postoperative komplikasjoner i løpet av 30 dager etter kirurgi ble ekskludert fra overlevelsesanalyse, slik som å unngå skjevhet. Analysen av JAG1 mRNA uttrykk hos pasienter ble descripted i S1 tekst.
Microarray analyse
For cDNA microarray analyse, ble cDNA forberedelse og rekke hybridisering utført i henhold til Affymetrix Genechip Expression analyse Teknisk håndbok. I korthet, den 8 ug total RNA ble revers-transkribert i nærvær av en T7 primer (En-syklus cDNA syntese kit, Affymetrix, Santa Clara, CA). CDNA Produktet ble renset og transkribert
in vitro
med biotin-merket ribonukleotider (IVT Merking Kit, Affymetrix, Santa Clara, CA). En del av biotinylated RNA var fragmentert og hybridisert over natten til menneskelige genom U133 pluss 2,0 Genechip (Affymetrix, Santa Clara, CA). Den Genechip ble vasket og utviklet av forsterkningen farging protokollen levert av Affymetrix. Den Genechip ble skannet av Affymetrix Genechip Scanner 3000 7G, og bildene ble ekstrahert med Affymetrix Genechip kjøreprogramvare (GCOS) versjon 1.4. Alle hybridisering forsøkene ble utført i biologisk tre eksemplarer med cDNA prober fremstilt fra CL1-0 /JAG1 og CL1-0 /vektor kontroll. Data ble filtrert av to-fold endringer i henhold til FDR beskyttelse (
p
0,05) med Genespring GX 12,6 (sillicon Genetics, Redwood City, California). Microarray CEL filer, normaliserte data og eksperimentell informasjon har blitt deponert i Gene Expression Omnibus, og er tilgjengelig ved tiltredelse antall GSE14995. Detaljene eksperimentelle prosedyren og fulgte identifisering av JAG1 nedstrøms gener ble descripted i S1 Tekst
Statistisk analyse
Alle forsøkene er utført i tre eksemplarer og analysert av ANOVA (Excel, Microsoft, Taipei, Taiwan). .
p
verdi 0,05 er ansett som statistisk signifikant. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD.
Resultater
JAG1 er identifisert som en potensiell metastasefremmende genet
For å identifisere nye gener som er involvert i lungekreft metastaser, cDNA uttrykk mikromatriser ble brukt til å studere en lungekreft invasjon modell i våre tidligere studier [18]. Etter sammenligning av mRNA uttrykk profiler av de lave invasive celler (CL1-0) og svært invasive celler (CL1-5), fant vi mRNA uttrykk for JAG1 var 113 ganger høyere i CL1-5 enn i CL1-0 (Fig 1A, venstre). Utskriften uttrykk og protein uttrykk for JAG1 i både CL1-0 og CL1-5 cellelinjer var i samsvar med resultatene fra mikromatriseanalyse (fig 1A, midtre og høyre). For å verifisere om JAG1 spiller en avgjørende rolle i å regulere kreft metastaser, brukte vi overekspresjon og RNAi Silencing tilnærminger til å modulere JAG1 transkripsjonen uttrykk og utført Transwell migrasjon og invasjon analyser. Som vist i figur 1B og 1C, håndheves ekspresjonen av promo JAG1 evnen til cellemigrering og invasjon i lav invasive CL1-0 celler. I kontrast, knockdown av JAG1 hemmet både aktiviteter i svært invasive CL1-5 celler. Disse data antydet at JAG1 kan fungere som en roman kandidat involvert i akselerasjon av lungekreft metastaser.
(A) Identifikasjon av JAG1 i en invasjon modell av lungekreft celler. JAG1 er oppregulert i svært invasive lungekreftceller. Venstre ble JAG1 mRNA nivå vurderes av oligonukleotid microarray analyse. Middle, JAG1 mRNA nivå ble målt med real-time kvantitativ RT-PCR. Forsøkene ble utført in triplo, og data ble representert som gjennomsnitt ± SD. Høyre, ble JAG1 protein uttrykk evalueres av Western blot. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. (B) JAG1 fremmer cellemigrasjon og invasivitet
in vitro
. Venstre, JAG1 ble stabilt overexpressed i CL1-0 celler. JAG1 mRNA ble målt ved hjelp av sanntids-kvantitativ RT-PCR i tre eksemplarer. Resultatene ble representert som middelverdi ± SD. Middle og Høyre, ble migrasjon og invasjon evne CL1-0 celler med konstituerende JAG1 uttrykk og mock kontrollceller evaluert av migrasjon analysen og matrigel invasjon analysen. Data presentert som gjennomsnitt ± SD for tre eksperimenter. *:
p
0,05 i forhold til den mock-gruppen. (C) knockdown av JAG1 hemmer cellemigrasjon og invasivitet
in vitro
. Venstre, JAG1 mRNA ble slått ned av sirnas i CL1-5 celler analysert ved real-time kvantitativ RT-PCR i tre eksemplarer. To forskjellige sirnas (siJAG1-1 og siJAG1-2) ble brukt til taushet JAG1. NC, negativ kontroll. Middle og Høyre, migrasjon og invasjon evnen til JAG1-støydempere transfektanter ble analysert ved migrasjon og matrigel invasjon analyser. Data som er vist som gjennomsnitt ± SD; *:
p
0,05 sammenlignet med negativ kontroll.
JAG1 fremmer NSCLC malignitet
For å bekrefte hvorvidt onkogene natur JAG1 er et universelt fenomen, utførte vi transwell migrasjon og invasjon analyser i to andre cellelinjer. Dette fenomenet ble rekapitulert i andre ikke-småcellet lungekreft cellelinjer. Vi fant ut at forbigående håndheves uttrykk for JAG1 fremmet migrering og invasive evner
in vitro
ikke bare i CL1-0 men også i A549 og H226 celler (figur 2A). For å bekrefte om JAG1 funksjoner for å fremme metastaser
in vivo
ble CL1-0 celler transfektert med JAG1 uttrykte eller tom vektor og ble intravenøst innført i NOD SCID mus ved halen injeksjon for å evaluere sine metastase evner. Etter ti uker etter injeksjon ble alle musene avlivet og den metastatiske tumor foki i lungene ble undersøkt og tellet. Mus injisert med JAG1 transfektanter (n = 13) utviklet mer lungemetastase knuter enn mock transfektanter (n = 10) (figur 2B, venstre og i midten). Metastatiske lesjoner i tilfeldig utvalgte lunge seksjonene ble farget av hematoxylin og eosin til histologisk bekreftet tumornoduler (figur 2B, høyre). Disse resultatene ytterligere bekreftet at JAG1 spiller en avgjørende rolle i moduler kreft metastasering.
(A) JAG1 fremmer cellemigrasjon og invasivitet
in vitro
. Venstre, JAG1 ble forbigående overexpressed i A549 og H226 celler. JAG1 mRNA ble målt ved hjelp av sanntids-kvantitativ RT-PCR og normalisert til TBP i tre eksemplarer. Middle og Høyre, migrasjon evne og invasivitet av celler med forbigående JAG1 overekspresjon og kontrollceller ble evaluert av migrasjon og matrigel invasjon analyser. *:
p
0,05, sammenlignet med mock. Resultatene ble representert som middelverdi ± SD in triplo. (B) JAG1 fremmer metastaser
in vivo
. Venstre, antall knuter i SCID-mus. De Mock CL1-0 celler og JAG1-overekspresjon cellelinjer ble inokulert i alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus ved halevenen injeksjon. Etter 10 uker ble musene avlivet. Antall svulster avledet fra håne og JAG1 transfektanter ble målt under disseksjon mikroskop. Resultatene ble representert som gjennomsnitt ± SD (n = 10 i mock-kontroll-gruppen og n = 13 i JAG1 transfektant gruppe). *:
p
0,05, sammenlignet med mock-kontroll. Høyre, skinn av lungene fra mus injisert med CL1-0 håne og JAG1 transfektanter og representanten H E flekker deler av lungene fra mus. Røde piler indikerer metastatisk tumor knuter i lungene. Svarte piler indikerer micrometastasis av lungekreft celler.
Association of JAG1 mRNA uttrykk og kliniske resultater
Gitt betydningen av JAG1 i kreft invasjon
in vitro Hotell og
in vivo
, vi videre undersøkt effekten av JAG1 på fremdriften av lungekrefttilfellene. Først JAG1 mRNA uttrykk ble målt i 63 parvise tilstøtende normale og NSCLC vev ved real-time kvantitativ RT-PCR. Selv om
p
-verdi nådde ikke statistisk signifikans (
p
= 0,058), den JAG1 mRNA hadde en tendens til at det var rikelig i svulstvev snarere enn i tilstøtende paret normalt vev (Fig 3A). Deretter fant vi at JAG1 var tilbøyelig til å uttrykke i tumor deler sammenlignet med nærliggende normalt vev av 14 ut av 20 plateepitel karsinom (
p
= 0,017, figur 3B). Videre undersøkte vi hvorvidt JAG1 mRNA-ekspresjon er korrelert med overlevelse av pasienter. Blant 90 NSCLC pasienter, ble mRNA nivået av JAG1 ikke korrelert med pasientenes total overlevelse (S1 figur,
p
= 0,9710). Men selv om var bare 35 pasienter med plateepitelkarsinom blant 90 NSCLC, lavt nivå mRNA av JAG1 hadde vist lengre total overlevelse i squamous karsinom pasienter enn pasienter med høyere nivå mRNA av JAG1 vist med Kaplan-Meier overlevelsesanalyser og log-rank tester (
p
= 0,042, figur 3C). Multivariable Cox regresjonsanalyse viste at JAG1 transkripsjon er assosiert med total overlevelse av plateepitel karsinom (pasienter med høyt versus lavt JAG1 mRNA nivå, hazard ratio [HR] = 2,87, 95% CI = 0,99 til 8,33;
p
= 0,05).
(A og B) JAG1 mRNA uttrykk i tumor og normale deler av lungekreft. JAG1 mRNA i tumorer og tilstøtende normale vev av NSCLC (A) og undertype plateepitel carcinom pasienter (B) ble bestemt ved sanntids kvantitativ RT-PCR og normalisert til TBP. (C) JAG1 mRNA nivå og total overlevelse av subtype plateepitel karsinom pasienter. Alle statistiske tester var tosidig, og
p
. 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
HSPA2 er en roman nedstrøms effektor av JAG1 i NSCLC
til slutt, benyttet vi den Affymetrix oligonukleotid microarray analyse for å identifisere de beste 10 differensielt uttrykte gener i JAG1-transfekterte CL1-0 celler sammenlignet med modell transfektant (S2 og S3 tabeller). Spesielt vi ikke observere noen signifikant forskjell på Notch1 og Notch2 og nedstrøms gener (ASCL1, HES1, HEY1, og SLUG) mRNA nivå, bortsett fra spornivåer forskjell på Notch3 og Notch4 RNA nivå hos NSCLC celler (S4 og S5 tabeller). For å identifisere nye potensielle JAG1 nedstrøms molekyler, vi først utført RT-PCR for å validere gener med betydelige uttrykk endringer analysert av microarray resultat enten i JAG1 transfektanter eller JAG1 forstummet CL1-0, CL1-5, A549 og H226 cellelinjer (S3 Bord). Blant alle gener, HSPA2 utstilt konsekvent og forventet tendens blant disse 10 genene når manipulere JAG1. HSPA2, hvis mobilnettet fungerer i lungekreft er uklare, ble høyere uttrykt (1,4 ganger i A549 celler og 1,2 ganger i H226-celler) i JAG1 transfektanter sammenlignet med kontrollceller (fig 4a). Omvendt, ble mRNA ekspresjon av HSPA2 redusert i JAG1 knockdown celler (figur 4B). I tillegg overekspresjon av V5-HSPA2 i CL1-0 økt celle migrasjon og invasjon evner (fig 4C og 4D). For å utelukke cellelinje virkning, vi ytterligere bekreftet dette fenomenet i flere cellelinjer. Blant skjermede seks lunge kreft cellelinjer, valgte vi de to lav JAG1 mRNA nivå cellelinjer, H1299 og H838, for eksogene uttrykker JAG1 og de fleste to high JAG1 mRNA nivå cellelinjer, HOP62 og H322M, for JAG1 stanse (S2 fig) . I H1299 og H838-cellelinjer, ble mRNA ekspresjon av HSPA2 indusert av JAG1 (S3 Fig). I HOP62 og H322M cellelinjer, ble mRNA uttrykk for HSPA2 redusert når JAG1 ble stille (S4 fig). Vi videre undersøkt om dette JAG1 /HSPA2 aksen var uavhengig fra HAKK signalering. Canonical proteolytisk status av intracellulære domenet av HAKK (NiCd) familien inkludert NICD1, NICD2, NICD3, og NICD4 ble analysert i JAG1 manipulert cellelinjer (figur 5). I tillegg ble transkripsjonsnivået DLL1 og andre HAKK nedstrøms molekyler inkludert CBF1, slug, snail1, SMAD3, HES1, HES3, HES5, HEY1, hey2, og MYOD1 også adressert. Resultatene viste at alle NICDs og mRNA nivå av nedstrøms-molekyler (med unntak av HES1) hadde ingen signifikant endring i JAG1 overuttrykt CL1-0 celler (figur 5A). De tilsvarende resultater kan observeres i JAG1 overexpressed H1299 (Fig 5B og S5 figur) og H838 (Fig 5B og S6 figur) cellelinjer eller JAG1 forstummet HOP62 og H322M cellelinjer (figur 5C) sammenlignet med kontrolleksperimenter. Bare HES5 mRNA ble påvirket av JAG1 i H1299 cellelinje. DAPT, et gamma-sekretase inhibitor for å blokkere HAKK signalering, var også ute av stand til å eliminere HSPA2 transkripsjonen oppregulering av JAG1 (S7 Fig). Dette støttes den sannsynlige HAKK-uavhengig regulering i det minste i disse cellelinjene. Til slutt ønsker vi å teste om JAG1 ble colocalized med HSPA2 og fluorescerende immunhistokjemi farging ble utført i lungekreftpasienter «vev delen. Resultatet indikerte JAG1 og HSPA2 ble heterogent uttrykt i tumor deler og delvis colocalized (S8 fig). Disse resultatene antydet at HSPA2 var en nedstrøms gen av JAG1 og det også regulert svulst celle migrasjon og invasjon.
(A og B) JAG1 ble forbigående overexpressed i A549 og H226 (A) eller knockdown av JAG1 sirnas i CL1 -5 (B). HSPA2 mRNA ble målt ved hjelp av sanntids-kvantitativ RT-PCR og normalisert til TBP. (C) Migrering evne til CL1-0 celler med forbigående HSPA2 overekspresjon og kontrollceller ble evaluert ved migrasjon assay. *,
p
0,05, sammenlignet med mock-kontroll. Resultatene ble representert som gjennomsnitt ± SD (n = 3 per gruppe). (D) Invasivitet av CL1-0 celler med forbigående HSPA2 overekspresjon og kontrollceller som vurderes av matrigel invasjon analysen. *,
p
0,05, sammenlignet med mock-kontroll. Data ble representert som gjennomsnitt ± SD (n = 3 per gruppe).
Cell ble forbigående overexpressed JAG1 av uttrykk plasmid eller taushet JAG1 av siRNA strategien som følges av immunoblottet med NICD1, NICD2, NICD3, og NICD4 antistoffer eller real-time kvantitativ PCR for HAKK molekylære mRNA nivå analyse. (A) JAG1 overexpressed i CL1-0 celler etterfulgt av Western blot analyse for NICDs proteolytisk status eller real-time kvantitativ PCR for HAKK molekylære mRNA nivå analyse. (B) JAG1 overexpressed i H1299 og H838 cellelinjer etterfulgt av Western blot analyse for NICDs proteolytisk status. (C) JAG1 forstummet i HOP62 og H322M cellelinjer etterfulgt av Western blot analyse for NICDs proteolytisk status. DAPT er et gamma-sekretase inhibitor og anvendt for HAKK signalkontroll. UD, ubestemt grunn undetectable uttrykk nivå; *,
p
0,05 sammenlignet med mock-kontroll. Data ble representert som gjennomsnitt ± SD (n = 3 per gruppe).
Diskusjoner
Disco onkogener /tumorsuppressorgener og karakterisering av de underliggende molekylære mekanismene ikke bare avklare komplisert natur tumorigenesis og kreft progresjon, men også gi et grunnlag for å utvikle bedre strategier i kreft diagnose, prognose, prediksjon og behandling i fremtiden. Våre funn viste onkogene rolle JAG1 i lungekreft, fremme kreft invasjon og metastasering. Kliniske data viste at JAG1 mRNA uttrykket er assosiert med dårlig overlevelse hos pasienter med subtype plateepitel karsinom av NSCLC. I en tidligere studie, uttrykk for JAG1 i lunge vev av idiopatisk lungefibrose, som predisponerer for lungekreft, ble oppregulert. Videre er protein ekspresjon av JAG1 of squamous metaplastiske lesjoner positiv i 83% tilfeller analysert ved immunhistokjemisk farging [19]. Derfor kan JAG1 uttrykk i lunge kreft, inkludert plateepitel karsinom, har høy effekt av kliniske implikasjoner.
hakket signalveier er vanligvis ansett for å være ligand-induserte [10], og reseptorene og ligander er svært co -expressed i kreft [15, 20]. Ifølge våre microarray data, gjorde overekspresjon av JAG1 ikke signifikant slå på Notch signalveien (unntatt NOTCH3 med 1,67 ganger endring) i CL1-0 celler (S4 Table). Resultatet av sanntids kvantitativ RT-PCR validering også gitt tilsvarende konklusjoner (S5 Table). Den tvetydige uttrykk for NOTCHs og nedstrøms molekyler i JAG1 transfektert CL1-0 kan resultere fra heterogen cellepopulasjon. I tillegg HES1 var litt oppregulert i JAG1 overexpressed CL1-0 celler (figur 5A og S5 Table). Dermed kan vi ikke utelukke involvering av HAKK signale spesielt NOTCH3 signalering i CL1-0. Notch ligander har blitt rapportert å ha iboende ligand signaleringsaktivitet uavhengig av Notch-reseptorer. Etter posttranslasjonelle modifikasjoner, proteolytisk behandling, endocytose og membran trafficking, ville Notch ligander være multifunksjonelle [21]. Dette innebar at JAG1 i deler av NSCLC kan indusere noncanonical signalveier. I denne studien vi fullt ut analysert HAKK signalisering i JAG1 overuttrykt lungekreft cellelinjer ved å undersøke den proteolytiske status NiCd og nedstrøms molekyler av HAKK signalering. Bare HES5 hadde funnet å bli redusert i JAG1 overuttrykt H1299 cellelinje (S5 Fig). Hvorvidt dette hadde betydning i metastase er fortsatt behov for å bli undersøkt. Til sammen våre resultater indikerte at JAG1 er også i stand til å formidle celle migrasjon, invasjon og metastasering av NSCLC gjennom en Notch-uavhengig pathway
Flere studier har rapportert at JAG1 formidler flere signalveier som:. AP-1 , MAPK, EGFR, NF-κβ, og IL-6 i forskjellige tumorceller [22-26]. Våre microarray data indikerte at JAG1 modulerer flere gener som adhesjonsmolekyl med Ig-Like Domain 2 (AMIGO2), Inhibin, Beta E (INHBE), Heat Shock 70kDa Protein 2 (HSPA2), Sperm protein forbundet med kjernen, X-Linked , familiemedlem (Spanx), og G protein-koblet reseptor, klasse C, gruppe 5, medlem B (GPRC5B). HSPA2 har blitt funnet å overuttrykke i mange krefttyper. Videre pasienter med høyere HSPA2 uttrykk hadde kortere total overlevelse sammenlignet med lavere HSPA2 pasienter [27-30]. Dette er i tråd med vår
in vitro
data som HSPA2 spiller en onkogen rolle i NSCLC cellelinjer. Viktigere, vi tilveiebragt en ny avbildning av mekanismen for HSPA2 signalisering.
Selv om den underliggende mekanisme for HSPA2 i cancermetastase er mindre dokumentert, er det kritisk rolle i tumorvekst og metastatisk potensiale var blitt antatt. Basert på sin involvering for dannelse av aktiv CDC2 /cycline B1 kompleks og uttrykk i tumorer, kan det regulere kreft celle egenskaper av malignitet som migrasjon og invasjon [31-34]. Nylig HSPA2 ble rapportert at det ble uttrykt i SCC i stedet for i adenokarsinom og korrelert med dårlig total overlevelse, støtter våre funn i SCC [29]. Det var mulig at HSPA2 korrelert til dårlig overlevelse i SCC på grunn av den anti-apoptose effekt via nedstrøms faktorer, slik som linse epitel-avledet vekstfaktor (LEDGF) [35]. Nylig, varmesjokkprotein 70 ble også rapportert å samhandle med NICD1 og bidra til HAKK signalering [36]. I denne studien fremhevet vi rollen som JAG1 indusert ikke-kanoniske Notch signalering i NSCLC. Selv JAG1 og HSPA2 ble bare delvis colocalized i pasientenes svulst biopsi (S8 figur), kan regulering av HSPA2 av JAG1 være et viktig funn for lungekreft celle malignitet. Enten JAG1 kan samhandle med andre reseptorer enn NOTCHs og indusere HSPA2 transkripsjonen oppregulering må undersøkes nærmere. Muligheten for HSPA2, et varmesjokkprotein, for å være et potensielt terapeutisk mål kan forventes. Oppsummert våre funn er den første til å danne grunnlag at JAG1 fungerer som en prognostisk biomarkør og JAG1 /HSPA2 akse bidrar til lungekreft malignitet.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. JAG1 uttrykk og NSCLC pasientenes overlevelse
doi:. 10,1371 /journal.pone.0150355.s001 product: (PDF)
S2 Fig. Endogen JAG1 mRNA uttrykk i seks lunge kreft cellelinjer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0150355.s002 product: (PDF)
S3 Fig. HSPA2 mRNA uttrykk er oppregulert ved JAG1 mRNA overekspresjon
doi:. 10,1371 /journal.pone.0150355.s003 product: (PDF)
S4 Fig. HSPA2 mRNA uttrykk er nedregulert av JAG1 mRNA lyddemping
doi:. 10,1371 /journal.pone.0150355.s004 product: (PDF)
S5 Fig. mRNA uttrykk for HAKK nedstrøms molekyler i JAG1 overexpressed H1299 celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0150355.s005 product: (PDF)
S6 Fig. mRNA uttrykk for HAKK nedstrøms molekyler i JAG1 overexpressed H838 celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0150355.s006 product: (PDF)
S7 Fig. Oppregulering av HSPA2 av JAG1 var uavhengig av HAKK signale
doi:. 10,1371 /journal.pone.0150355.s007 product: (PDF)
S8 Fig. Fluorescent immunhistokjemisk farging for JAG1 og HSPA2
doi:. 10,1371 /journal.pone.0150355.s008 product: (PDF)
S1 Table. Primer sekvenser av målgener som brukes i SYBR Grønn sanntid kvantitativ RT-PCR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0150355.s009 product: (PDF)
S2 Table. Topp 10 forskjellig uttrykt gen i JAG1-overuttrykt CL1-0 celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0150355.s010 product: (PDF)
S3 Table.
