Abstract
Resveratrol (trans-3,4,5 «-trihydroxystilbene) er en aktiv forbindelse i mat, for eksempel røde druer, peanøtter og bær. Resveratrol oppviser en anticancer virkning på forskjellige humane kreftceller. Det gjenstår imidlertid mekanismen for resveratrol-induserte anti-kreft effekt på det molekylære nivå til å bli belyst. I denne studien mekanismen bak den anti-kreft effekt av resveratrol i humane eggstokkreft celler (OVCAR-3 og Caov-3) ble undersøkt ved hjelp av forskjellige molekylære biologiske teknikker, slik som strømningscytometri, western blotting, og RNA-interferens, med en stort fokus på den potensielle rolle autofagi i resveratrol-indusert apoptotisk celledød. Vi viste at resveratrol indusert reaktive oksygenforbindelser (ROS) generasjonen, som utløser autofagi og påfølgende apoptotisk celledød. Resveratrol indusert ATG5 uttrykk og fremmet LC3 cleavage. Den apoptotisk celledød indusert av resveratrol ble svekket av både farmakologiske og genetisk hemming av autofagi. Den autophagy inhibitor klorokin, som fungerer ved sent stadium av autophagy, betydelig redusert resveratrol-indusert celledød og kaspase 3 aktivitet i humane eggstokkreft celler. Vi viste også at målretting ATG5 av siRNA også undertrykt resveratrol-indusert apoptotisk celledød. Dermed konkluderte vi med at en felles sti mellom autofagi og apoptose eksisterer i resveratrol-indusert celledød i ovčar-tre menneskelige eggstokkreft celler
Citation. Lang F, Qin Z, Li F, Zhang H, Fang Z Hao E (2015) celledød ved apoptose indusert av Resveratrol er delvis mediert av Autophagy Pathway i human eggstokkreft celler. PLoS ONE 10 (6): e0129196. doi: 10,1371 /journal.pone.0129196
Academic Redaktør: Dominique Delmas, UMR INSERM U866, FRANCE
mottatt: 31 oktober 2014; Godkjent: 07.05.2015; Publisert: 11 juni 2015
Copyright: © 2015 Lang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Alle data er gitt i manuskriptet
Finansiering:. Denne studien ble støttet av den fremmende forskningsfondet for unge og middelaldrende forskere i Shandong-provinsen (Grant No. 07-21). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er en av de viktigste ledende årsakene til kreft-relaterte dødsfall for kvinner og en høy grad av tilbakefall etter operasjon [1] [2]. I de fleste tilfeller er det diagnose gjøres ved sene stadier av kreft, og det blir utfordrende for kirurgisk fjerning og gjenvinning av [2]. Dermed kan studier på de aktive ingrediensene i matvarer gir nyttige alternative terapeutiske tilnærminger for malignitet.
Resveratrol er en aktiv ingrediens fra våre mat kilder, for eksempel druer, peanøtter og bær, som lenge har vært brukt i tradisjonell kinesisk medisin. Tallrike studier har vist en positiv effekt av resveratrol i hjerte- og karsykdommer, nevrale sykdommer, fedme, og inflammatoriske lidelser [3-5]. En av de viktigste områdene av resveratrol forskning er i forkant av kreftforskning [6, 7]. Det er vel kjent at en høy dose av resveratrol resulterer i apoptotisk celledød av eggstokkreft celler [8-10]. Flere mekanismer på eggstokkreft celledød er blitt foreslått. Fosforylering av Cdc2-tyr15 av resveratrol behandling resultat i cellesyklus arrest av OVCAR-3 [9]. Nedregulering av Akt /GSK og ERK signalveier har vist seg å være kritisk for resveratrol-mediert celledød [10]. Nylig, Lin et al. beskrev den viktige rollen ceramid og COX-2 i apoptotisk celledød av resveratrol i OVCAR-3 [8].
Autophagy er en konservativ selv nedbrytning sti der cytosolic komponenter er sequestered til lysosomer for nedbrytning og resirkulering [11]. I friskt vev, er dette en prosess for rensing av skadede organeller. Det er imidlertid en komplisert prosess i kreftceller, hvor det enten kan undertrykke eller induserer veksten av kreftceller avhengig av cellulære mikromiljø [12].
I den foreliggende undersøkelse har vi undersøkt potensielle rolle i autophagy resveratrol-indusert apoptotisk celledød i OVCAR-3 kreftceller. Vi fant at resveratrol behandling indusert ROS generasjon og apoptose, så vel som aktivering av autophagy bane i OVCAR-3-celler. Hemming av autofagi av en farmakologisk inhibitor eller en siRNA mot ATG5 betydelig svekket resveratrol-mediert apoptotisk celledød. Dermed vår studie etablert en viktig rolle autofagi i resveratrol-indusert apoptose i humane eggstokkreft celler.
Materialer og metoder
Reagenser
Resveratrol, NAC (N acetylcystein ), klorokin, caspase tre analysesett, og LC3 antistoff ble levert fra Sigma (USA). Resveratrol ble oppløst i DMSO (Sigma, USA) og var tilberedes hver gang før cellen behandling. Anti-ATG5 antistoff ble kjøpt fra Beijing Biosyntese Bioteknologi, ATG5-ATG12 Complex Antistoff var fra ABD Serotec, og anti-kløyvde caspase 3 antistoff ble bestilt fra Cell Signal teknologier. siRNA mot ATG5 ble innhentet fra Shanghai GenePharma Co Ltd Z-VAD-FMK ble kjøpt fra R D
Cell kultur
ovčar-3 og Caov-3 menneskelige eggstokkreft cellelinjer. ble oppnådd fra ATCC (USA). Cellene ble dyrket i RPMI 1640 (Liv Technology, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum, insulin, og penicillin-streptomycin. Cellelinjen ble dyrket i en CO
2 inkubator ved 37 ° C. Menneske Ovarian Surface epitelceller (HOSEpiC) celler ble dyrket med Ovarian epithelial Cell Medium levert fra produsent (ScienCell Research Laboratories). Resveratrol behandling ble beskrevet i tekst og tall.
Celleviabilitet analyser
Celleviabilitet ble utført ved hjelp av MTT-analyser i henhold til produsentens anbefalinger. I korthet ble cellene sådd ut i 96-brønners plater og dyrket over natten. Cellene ble behandlet med resveratrol eller andre forbindelser som er anført i 48 timer. Cellene ble vasket med media og MTT ble tilsatt 6 timer før endepunktet, og absorbansen ved 490 nm ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser.
Apoptose-analysen ved bruk av strømningscytometri
apoptotisk celledød var målt ved farging med Sytox Grønn og Annexin V-APC (Livet Technology, USA) som tidligere beskrevet [13].
Cellular ROS-analysene
Totalt intracellulær ROS ble målt ved flowcytometri bruke H2DCFDA fargestoff i henhold til produsentens anbefaling (Livet Technology, USA).
Fastsettelse av mitokondrienes elektron potensiell endring
mitokondriell membranpotensialet ble vurdert ved hjelp av en levende celle analysen med fluorescerende lipofile kationiske fargestoff TMRE (Sigma )). Dette fargestoff er en celle permeant fargestoff som lett samler seg i aktiv mitokondrier på grunn av deres relative negativ ladning. Etter behandling OVCAR-3-celler ble farget med 500 nM TMRE i 30 minutter ved 37 ° C, deretter vasket to ganger i medium og resuspendert i PBS. Cellene ble analysert på et flowcytometer ved FL2 kanal og den midlere intensitet er plottet. itochondrial potensial også analysert ved hjelp av en annen farge JC-1. Etter behandling som beskrevet i teksten, ble de fluorescerende bildene umiddelbart tatt med en Zeiss AX10 invertert omfang (Carl Zeiss Microimaging Inc., Tyskland).
Fastsettelse av 4HNE Protein addukter
4- HNE nivå i cellelysatene ble målt ved hjelp av OxiSelect HNE addukt ELISA Kit (Cell Biolabs) i henhold til produsentens instruksjoner. Western blot ble også utført med en anti-HNE antistoff (Abcam).
Western blotting analyserer
Celler ble vasket med kald PBS og lysert med RIPA buffer (Sigma, USA) som inneholder en proteasehemmer cocktail (Roche, Tyskland). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved anvendelse av en proteinanalyse reagens (Bio Rad, USA), og like mengder av protein (50 ug) ble fylt i hver brønn med 4-20% eller 12% SDS-PAGE. Etter at proteinene ble overført på en nitrocellulosemembran, ble blottene blokkert med 5% melk, etterfulgt av inkubasjon med det passende fortynnede primære antistoff over natten. Etter tre vaskinger med TBS-T-buffer, ble blottene inkubert med passende fortynnet HRP-konjugerte sekundære antistoffer i 2 timer. De immunoblotter ble utviklet ved hjelp av SuperSignal West Femto kit (Fisher Scientific, USA).
RNA interferens
ovčar celler ble transfektert med enten uspesifikke eller ATG5 siRNA hjelp lipofektamin (Life-teknologi, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Celler ble inkubert i 48 timer før behandling med resveratrol for maksimal sperring av ATG5 uttrykk.
Caspase 3 aktivitet
Caspase 3-aktivitet ble målt ved anvendelse av caspase tre assay kit (Sigma, USA) ifølge produsentens instruksjoner. Proteinkonsentrasjonene ble bestemt ved å bruke den tidligere beskrevne fremgangsmåte og like mengder av protein ble anbrakt i en 96-brønners plate for caspase 3-analysen.
PARP-aktivitet
PARP-aktivitet, vi brukte HT Universal Colorimetric PARP assay kit fra Trevigen. PARP-aktivitet bestemmes ved mengden av PAR avsatt på immobiliserte histonproteinene. Prosedyren ble utført i henhold til produsentens anbefalinger.
Live cell imaging med autofagi indikator fargestoff
autophagic flux også ble fastsatt ved hjelp Cyto-ID Autophagy Detection Kit (Enzo biovitenskap) i henhold til produsentens instruksjoner.
live celle bildebehandling med fluroscent caspase underlaget
caspaseaktivering ble fastsatt ved hjelp CellEvent caspase-3/7 Grønn Detection Reagent (Life-teknologi, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Statistiske analyser
Alle data ble uttrykt som gjennomsnitt med standardavvik av gjennomsnittet. Eksperimentene ble gjentatt fire ganger i duplikat for alle eksperimenter. T-test eller enveis ANOVA ble foretatt etter behov for å bestemme den statistiske signifikans. Betydningen ble etablert på p. 0,05
Resultater
Resveratrol indusert celledød ved apoptose av menneskelige eggstokkreft celler i en doseavhengig måte
OVCAR-3 er en chemo motstandsdyktig kreft cellelinje etablert fra en eggstokkene adenokarsinom pasient. Vi utnyttet OVCAR-3 celler som
in vitro
kreftcelle modell for å teste kreft effekter av resveratrol. Som vist i figur 1A, behandling med resveratrol ved 1 uM til 100 uM i 48 timer resulterte i en doseavhengig tap av cellelevedyktighet så bestemt ved anvendelse av MTT-analyser. Behandling med 30 uM og 100 uM resveratrol viste en statistisk signifikant tap av cellelevedyktighet ved 48 timer.
A. OVCAR3 celler ble behandlet med 1 til 100 uM resveratrol i 48 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved å anvende MTT-analyser. Dataene ble hentet fra et gjennomsnitt på fire uavhengige forsøk. * P 0,05 sammenlignet med kjøretøy kontroll, n = 4 /gruppe. B. Representant flowcytometrisk dot tomter for måling av apoptose i OVCAR-3 celler. Resveratrol-indusert apoptose ble målt ved farging med Sytox grønne fargestoff (Y-aksen, FL1) og Annexin V-APC (X-aksen, FL4). C. Kvantitativ bestemmelse av begynnelsen av apoptotisk celledød som antall annexin-V-positive celler med Sytox grønn-negative celler, og sen apoptotisk /nekrotisk celledød som antall annexin-V-positive og Sytox grønn-positive celler.
effektene av resveratrol på apoptotisk celledød av OVCAR-3-celler ble undersøkt ved flowcytometri hjelp Sytox Grønn (FL1H) og Annexin V- allofykocyanin (FL4H). Behandling med 100 uM av resveratrol i 48 timer induserte signifikant tidlig apoptotiske og apoptotiske sen /nekrotisk celledød (figur 1B og 1C). Behandling med 30 mikrometer av resveratrol i 48 timer også indusert betydelig tidlig apoptotisk og sen apoptotiske /nekrotiske celledød (Fig 2A og 2B), men effekten var mindre enn 100 mikrometer.
A. Representant western blotting analyser av OVCAR-3 totalt cellelysater med ATG5, LC3, og P62 antistoffer. β-aktin og GAPDH ble brukt som laste kontroller. Tre gjentatte prøver ble lastet for hver behandlingsgruppe. B. Caspase 3 aktivering ble målt fra cellelysater og uttrykt som ganger endring. * P. 0,05 sammenlignet med bilen kontroll, n = 4 /gruppe
Resveratrol indusert autofagi i menneskelige eggstokkreft celler
Vi evaluerte også effekten av resveratrol på autofagi. Nøkkel markører for autofagi ble vurdert. Som vist i figur 2C og figur 3A, resveratrol ainduced LC3-II og p62 i OVCAR-3-celler. Western blotting analyser viste en økning i spesifikk autophagic markør ATG5, som er avgjørende for autophagosome formasjon (figurene 2A og 3A). I tillegg ble aktiviteten av caspase 3 signifikant økt i resveratrol-behandlede OVCAR-3-celler (figur 2D og 3B).
A. OVCAR-3-celler ble behandlet med 30 uM resveratrol i 48 timer, og celledød ble bestemt ved flow-cytometri. B. kvantitative resultat av strømningscytometri. C. Representant western blotting analyser av ovčar-3 totalt cellelysater med ATG5, LC3, og P62-antistoffer med β-actin som en lasting kontroll.
Resveratrol indusert oksidativt stress i OVCAR-3 menneskelig eggstokkreft celler
Neste, vi undersøkt om resveratrol behandlingen hatt noen effekt på oksidativt stress i kreftcellene. I den første fremgangsmåten, har vi brukt en celle-permeant 2 «, 7»-dichlorodihydrofluorescein diacetat (H2DCFDA) fargestoff til å måle intracellulær ROS, og fant at resveratrol ved 30 uM resulterte i significantincrease i intracellulær produksjon ROS i OVCAR3 celler (figur 4A). For ytterligere å bekrefte dette resultatet, vi brukte også en gratis metode for å måle oksidativt fotavtrykk ved å måle HNE protein addukter (4-Hydroxynonenal). I samsvar med den intracellulære ROS data, ble HNE protein addukter økt betydelig sammenlignet med kjøretøy-behandlede ovčar celler (fig 4B og 4C). Videre viste vi at resveratrol også betydelig redusert mitokondrienes elektron potensial (figur 4D).
A
. Intracellulær ROS av OVCAR-3 ble målt ved flowcytometri hjelp H
2DCFDA og uttrykt som ganger endring. Resveratrol 30 mikrometer indusert statistisk signifikant ROS. * P 0,05 sammenlignet med kjøretøy kontroll, n = 4 /gruppe.
B
. Oksidativt stress markør 4HNE modifiserte proteiner ble bestemt ved hjelp av ELISA fra cellelysatene av kjøretøy og Resveratrol behandlede pasienter (30 mm) ovčar-3 celler. De kvantifiserte modifiserte proteiner ble uttrykt som% av kjøretøyet kontrollprøver. * P 0,05 sammenlignet med kjøretøy kontroll, n = 4 /gruppe. C. Representant Western blotting viser resveratrol indusert heving av HNE addukter. D. mitokondrienes elektron potensiell endring etter resveratrol behandling ble bestemt ved kvantitativ flowcytometri og immunfluorescens.
Resveratrol tilsvar indusert apoptose og autofagi i humane ovarie kreftceller Caov-3
For å avgjøre om resveratrol effekten er cellelinje bestemt, vi benyttet et annet menneske eggstokkreft cellelinje Caov-3. I samsvar med den effekt observert i OVCAR-3 celler, resveratrol også indusert apoptose og autofagi i Caov-3 celler (fig 5). Men resveratrol i samme dose og tidsramme induserte ikke tidlig apoptose i primære humane eggstokkreft overflaten epitelceller HOSEpiC selv om det er litt bedre i slutten av apoptotiske /nekrotiske celledød (S1 figur).
A. Caov-3-celler ble behandlet med 30 uM resveratrol i 72 timer, og celledød ble bestemt ved flow-cytometri. B. kvantitative resultat av strømningscytometri. C. Representant western blotting analyser av Caov-3 totalt cellelysater med LC3 og P62 antistoffer.
Farmakologisk hemming av autofagi dempes resveratrol-indusert celledød i ovčar-3 celler
for å teste om autofagi er en link til apoptotisk celledød, behandlet vi OVCAR-3 celler med klorokin (CQ), en farmakologisk hemmer av autofagi, før resveratrol behandling. Apoptose og celledød ble bestemt ved bruk Sytox Grønn og AnnexinV-allofykocyanin. Som vist i figur 6A, celledød ved resveratrol ved 30 uM ble betydelig svekket ved forbehandling med 2 uM av CQ. Resveratrol betydelig redusert det totale mobil døden ved autofagi hemming. også analysert resveratrol apoptose markører kaspase 3 aktivitet og PARP-aktivitet, og begge ble dempet ved CQ behandling (Fig 6C). I tillegg observerte vi at resveratrol-indusert autophagosome markører LC3II og p62 ble også svekket ved CQ behandling (Fig 6D).
A
. Representant flowcytometri dot diagrammer som representerer hver OVCAR-3 celler. Cellulær apoptose ble målt ved samme fremgangsmåte som i figur 1. Klorokin reduserte celledrepende virkning av resveratrol. B. Kvantitativ bestemmelse av total celledød, som ble uttrykt som prosentandel av totale celler. * P 0,05 sammenlignet med vehikkel-kontroll; # P 0,05 sammenlignet med resveratrol-behandlet prøvene. n = 4 /gruppe. C. Caspase 3 og PARP aktiviteter ble analysert og plottet som ganger endring. D. Representant western blotting analyser av ovčar-3 totalt cellelysater med LC3 og P62 antistoffer.
Hemming av autofagi av ATG siRNA bedres resveratrol-indusert celledød i ovčar-3 celler
ATG5 er kjennetegn på autofagi og en sentral aktør i dannelsen av autophagosomes. I tillegg til de farmakologiske inhibitor, anvendte vi en genetisk måte ved å slå ned ATG5 ekspresjon ved hjelp av en spesifikk siRNA og undersøkt dens effekt på resveratrol-indusert kreft celledød. Som vist i figur 7, ble celledød ved resveratrol (30 pm) redusert fra 27,9% til 16,22% av ATG5 siRNA. Et lignende mønster ble også observert i kaspase 3 aktivitet og LC3 western blot (Figur 7B og 7C). Effekten av siRNA teknologi ble bekreftet ved hjelp av Western blotting analyser, som indikerte en signifikant reduksjon av ATG5 proteinnivåer (figur 7A). Interessant, fant vi at cellene behandlet med ATG5 siRNA i kombinasjon med Z-VAD-FMK (50 uM) er mer vesentlig beskyttet mot resveratrol-indusert celledød sammenlignet med de som ble behandlet med enten inhibitor alene (Fig 7E). Vi har også ansatt ny live-cell imaging teknologi bruker Cyto-ID fargestoff for autofagi fluks og de ovennevnte resultatene ble bekreftet.
A. ATG5 protein uttrykk ble bestemt ut fra cellelysatene hentet fra ovčar-3 celler lastet med enten styre tilfeldig siRNA eller ATG5 siRNA. B. caspase 3 aktiviteter ble bestemt ut fra cellelysatene hentet fra ovčar-3 celler lastet med enten styre tilfeldig siRNA eller ATG5 siRNA. Aktivitetene ble uttrykt som ganger endring. * P 0,05 sammenlignet med kjøretøykontroll, # P 0,05 sammenlignet med resveratrol-behandlet prøvene. n = 4 /gruppe. C. Representant western blotting analyser av OVCAR-tre behandlet med kjøretøy (Veh) eller Resveratrol 30 mikrometer (RV) med og uten siATG5 og totale cellelysater var anlyzedwith LC3 og β-aktin D. Live-celle bilde fra konfokal mikroskop (med 20X Formålet) ved anvendelse av Cyto-Id fargestoff lagt i 15 minutter etter behandling med resveratrol ved 30 pM i OVCAR-3-celler transformert med tilfeldig eller ATG5 siRNA. E. Kvantitativ bestemmelse av celledød i ovčar celler ved hjelp av flowcytometri. Resveratrol-indusert celledød dempes i siATG5 behandlet og siATG5 pluss Z-VAD-FMK (50 uM) behandlet OVCAR-3 celler. * P 0,05 sammenlignet med vehikkel-kontroll; # P 0,05 sammenlignet med resveratrol-behandlet prøvene. n = 4 /gruppe.
Vi brukte levende celle bildebehandling for autophagic fluks og caspase 3 underlaget fargestoff (markør for tidlig apoptose) ved hjelp av mikroskopi (Fig 8A og 8B). Det var tydelig at autophagic fluks ble igangsatt tidligere (12h) enn apoptose (24) ved behandling med 30M resveratrol, som er i overensstemmelse med de nevnte ATG5 siRNA data. Vi utførte også en tid studium med Western blot analyser ved hjelp av to sett med prøver fra uavhengige forsøk på hver tidspunkter (Figur 8C) og funnet ut at autofagi ble aktivert tidligere enn apoptose, noe som tyder på at autofagi er oppstrøms av apoptose i eggstokkreft celler behandlet med resveratrol. Men det er overlapp mellom de to prosessene som er et typisk mønster i alle kreftcellepopulasjon.
A. Live-cell imaging av konfokalmikroskopi (med 10X objektiv) med Cyto-ID fargestoff i ovčar-3 celler behandlet med 30 mikrometer resveratrol på 0, 12, 24 og 48 timers tidspunkter. B. Live-cell imaging av konfokalmikroskopi (med 10X objektiv) med caspase 3 grønn deteksjon fargestoff i OVCAR-3 celler på 0, 12, 24 og 48 timers tidspunkter. C. OVCAR-3-celler ble behandlet med 30 pM av resveratrol i 12 timer, 24 timer og 48 timer. Western blotting av totale cellelysater ble utført med anti-ATG5-ATG12, LC3, og caspase 3 antistoffer. Ingen spaltning av ATG5 ble observert. Resultatene som er vist representerer et eksperiment, hvor hver tids punkt av behandlingen ble duplisert.
diskusjon
I denne studien viste vi at resveratrol-indusert celledød i human ovarian cancer celler ble formidlet av både apoptose og autofagi. Resveratrol induserte signifikant intracellulær ROS dannelse og oksidativt stress i kreftceller, noe som resulterte i initieringen av celledød veien. Kjennetegnene på autofagi, LC3 og ATG5 ble både oppregulert i resveratrol-behandlede kreftceller. Vi har også vist at farmakologisk hemming av autofagi av klorokin dempes resveratrol-indusert celledød i OVCAR-3, og lignende resultater ble oppnådd ved å blokkere ATG5 uttrykk ved hjelp av siRNA.
Flere nyere studier har vist noen spennende trasé som medierer resveratrol-indusert apoptotisk celledød. Vergara et al. beskrev rolle ERK signalering og AKT /GSK baner i apoptotisk celledød ved hjelp av en proteomikk tilnærming [10]. I en annen studie elegant, Lin et al. viste at resveratrol-indusert apoptose delte lignende veier med ceramid-indusert COX-2-avhengig apoptose i eggstokkreft celler [8]. ere, vi har vist at apoptotisk celledød av OVCAR-3 indusert av resveratrol er mye mer kompleks og autofagi spiller en avgjørende rolle i denne prosessen.
En av våre viktigste observasjoner var produksjonen av intracellulær ROS og oksidativt stress i resveratrol-indusert celledød i OVCAR-3-celler. ROS er involvert i modulering av forskjellige reaksjonsveier, inkludert den ERK-signalveien [14-16]. Forbløffende nok ROS kan indusere autofagi i resveratrol-behandlet OVCAR-3 celler [17]. Resveratrol er kjent for å ha gunstige antioksidant virkning på friske celler [18], men disse antioksidantaktivitet har ulike konsekvenser i svært voksende kreftceller. Antioksidanter, inkludert resveratrol, har vist seg å bidra til ROS-indusert celledød i andre kreftcelletyper [19, 20]. Våre data tyder på at ROS produksjon av resveratrol i ovčar-3 celler er assosiert med kreft celle apoptose, noe som er konsistent til resultatene oppnådd i tidligere studier fokusert på kolorektal og tykktarmskreft celler.
Generelt hemmer autofagi den induksjon av apoptose, og apoptose-assosierte caspaseaktivering slår av autophagy prosessen. Men det er mange tilfeller der begge disse prosessene skjer samtidig eller co-aktiverer til ROS produksjon indusert både autofagi og apoptose i kreftceller [21]. Autophagy selv kan indusere celledød, en prosess som kalles autophagic celledød [22]. Det har også blitt rapportert at induksjon av autophagy letter aktivering av apoptose [23]. Puissant et al fant at både autofagi og apoptose er involvert i resveratrol-indusert celledød i en myelogen leukemicellelinje [24-26]. I MCF7 brystkreftceller, resveratrol indusert beclin-en avhengig og uavhengig autofagi [27] .Her har vi også observert både caspase avhengig og uavhengig veien finnes for resveratrol indusert celledød i eggstokkreft celler. Enten caspase eller autofagi hemmere ikke var i stand til å gjenopprette resveratrol indusert celledød. En av de viktigste proteiner som er involvert i denne prosessen er den tumor suppressor protein p53 og dets proteinnivåer i cytosol modulen aktivering eller inhibering av autophagy [28, 29]. Nukleær translokasjon av p53 er også viktig for apoptotisk induksjon. Det har vært vist at p53 er avgjørende for resveratrol-mediert celledød i OVCAR-3-celler [8]. Andre vanlige mediatorer av både autofagi og apoptose er flere BH3-only (BCL-3 homologi 3) proteiner. Under apoptose, BH3-bare proteiner direkte samhandler med BCL-2-familien, og dermed stanse den anti-apoptotiske rolle og stimulere apoptose. Flere BH3-bare proteiner, slik som dårlig og BNIP3 kan også fremme autofagi av kompetitiv hemming mellom Beclin1 og apoptotiske proteiner BCL-2 [30-32]. Det er interessant både BCL2 og Bad har vist seg å være dysregulerte i OVCAR-3-celler [8].
p62 engasjement i resveratrol indusert celledød i leukemicellelinje er kritisk [25]. Vi har også observert induksjon av p62 i eggstokkreft celler som respons på resveratrol behandling.
I vår studie fant vi at hemming av autofagi demper (men ikke helt opphever) resveratrol-indusert eggstokkreft celledød. Vi utførte også et tidsforløpsstudium, og fant at resveratrol aktiverer autofagi tidligere enn apoptose, noe som tyder på at autophagy er oppstrøms for apoptose. Sammen utgjør disse data støtter at resveratrol induserer apoptose delvis gjennom autofagi. Vi er enige om at noen mer klassiske mekanismer er trolig også involvert i resveratrol indusert apoptose.
Autophagy er en viktig overlevelsesmekanisme for kreftceller under strenge vilkår for å møte deres næringsbehov. Samtidig hemming av autofagi under anti-kreft terapi er gunstig ved urologisk kreft [33]. I denne studien brukte vi sent stadium autofagi hemmer klorokin og funnet ut at autofagi formidler OVCAR-3 celledød indusert av resveratrol, som ble bekreftet av transfeksjon av en siRNA mot ATG5. Våre data tyder på at det ikke ville være gunstig for å behandle kreft i eggstokkene med en autofagi hemmer i tillegg til resveratrol. Kombinasjon av resveratrol med en autofagi trigger ville muligens forsterke anticancer effekt. Dette ville være et interessant og viktig tema verdt videre studier. Viktigere, tidligere studier i spiserøret squamous cell carcinoma demonstrerte den motsatte effekt ved inhibering av autophagy i resveratrol-indusert celledød [34]. Dette kan være delvis på grunn av ulike doser og typer kreftceller brukt i denne studien, og autofagi er en kompleks prosess som fungerer som et tveegget sverd når utnyttet som en måte å kjempe mot kreft [35-39].
Hjelpemiddel Informasjon
S1 fig. Resveratrol ikke indusere apoptose i friske eggstokkene overflaten epitelceller.
Flowcytometrisk analyser av menneskelig Ovarian Surface Epitelceller (HOSEpiC) celler som ble dyrket med Ovarian epithelial Cell Medium levert fra produsent (ScienCell Research Laboratories). Resveratrol behandling ble utført ved 100 uM i 48 timer. Cellene ble deretter farget med AnnexinV og sytox grønt for tidlig apoptose og sen apoptose /nekrotiske celledød markører hhv. Kvantitativ bestemmelse av flowcytometri data viste ingen signifikant forskjell i tidlige apoptic celledød markører, men lite signifikant økning i apoptose sen /nekrotisk celledød markører. * P 0,05 sammenlignet med vehikkel-kontroll; n = 3 /gruppe
doi:. 10,1371 /journal.pone.0129196.s001 plakater (TIFF)
