Abstract
Bakgrunn
Up-regulering av de mest tallrike H familie menneskelige endogene retrovirus (Herv-H), spesielt env-relatert karakterutskrifter, korrelerer med tykktarmskreft. Men uttrykket mønster av skjøtes ikke-kodende transkripsjoner av Herv-H er ikke klart.
metodikk /hovedfunnene
I denne studien uttrykk for Herv-H skjøtes transkripsjoner i tykktarmskreft ble undersøkt av et RT-PCR-strategi ved anvendelse av primere målrettet mot tRNA
His primer-bindingssete og R region i 3′-lang terminal gjentagelse (LTR), etterfulgt av kloning og sekvensering av amplikonene. Sekvensene ble deretter tildelt individuell Herv-H loci ved å ansette private nukleotid forskjeller mellom loci. Ulike uttrykk mønstre av Herv-H skjøtes transkripsjoner fra forskjellige aktive elementer ble funnet i tykktarmskreft cellelinjer HT29, LS 174T, RKO, SW480 og SW620. Videre uttrykk mønstre i SW480 og RKO ble vesentlig endret ved demetylering behandling. Interessant, ble flere Herv-H elementer funnet å være transkripsjonelt aktiv i tykktarm tumorvev enn i tilstøtende normalt vev (14
vs.
7).
Konklusjon /Betydning
dette er den første forskning for å studere karakteren til ekspresjon av ikke-kodende skjøtede transkripsjoner av Herv-H-elementer i tykktarmskreft. Expression mønstre av Herv-H skjøtes transkripsjoner skilte mellom tykktarmskreft cellelinjer og kan bli påvirket av genomisk DNA metylering nivåer. Enda viktigere, i tillegg til den vanlig aksepterte riss av oppregulering av Herv-H ekspresjon i tykktarm tumorvev, fant vi mer aktiv Herv-H loci i colon tumor sammenlignet med tilstøtende normale vev
relasjon:. Liang Q Xu Z, Xu R, Wu L, Zheng S (2012) uttrykk mønstre av ikke-kodende skjøtes Utskrift fra Menneskelig Endogene Retrovirus Herv-H Elementer i Colon Cancer. PLoS ONE 7 (1): e29950. doi: 10,1371 /journal.pone.0029950
Redaktør: Klaus Roemer, Universitetet i Saarland Medical School, Tyskland
mottatt: 15 september 2011; Godkjent: 07.12.2011; Publisert: 06.01.2012
Copyright: © 2012 Liang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av International Cooperation of Science and Key Foundation Technology i Zhejiang-provinsen (2009C14010), Zhejiang Provincial Natural Science Foundation (R2090353), Natural Science Foundation of China (30973382 og 81101488) National. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
menneske~~POS=TRUNC endogene retrovirus (HERVs) utgjør 8% av det menneskelige genom [1]. De er utledet å stamme fra bakterie-celleinfeksjon av eksogene retrovirus i løpet av evolusjonen primat [2]. Den førvirus strukturen i Herv elementer består i hovedsak av fem «LTR-
gag Anmeldelser –
pro Anmeldelser –
pol Anmeldelser –
env
-3′ LTR, i som de fire genene (
gag
: gruppespesifikt antigen,
pro
: protease,
pol
: polymerase, og
env
: konvolutt) kode strukturelle /funksjonelle proteiner avgjørende for en replikasjonskompetente retrovirus, og de lange terminale gjentagelser (LTR) i begge ender avvike HERVs fra andre retrotransposons som lenge ispedd kjernefysiske elementer (linjer). Mesteparten av restene av HERVs er enkelt isoleres LTR eksemplarer, med den interne sekvens som har gått tapt i løpet av integrasjons eller via homolog rekombinasjon. Herv familier er definert etter ulike kriterier, slik som homogenitet til sine eksogene kolleger, sekvenslikhet av
pol
gener, og primer bindingssetet (PBS) umiddelbart nedstrøms for 5 «LTR. H familie Herv (Herv-H) inneholder en PBS med en sekvens lik menneskets tRNA
Hans. Det er om lag tusen Herv-H elementer gjennom det menneskelige genom, og de fleste av dem (800-900) mangler nesten hele
env
region [3], [4]. Det har blitt rapportert at bare 18 Herv-H-elementer i det humane genom er relativt komplett [5], og bare tre ble identifisert til å inneholde intakte
env
åpne leserammer (ORF) [6].
Selv om de fleste av de Herv-H-elementer er strukturelt ufullstendig på grunn av mutasjon og sletting i løpet av evolusjonen, er det hundrevis av dem holdekomplette 5 «og 3» LTR, og en PBS-tRNA
His umiddelbart nedstrøms for 5′- LTR [7]. Ekspresjon av Herv elementer er for det meste under kontroll av sine LTR [8]. En fullstendig LTR elementet har en struktur av U3-R-U5 (5 «→ 3»), som inneholder både transkripsjon initierende og terminerende signaler. Transkripsjonen av Herv elementer vanligvis starter fra R-regionen i 5 «LTR og ender ved enden av R-regionen i den 3» LTR. Det er også foreslått at celletype avhengige uttrykk for Herv elementer er vanligvis styrt av spesifikke regulatoriske sekvenser lokalisert hovedsakelig i U3 regionen [9].
På grunn av det immunsuppressive eiendom konvolutten protein av Herv-H, mange studier fokusert på
env
-relaterte transkripsjoner [10], og de ikke-
env
-relaterte transkripsjoner ble sjelden vektlagt. Oppregulering av de mest tallrike H familie Herv, spesielt
env
-relaterte transkripter, har blitt rapportert å være assosiert med kolorektal cancer, [5], [11], [12]. I vår tidligere studie, observerte vi at det var mange spleisede ikke-kodende RNA transkribert fra Herv-H-elementer, både i normale og kreft tykktarm vev, så vel som kreft i tykktarmen cellelinjer. Imidlertid er uttrykket mønster av de skjøtede ikke-kodende transkripter fra Herv-Hs ikke klart. I løpet av studiene på de tre nylig identifiserte Herv-H-relaterte gener [13], [14], [15] i vårt laboratorium, observerte vi at den samlede uttrykk for Herv-H elementer i tykktarmskreft var komplisert og forskjellig mellom tumorprøver og tilstøtende normale prøver. Vi har også observert at mange
env
-deleted Herv-Hs var transkripsjonelt aktive, og mange skjøtes ikke-kodende RNA ble transkribert i både tumor og normalt vev, så vel som kreft cellelinjer. I denne studien har vi startet den første studien å finne ut nøyaktig loci av de mest aktive Herv-H elementer i tykktarmskreft.
Resultater
RT-PCR-sekvensering strategi for hooking Herv -H ikke-kodende transkripter
Siden det er mer enn ett tusen medlemmer av Herv-H familie hele det humane genom, med sekvenser av lav kompleksitet og homologe med hverandre, er det vanskelig å studere deres transkripsjon profil ved tar hvert medlem i betraktning. For å profilere uttrykk for Herv-H i tykktarmskreft cellelinjer, kolon svulsten og tilstøtende normalt vev, og for å identifisere den eksakte loci av de mest aktive Herv-H elementer, har vi utviklet en RT-PCR-kloning strategi for å koble en utvalgt gruppe Herv-H-relaterte transkripsjoner. Transkripsjonen av Herv elementer blir typisk startet fra 5 «R region og avsluttes ved utløpet av den 3» R-regionen [16]. Vi har utformet primerne ved å referere til sekvensen av det Herv-H konsensus konstruert av Jern
et al.
[5], med den fremre primer er målrettet mot PBS-tRNA
His nedstrøms fra 5 «LTR og den reverse primer rettet mot den R-regionen i 3 «LTR (fig. 1A). Dette paret av primere skulle generere PCR-produkter fra Herv-H transkripsjoner av forskjellig størrelse. Derfor ble de totale RT-PCR produktene klonet i pGEM-T Easy vektorer og transfektert inn
E. coli
. Mer enn tretti kolonier av hver prøve ble tilfeldig valgt ut og plasmider ble deretter sekvensert. Sekvense resultater ble tildelt spesifikke Herv-H loci basert på private nukleotid forskjeller mellom de enkelte loci (en eller flere nukleotider som er karakteristiske for en Herv-H locus). Sekvense resultatene av alle de tilfeldig utvalgte kolonier indikerte at ingen innsatser var fra ikke-Herv-H transkripsjoner, demonstrerer vår strategi fungerte bra.
A. Skjematisk demonstrasjon av primer steder. TSS, transkripsjon start stedet; TTS, transkripsjon oppsigelse språk. B. RT-PCR ble utført for å påvise Herv-H skjøtes transkripsjoner i tykktarm kreft cellelinjer med /uten demetylering /histone acetylering behandling ved hjelp av DNA demetylering agenten DAC og histondeacetylase inhibitor TSA. H2O og genomisk DNA-blanding (gDNA blanding) ble anvendt som kontroller. Genomisk DNA blanding produsert band forskjellige fra cDNA prøvene, som ble omvendt transkribert fra DNase-behandlet RNA.
Uttrykk for Herv-H skjøtes transkripsjoner i tykktarmskreft cellelinjer, og endret uttrykk som svar på DNA demetylering behandling
RT-PCR-analyser ble utført på fem tykktarmskreft cellelinjer, inkludert HT29, LS 174T, RKO, SW480 og SW620. Forskjellige båndmønstre ble erholdt fra disse cellelinjer (Fig. 1B venstre). En forholdsvis lavere nivå av Herv-H-ekspresjon ble observert i RKO. Det har blitt rapportert at det er DNA-metylering ved et globalt genomisk nivå ved å målrette repetitive sekvenser [17], så vi videre undersøkt om demetylering behandling ville forandre transkripsjonsmønsteret Herv-H-elementer. Kreftceller ble behandlet med DNA-metylering og histondeacetylase inhibitorer (DAC og TSA henholdsvis). RT-PCR resultater viste at uttrykk mønstre av Herv-H ble vesentlig endret i SW480 og RKO celler (Fig. 1B høyre). Disse resultatene antydet at epigenetisk konteksten av et genom påvirket av noen av de Herv-H-elementer.
RT-PCR-produktet fra hver koloncancer-cellelinjen ble ytterligere analysert ved sekvensering etter kloning. Sekvense resultater ble tildelt genomisk loci av blat søk mot det menneskelige genom enheten (hg19). Genomiske DNA-sekvenser ble så trukket opp og analysert med RepeatMasker for å bestemme de Herv-H-sekvenser. Bare et begrenset antall Herv-H-elementene ble funnet å være transkripsjonelt aktive i hver av disse cellelinjer, med seks loci (syv elementer) i HT29 og to eller tre i hver av de andre cellelinjer (tabell 1).
Karakterisering av de aktive Herv-H elementene og deres skjøtes transkripsjoner i tykktarmskreft cellelinjer
Pair-kloke justeringer ble utført med 9,0-kb Herv-H konsensus bygget av Jern
et al.
for å bestemme de fragment-sletting av mønstre av hver Herv-H element. Justering Resultatene viste alle Herv-H elementer aktive i tykktarm kreft cellelinjer var strukturelt mangelfull, med den lengste er 6488 bp lang (tabell 1 og S1 fig.). Seks fragmenter ble funnet å være vanlige slettes i disse elementene, inkludert en kort en i
gag
region, fire i
pol
region, og nesten hele
env
region (fig. 2A). Det var noen unntak. Elementet ligger på 16q24.1 (aktiv i HT29) og den som ligger ved 22q11.1 (aktiv i LS 174T) var usedvanlig kort (Fig. 2B). Den på 16q24.1 var bare 3185 bp i lengde, med hele
gag
regionen og et stort fragment som omfatter
pol Hotell og
env
slettet. Den på 22q11.1 var 3842 bp lang, med nesten hele
pol Hotell og
env
regioner slettet. De fleste av de amplikonene (mer enn 90%) fra LS 174T inneholdt sekvenser som tilsvarer spleisede RNA fra 3,8-kb Herv-H element ved 22q11.1, hvorav de fleste (mer enn 60%) ble multiplisere skjøtes. Interessant, to Herv-H-elementer som ligger på 1p32.3 (2,8 kb adskilles) ble funnet å være aktive i HT29-celler, noe som gjør bruk av 5 «LTR av den første Herv-H og 3» LTR av det andre (representant transkripsjon sekvens JK017392). Sekvensanalyse viste at 5 «LTR manglet fra sistnevnte 2298-bp Herv-H element (Fig. 2C).
A. Skjematisk av de seks vanligste slettet regioner i de aktive Herv-H elementer i tykktarmskreft cellelinjer. B. Skjematisk av de to usedvanlig korte Herv-H elementene og deres transkripsjoner. Parvise justeringer for hver Herv-H element ble utført med Herv-H konsensus bygget av Jern P
et al
. De forkortede justerings Resultatene ble vist for å indikere de manglende regionene presist. Fargetetthet representerer graden av homologi med den Herv-H konsensus. Grå områder representerer slettet regioner i Herv-H-elementer, sammenlignet med den Herv-H konsensus. Skjøtes transkripsjoner er vist over justerings resultatene deretter. Tykke barer representerer eksoner, og linjene representerer introner. Regioner av LTR, pre-gag,
gag
,
pro
,
pol Hotell og
env
er merket nedenfor. C. Skjemaer av de to combinedly aktive Herv-H elementer plassert på 1p32.3 i HT29.
Flere Herv-H elementer var transkripsjonelt aktive i tykktarm svulst enn i tilstøtende normalt vev
Ekspresjon av Herv-H-transkripter i tykktarm tumor og tilstøtende normale vev ble analysert ved RT-PCR. Det ble observert en liten forskjell mellom de RT-PCR-produkter av tykktarm tumor og tilstøtende normale prøver, med enkelte produkter av større størrelser som er tilstede i tumorprøver (fig. 3). Etter sekvensering og sekvensanalyse av PCR-produktene ble 14 Herv-H-elementer funnet å være transkripsjonelt aktive i colon tumorprøver. I motsetning til dette ble bare 7 Herv-H-elementer funnet å være aktive i de tilstøtende normale tykktarm prøver. Detaljer om disse Herv-H-elementene ble angitt i tabell 2. Sekvensanalyse av parvis innretting mot Herv-H konsensus viste at alle de aktive Herv-H Elementene var strukturelt ufullstendig, med seks fragmenter som vanligvis slettet som antydet i fig. 2A (Fig. S2)
M, DL2000 stigen.; T, svulst; N, normal.
Fire Herv-H-elementer, som ligger ved 1q42.2, 16q24.1, 19q13.31 og 5q23.2 henholdsvis, var aktive i både svulsten og tilstøtende normalt vev . Vi videre analysert transkripsjon overflod fra hver aktiv Herv-H element. Interessant, tre av de vanligste aktive elementer (ligger på 1q42.2, 16q24.1 og 19q13.31) hver har bidratt til mer enn 10% av utskrifter i både svulsten og tilstøtende normale prøver. Det var et annet element, som ligger på 1p31.3, som produserer mer enn 10% av transkripsjoner i tumor. De fire mest aktive elementer i tumorprøve, det vil si de som ligger ved 1q42.2, 16q24.1, 19q13.31 og 1p31.3, i alt bidro til 68,89% av transkripter i tumorprøve. I motsetning de tre mest aktive elementer i normale prøver (ligger på 1q42.2, 16q24.1 og 19q13.31) bidro til 85,71% av de totale transkripsjoner. Resultatene indikerte at det var flere Herv-H elementer aktive i tykktarm tumorvev enn i tilstøtende normalt vev. Videre ble de fleste av vitnemål i tilstøtende normale prøver produsert fra færre Herv-H elementer sammenlignet med tumorprøver.
Diskusjoner
På grunn av den overflod av Herv-H elementer i det menneskelige genom og deres høy sekvenslikhet med hverandre, synes det ikke å være noen passende måte for å undersøke genom-wide transkripsjon profil Herv-H-elementer, mens på samme tid å ta hvert element i betraktning individuelt. Selv om funnene i denne studien ikke representerer den samlede faktiske genom-wide uttrykksprofil Herv-H elementer, tok vi nytte av PCR berikelse strategi for å koble de mest aktive Herv-H elementer som produserte transkripsjoner inneholder PBS-tRNA
Hans og 3 «R-regioner, og tilfredsstillende identifisert s provirale loci av disse elementene i tykktarmskreftcellelinjer og vevsprøver. Expression mønstre av Herv-H skjøtes transkripsjoner fra Herv-H elementene var annerledes blant kolon svulsten, tilstøtende normale prøver, og tykktarmskreft cellelinjer.
uttrykk mønstre av Herv-H skjøtes transkripsjoner fra Herv-H elementer var annerledes blant de fem koloncancercellelinjene som ble testet, vises av begge gelelektroforese av RT-PCR-produktene (fig. 1B til venstre) og sekvensering av amplikonene etter kloning (tabell 1). Sekvensanalyse ved å sammenligne dem med den konstruerte Herv-H konsensus indikerte at de aktive Herv-H-elementer som finnes i denne studien ble alle strukturelt ufullstendig i en viss grad. Dette kan også utledes fra lengder, som alle var mye kortere enn full-lengde Herv-H konsensus (9,0-kb). Bandet mønstrene var forskjellig mellom SW480 og SW620 celler. Selv om de stammer fra de primære og metastatiske svulster i samme pasient, kan denne forskjellen mellom SW480 og SW620 være bare på grunn av langvarig kultur. Likeledes kan det begrensede antall aktive Herv-H elementer i hver cellelinje også skyldes langsiktig kultur i definerte
in vitro
forhold. Det er også interessant at ved demetylering behandling ved hjelp av DNA metylering og histondeacetylase hemmere, uttrykk mønstre i RKO og SW480 celler ble vesentlig endret, noe som tyder på at transkripsjon av noen Herv-H elementer er regulert epigenetiske.
Selv om ingen åpenbar forskjell ble observert i RT-PCR-produktbånd mellom tumor og tilstøtende normale prøver, den totale tall og loci av aktive Herv-H elementene~~POS=HEADCOMP var signifikant forskjellige (figur 3;. tabell 2). Syv Herv-H-elementene ble funnet å være transkripsjonelt aktive i de tilstøtende normale tykktarm prøver. Til sammenligning ble 14 elementer funnet å være aktive i de testede kolon tumorvev. Ekspresjon av de tre vanlige mest aktive elementer (mer enn 10%) syntes å være vanlig; den som ligger på 1q24.2 produsert 17,78% og 26,19% av produktene i tumor og normale prøver, og produkter fra den ene ligger ved 16q24.1 besto av 26,67% i svulsten og 16,67% i normale prøver, henholdsvis. Interessant, den ene element ligger på 19q13.31 var den mest aktive i tilstøtende normale vev, som produserer 42,86% av produktene, mens bare 11,11% av tumorprøver tilhørte 19q13.31. Disse resultater viste at de fleste av de Herv-H skjøtes transkripter i tilstøtende normale tykktarm vev var fra 19q13.31, mens transkripter i tykktarmen tumorvev involvert flere elementer.
Alle aktive Herv-H-elementer som finnes i denne studien strukturelt ufullstendig, med seks fragmenter vanligvis slettet, som er distribuert gjennom
gag
,
pol Hotell og
env
regioner (figur 2A.); til og med så, noen av dem (40%) opprettholde mulige åpne leserammer (ORF) (tabell 1 og 2, Fig. S1 og S2). Selv om noen av disse mulige ORF er blitt underkastet sekvensere delesjon til en viss grad sammenlignet med den tilsvarende regionen i den Herv-H konsensus, syv av de antatte peptidsekvensene (kodet for av 6 Herv-H-elementer) inneholde konserverte domener, med ett konservert Protease domene, en konservert CREB5 (cAMP responselement-bindende protein 5) domene og fem konserverte revers transkriptase (RT)-lignende domener. Interessant, alle de tre vanlige mest aktive Herv-H elementer (plassert ved 1q42.2, 16q24.1 og 19q13.31) i tumor og normalt vev tilstøtende inneholde putative ORF med konserverte domener (Tabell 2, Fig. S2). Hvorvidt disse ORF faktisk produsere proteiner i tykktarm vev og hvilken rolle de spiller i kolon kreftutvikling er saker som skal behandles.
Grunnen til transkripsjons forskjellen i Herv-H elementer mellom kolon svulsten og nærliggende normalt vev er ukjent. Celler i svulsten og tilstøtende normale prøver er forskjellige på mange aspekter. Colon tumorceller i en prøve er heterogene og omfatte flere faser av cellesyklusen, mens ikke-tumorceller er vanligvis i G0. Imidlertid har det ikke vært noen studier for å løse om HERVs er uttrykt i en cellesyklusavhengig måte ennå. Videre tumorceller er i en mer udifferensiert tilstand sammenlignet med ikke-tumorceller, som minner om tilstanden i embryonale celler. Ekspresjon av HERVs i en vev-spesifikk og utviklingsstadium-avhengig måte er blitt rapportert [18]. Herv elementer har også blitt funnet å være sterkt uttrykt i reproduktivt vev som testikler og morkake, som inneholder udifferensierte celler [5], [19]. Enten Herv-H-elementer er uttrykt i en differensiering avhengig måte, senere forårsaker forskjellen mellom tykktarm tumor og tilstøtende normale vev, må også undersøkes. Disse to punktene kan indikere retninger for videre studier på mekanismen som Herv-H elementene er ulikt regulert mellom kolon svulsten og nærliggende normalt vev.
Dette er det første forsøket på å studere egenskapene til uttrykk Herv-H skjøtes transkripsjoner i tykktarmskreft. Oppsummert våre resultater viste at uttrykk mønstre av Herv-H elementer skilte mellom tykktarmskreft cellelinjer og kan bli påvirket av demetylering behandling. Enda viktigere, våre funn viste at Herv-H uttrykk involverte mer aktive Herv-H elementer i tykktarm svulst enn i tilstøtende normalt vev.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
denne studien ble godkjent av etisk komité av Zhejiang University, og skriftlige samtykke ble innhentet fra alle pasienter som er involvert.
Vevsprøver, cellekultur og RNA forberedelse
Colon svulsten og tilstøtende prøvene normale vev var oppnås etter kirurgisk reseksjon i andre tilknyttede sykehus av Zhejiang University og lagret frosset ved -80 ° C til RNA ekstraksjon. Vevstyper (tumor eller normal) ble vurdert ved histologisk farging. Kreftceller ble oppnådd fra American Type Culture Collection og dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt kalveserum. Total RNA ble utarbeidet med Trizol reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens guide. RNA ble alltid behandlet med RQ1 RNase-fritt DNase (Promega) før cDNA syntese å eliminere genomisk DNA forurensning.
Demetyler behandling med DNA metylering og histondeacetylase hemmere
Celler ble behandlet med DNA-metylering -inhibitor 5-aza-2′-deoksycytidin (DAC; Sigma) og histondeacetylase-inhibitoren trichostatin A (TSA; Beyotime) som beskrevet [20]: initial behandling med DAC (200 nM) i 48 timer, med medikament og mediet erstattet 24 timer etter begynnelsen av behandlingen, etterfulgt av erstatning av medium inneholdende TSA (300 nM) i et ytterligere 24 timer. Total RNA fra legemiddelbehandlede celler eller ikke-behandlede celler ble isolert med Trizol reagent og behandlet med DNase før cDNA syntese.
revers transkripsjon-PCR (RT-PCR)
RNA ble revers-transkribert til cDNA ved hjelp av M-MLV revers transkriptase (Promega) i henhold til produsentens guide. PCR-analyser ble utført med
Taq
DNA polymerase (Promega) i reaksjonssystemer som inneholder 0,2 mikromol /L fremover og bakover primere hver. Thermal cycler parametre var 94 ° C 5 min, (94 ° C 30 s, 55 ° C 30 s, 72 ° C 90 s) × 36 sykluser, 72 ° C 10 min. PCR-produktene av hver celleprøve, ble PCR-produktblandingen av seks tumorprøver og PCR-produktblanding av seks hosliggende normale prøver renset med AxyPrep PCR oppryddings kit (Axygen), klonet inn i pGEM-T enkel vektor (Promega) og transfektert inn i
E. coli
bakterier. Over 30 kolonier fra hver celle prøve og 100 kolonier fra svulst eller prøver normale vev ble utsatt for Sanger-sekvensering. Mål av primerne er vist i fig. 1A og deres nukleotidsekvenser er som følger: forover (rettet mot PBS-tRNA
His): 5′-TGGTGCCGTGACTCGGAT-3 «, revers (målretting R region): 5′-GCTGAGTCCGAAAAGAGAGTC-3». Primerne ble utformet ved å henvise til den Herv-H konsensus konstruert av Jern
et al.
[5], med «G» i foroverprimeren modifiseres i henhold til genom-wide-sekvensanalyse på Herv-H-beslektet primer bindingsseter på vår egen (ikke vist).
Sekvensanalyse analyse~~POS=HEADCOMP
Sekvenser ble søkt med BLAT metode mot menneskelige genom hjelp av online-server (https://genome.ucsc.edu/cgi -bin /hgBlat? command = start). Sekvense resultater ble ekskludert dersom de sekvensene i-mellom prim hadde mer enn fem ulikheter til genomisk DNA. Genomiske DNA-sekvenser ble hentet fra det menneskelige genom enheten (hg19) på https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway. Sekvensene ble analysert med verktøyet RepeatMasker på https://www.repeatmasker.org/cgi-bin/WEBRepeatMasker å identifisere gjentatte elementer. Parvise justeringer ble utført med GeneDoc. ORF prediksjon ble utført ved hjelp av den elektroniske program ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html). Deretter antatte aminosyresekvenser ble sprengt mot ikke-redundante proteinsekvens database ved hjelp av den elektroniske BLASTP program (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Sekvens innsending
det er totalt 92 nukleotidsekvenser av de nylig identifiserte Herv-H skjøtes transkripsjoner har blitt deponert i dbEST med tiltredelse antall JK017330-JK017415 og JK475044-JK475049 (med 7 EST bibliotek tiltredelses antall LIBEST_027280 – 027 286).
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Pair-kloke justeringer for hver Herv-H element ble utført med Herv-H konsensus bygget av Jern P
et al
. De forkortede justerings Resultatene er vist for å indikere de manglende regionene presist. Fargetetthet representerer graden av homologi med den Herv-H konsensus. Linjene representerer slettet regioner i Herv-H-elementer, sammenlignet med den Herv-H konsensus. Røde rektangler viser de regionene der antatte ORF er næret, mens røde rektangler med tykke linjer angir ORF med konserverte domener. Regioner av LTR, pre-gag,
gag
,
pro
,
pol Hotell og
env
er merket nedenfor. Genomisk locus av hver Herv-H element er tilsvarende angitt på høyre side
doi:. 10,1371 /journal.pone.0029950.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Pair-kloke justeringer for hver Herv-H element ble utført med Herv-H konsensus bygget av Jern P
et al
. De forkortede justerings Resultatene er vist for å indikere de manglende regionene presist. Fargetetthet representerer graden av homologi med den Herv-H konsensus. Linjene representerer slettet regioner i Herv-H-elementer, sammenlignet med den Herv-H konsensus. Røde rektangler viser de regionene der antatte ORF er næret, mens røde rektangler med tykke linjer angir ORF med konserverte domener. Regioner av LTR, pre-gag,
gag
,
pro
,
pol Hotell og
env
er merket nedenfor. Genomiske lokuset av hver Herv-H element er tilsvarende angitt på høyre side. Antallet hvert element er vist til venstre som vist i Tabell 2.
doi: 10,1371 /journal.pone.0029950.s002 plakater (TIF)
Takk
forfatterne er takknemlige for Ms Heather Simkin for korrekturlesing av manuskriptet.
