Abstract
Denne studien er designet for å bestemme de biologiske effektene av romanen marine alkaloid analog 7- (4-fluorbenzylamino) -1,3,4,8-tetra [4,3,2-de ] kinolin-8 (1H) -on (FBA-TPQ) på menneske eggstokkreft celler for sin anti-tumor potensialet og de underliggende mekanismene som en roman kjemoterapeutisk middel. Menneske eggstokkreft celler (A2780 og OVCAR-3), og udødelig ikke-tumorigene menneskelige Ovarian Surface Epitelceller (IOSE-144), ble utsatt for FBA-TPQ for første cytotoksisitet evaluering (via MTS analysen kit, Promega). Den detaljerte
in vitro plakater (cellenivå) og
in vivo plakater (dyremodell) undersøkelser vedrørende antitumor effekter og mulige bakenforliggende virkningsmekanismer av forbindelsene ble deretter utført. FBA-TPQ som utøves potent cytotoksisitet mot human ovarian cancer A2780 og OVCAR-3-celler som en effektiv inhibitor av cellevekst og proliferasjon, mens utøve mindre effekt på ikke-tumorigene IOSE-144-celler. Ytterligere studie i den mer følsomme OVCAR-3 cellelinjen viste at det kunne potent induserer celleapoptose (Annexin V-FITC-analyse), G2 /M cellesyklus-stans (PI farging analyse) og også en doseavhengig inhiberer OVCAR-3 xenografttumorer « vekst på kvinnelig atymiske nakne mus (BALB /c, nu /nu). Mekanistiske studier (begge
in vitro Hotell og
in vivo
) viste at FBA-TPQ kan utøve sin aktivitet gjennom reaktive oksygen arter (ROS) -associated aktivering av død reseptor, p53-MDM2, og PI3K-Akt trasé i OVCAR-3 celler, som er i samsvar med
in vitro
mikromatriser (Human genome mikromatriser, Agilent) dataanalyse (GEO sjonsnummer: GSE25317). Som konklusjon oppviser FBA-TPQ signifikant anticanceraktivitet mot eggstokkreft celler, med minimal toksisitet overfor ikke-tumorigene humane IOSE-144-celler, noe som indikerer at det kan være et potensielt terapeutisk middel for ovariecancer
Citation:. Chen T, Xu Y, Guo H, Liu Y, Hu P, Yang X, et al. (2011) Eksperimentell terapi for eggstokkreft med syntetisk Makaluvamine Analog:
In Vitro Hotell og
In vivo
Anticancer Aktivitet og molekylære mekanismer for handling. PLoS ONE seks (6): e20729. doi: 10,1371 /journal.pone.0020729
Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 16 november 2010; Godkjent: 11 mai 2011; Publisert: 06.06.2011
Copyright: © 2011 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra One Hundred Talenter Program av den kinesiske Academy of Sciences, National Nature Science Foundation (30870513, 31070680 og 91029715), Ministry of Science and Technology i Kina (2007CB947100), Science and Technology Commission av Shanghai kommune ( 08391910800, 10391902100), National Science and Technology Major Project «Key New Drug Creation and Manufacturing Program» (2009ZX09102-114, 2009ZX09301-011), Science and Technology Commission av Xuhui District of Shanghai kommune (RCT201001, CRC2010002), direktør Stiftelsen INS (20090101), Food Safety Research Center og Key Laboratory av ernæring og metabolisme av INS, SIBS, CAS. R.Z. ble støttet delvis av National Institutes of Health /National Cancer Institute gir R01 CA112029 og R01 CA121211. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft, med om lag 5 prosent av kvinners kreft død, er nå den femte vanligste kreftformen i de amerikanske kvinner [1]. Omtrent 70% av alle ovarie kreftpasienter er diagnostisert til de mer avanserte stadier av sykdommen, noe som fører til en dårlig prognose [2], [3]. I løpet av de siste to tiårene, selv om 5-års overlevelse for eggstokkreft pasienter har blitt vesentlig forbedret på grunn av bruk av vellykket operasjon og utvikling eller optimalisering av tumorici-dal narkotika, fortsatt overlevelse lav, ca 30% [2] – [4]. Dermed er det et presserende behov for å utvikle nye terapeutiske midler som kan brukes til å behandle sykdommen.
Marine organismer er en rik kilde til potensielle blyforbindelser med unike farmakologiske egenskaper [5], [6]. Mange marine naturprodukter med romanen molekylære strukturer og ulike biologiske funksjoner har blitt rapportert i løpet av de siste tiårene [7]. Makaluvamines, en klasse av marine pyrroloiminoquinone alkaloider isolert fra svamper av slektene
Zyzzya
, har blitt rapportert å ha potent
in vitro Hotell og
in vivo
cytotoksisitet mot flere kreft hos mennesker cellelinjer, og denne aktivitet ble tilskrevet deres aktivitet som topoisomerase II-inhibitorer [8] – [14]. Flere andre makaluvamines har vist seg å forårsake direkte DNA-skade som fører til anti-tumoreffekter [6], [15].
Vi har syntetisert mer enn 40 nye makaluvamine analoger og systematisk undersøkt deres anticancer aktivitet i brystkreftcelle linjer. Våre data viser at den potente makaluvamine analog, FBA-TPQ kunne hemme tumorvekst gjennom aktivering av tumor-suppressorer, inhibering av onkogener, og aktivering av DNA-skade responsen [6], [16]. I den foreliggende rapporten, utvidet vi vår studie for å evaluere anti-tumor aktivitet av FBA-TPQ mot eggstokkreft celler og prøvde å ytterligere belyse de mulige virkningsmekanismer.
Resultater
in vitro
cytotoksisitet av FBA-TPQ til A2780 og OVCAR-3 celler ble først vurdert ved hjelp av MTS analysen (Promega). A2780 og OVCAR-3 og human eggstokk-IOSE144 (udødeliggjort ikke-tumorigene Ovarian Surface Epitelceller) celler ble eksponert for FBA-TPQ (se fig. 1A) i forskjellige konsentrasjoner i 48 timer. Levedyktigheten av A2780 og OVCAR-3-celler ble signifikant redusert, med IC
50 til 1780 nM (A2780) og 980 nM (OVCAR-3) (Fig. 1B). Eksponering for FBA-TPQ førte til en doseavhengige effekter på celleoverlevelse, hemme A2780 levedyktighet med 25,2%, 45,7% og 65,8%, mens hemme ovčar-3 celler levedyktighet med 33,9%, 56,7% og 73,7%, henholdsvis for 0,5, 1,0 og 2,5 mikrometer konsentrasjoner, henholdsvis (fig 1, p. 0,05). På den annen side, IOSE144 cellene var mye mindre følsomme for FBA-TPQ behandling, med en IC
50 mer enn 10 uM (figur 1B, p. 0,01). Eksponering for FBA-TPQ redusert levedyktighet IOSE-144-celler med 2,7%, 7,7% og 25,6%, henholdsvis, for 0,5, 1,0 og 2,5 uM-konsentrasjoner (Fig. 1B), som indikerer at FBA-TPQ har selektiv aktivitet overfor eggstokkreft celler. I tillegg FBA-TPQ hemmet A2780 og OVCAR-3-celler proliferasjon på en doseavhengig måte (fig. 1C og 1D), mens dets anti-proliferative effekter var mye mindre tydelig i de IOSE144 celler behandlet med de samme konsentrasjoner av FBA- TPQ (fig. 1E). Faktisk, FBA-TPQ signifikant hemmet A2780 og OVCAR-3-celler sprednings begynner ved 0,5 uM konsentrasjon (figur 1C og 1D, p. 0,05) mens det ikke var noen signifikant hemming i IOSE-144-celler ved noen av konsentrasjonene ( opp til 1 pM, fig. 1E, p 0,05). Disse data tyder på at FBA-TPQ kan selektivt hemme A2780 og OVCAR-3 eggstokkreft celle vekst og spredning mens utøve mindre potente effekter på ikke-tumorigene IOSE144 celler.
A, Kjemisk struktur og molekylær formel av FBA-TPQ ; B, Celleviabilitet (MTS) analyse av humane ovariekarsinom-celler (OVCAR-A2780 og 3) og nontumorigenic OSE-celler (IOSE144) etter en 48 timers inkubasjon med FBA-TPQ; C D . 0,05 ). De pro-apoptotiske virkninger var mer uttalt ved en konsentrasjon på 2,5 pM (apoptotiske indeksen økes til omtrent 600% i forhold til kontroll) (figur 2B, s . 0,01). For å konkludere, våre data viste at FBA-TPQ kan indusere betydelig apoptose i OVCAR-3-celler på en doseavhengig måte.
A, Apoptose av OVCAR-3-celler behandlet med serielle konsentrasjoner av FBA-TPQ for 24 timer; B Data oppsummering og analyse av den apoptotiske indeks (Q1 reflekterer nekrose, Q2 reflekterer sen apoptose, Q3 reflekterer friske cellepopulasjon ikke er påvirket av apoptose eller nekrose mens Q4 reflekterer tidlig apoptose). C, cellesyklus evaluering av OVCAR-3-celler behandlet med serielle konsentrasjoner av FBA-TPQ i 12 timer; D, av data analyse av celler som er presentert som prosent fordeling av en bestemt fase (*,
p
0,05 versus kontroll, **
p
0,01 versus kontroll, respektivt ). Dataene er representative for verdier fra minst tre uavhengige eksperimenter med lignende resultater.
Vi undersøkte også om FBA-TPQ har noen effekt på cellesyklusprogresjon i OVCAR-3 celler. For denne analyse ble redusert vi FBA-TPQ inkubasjonstid på 12 timer for å for å unngå de høye apoptose-induksjon. Som illustrert i fig. 2C og 2D, etter en 12-timers behandling, FBA-TPQ induserte en signifikant økning i antall celler i G
2 /M-fase ved 1500 nM (21,6% økning av kontroll, p 0,05) og 2,5 uM (30,0% økning av kontroll, p 0,05) konsentrasjoner. I tillegg FBA-TPQ behandling førte også til en betydelig økning i antallet av celler i S-fase på 2,5 uM konsentrasjon (figur 2D, p. 0,05). Som oppsummert i fig. 2D, FBA-TPQ forårsaket en samtidig, doseavhengig, reduksjon i antall celler i G0 /G1-fase (p 0,01). Tatt sammen, våre data tyder på at de inhiberende virkninger av FBA-TPQ på cellenes levedyktighet og vekst kan være forbundet med sin induksjon av apoptose og cellesyklus-stans.
I vårt tidligere arbeid, vi rapporterte at FBA-TPQ mai øve DNA-skade i brystkreftceller [6]; her undersøkte vi om FBA-TPQ kan indusere celle ROS stress og forårsake oksidativ skade på DNA i eggstokkreft celler. I denne analysen ble redusert vi inkubasjonstiden på nytt til 4 timer (for å unngå dempning ROS) mens økt serie konsentrasjoner på 0, 1,0, 2,0 og 3,0 uM (å fremstille hurtig ROS induksjon for å gripe tak i bildet). Som vist på fig. 3A og 3B, etter 4 timers inkubering, FBA-TPQ induserte en signifikant (p 0,05) doseavhengig økning i cellulær ROS produksjon i OVCAR-3-celler (figur 3B.). Basert på vår observasjon at FBA-TPQ kan indusere apoptose, vurderte vi mitokondriene trans-membranpotensialet (
ΔΨm
) spredning som en indikator på mitokondrie membran avbrudd og cellene gjennomgår apoptose. Ved hjelp av JC-1 fargestoff, observerte vi at FBA-TPQ behandling resulterte i en signifikant (p 0,05) doseavhengig
ΔΨm
spredning (doseavhengig reduksjon av JC-1-aggregater er angitt med redusert forhold mellom rød /grønn fluorescens intensitet) etter 24 timers eksponering (fig. 4A og 4B). Samlet utgjør disse resultatene gir bevis for at FBA-TPQ induserer forhøyet celle ROS produksjon og tap av mitokondrier membranpotensiale, initiere den endogene ROS stress utløst tidlig cellulær apoptose pathway
A . B, induserer FBA-TPQ dose -avhengig ROS stress i OVCAR-3-celler (A, den doseavhengige økning i ROS som antydet med CM-H
2DCFDA, B, oppsummert data som prosent i forhold til kontrollen). C, Western blot-analyse av cellulære proteiner ekspresjonsnivåer av den tilhørende vei, noe som indikerer FBA-TPQ kan ta effekter gjennom ROS-sammen, og PI3K-Akt-mediert /p53-MDM2-relaterte celle proliferasjon, apoptose og cellesyklusprogresjon forbundet pathway på ovčar-3 eggstokkreft cellelinjer etter 24 timers eksponering (ved 250,750 og 1000 nM konsentrasjoner).
A og B, fluorescens intensitet (JC-1 produserer rød fluorescens i mitokondriene som JC-1 -aggregates mens avgir grønn fluorescens når lekker inn i cytoplasma som JC-1-monomerer; fluorescens intensitet skift mellom grønt og rødt er proporsjonal med
ΔΨm
endring) verdier av JC-1 dye på bestemte eksitasjonsbølgelengdene og tilsvarende forhold av rød /grønn endring (% av kontroll) etter eksponering for FBA-TPQ i 24 t (*,
p
0,05 versus kontroll). C 0,05 versus kontroll; **,
p
0,01 versus kontroll) , og de tilsvarende kroppsvekt endringer under behandlingene (
p
0,05); E, Western-blot-analyse av proteiner (for mus xenograft tumorer etter FBA-TPQ behandling av 0, 1 eller 10 mg /kg dose) som er involvert i den FBA-TPQ-utløst, og PI3K-Akt mediert /p53-MDM2-beslektet sti.
for ytterligere å definere effekten av FBA-TPQ på celle apoptose, cellesyklusprogresjon, og spredning, undersøkte vi nivået av uttrykk for et panel av proteiner som er involvert i disse banene i OVCAR-3 celler (se fig. 3C). Etter en 24-timers behandling av FBA-TPQ (med konsentrasjoner på 0, 0,25, 0,75 og 1,0 uM), observerte vi en doseavhengig økning i ekspresjonen av cleaved- Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) og Caspase- 3, så vel som Bax, med en ledsagende doseavhengig reduksjon i Bcl-2. Vi videre undersøkt mulige mekanismene som er ansvarlig for den anti-proliferative og cellesyklusregulerende effekter av FBA-TPQ. Som ovenfor, evaluerte vi ekspresjonsnivået av forskjellige proteiner forbundet med proliferasjon og cellesyklusprogresjon, og observerte den nedregulering av Cdc25c, CyclinB1 og cyklinavhengig kinase (CDK) 1, som er ansvarlig for G2 /M fase overgang, og funnet en økning i ekspresjon av Rb, p21 og P27-proteiner, så vel som en reduksjon i den E2F1 protein, som alle er involvert i celle-proliferasjon (fig. 3C). Videre våre data viste at FBA-TPQ kan redusere ekspresjon og aktivering (indikert ved fosforylering) av Akt, så vel som dens oppstrøms kinase PI3K katalytiske subenhet PI3K-110α. Vi evaluerte ytterligere regulerende effektene av FBA-TPQ på p53, og fant at FBA-TPQ aktivert p53, med en tilhørende ned-regulering i MDM2 uttrykk (se fig. 3C), og øket spaltning av PARP og Kaspaser-3. Disse funnene indikerer apoptose og /eller anti-proliferative og cellesyklus inhibitoriske effekter. Som vist i fig. 3C, har vi også observert en doseavhengig opp-regulering av Fas, noe som indikerer at reseptoren død vei, sammen med p53 kan spille en viktig rolle i respons til FBA-TPQ og dens stimulering av ROS stress. Til sammen kan vi konkludere med at FBA-TPQ kan utøve sine
in vitro
effekter gjennom ROS-forbundet, og PI3K-Akt-mediert /p53-MDM2-relaterte celleproliferasjon, apoptose og cellecyklusprogresjonen forbundet trasé (fig. 5).
Vi etablerte OVCAR-tre tumor xenograft modell for å evaluere
in vivo
anti-tumor aktivitet av FBA-TPQ. Forbindelsen ble administrert 5 dager i uken i.p. i en dose på 1 mg /kg eller 10 mg /kg. Terapeutiske effekter ble evaluert ved å kontrollere tumorvekst. Som vist på fig. 4C, oppviser FBA-TPQ signifikant (p 0,01) tumorinhibering på en doseavhengig måte. Den betydelige tumorveksthemmende effekter begynte å bli synlig på den niende dag av behandlingen (p 0,05). Etter 18 dagers behandling, FBA-TPQ resulterte i 20,5% tumorvekstinhibering (sammenlignet med kontrollgruppen) ved den nedre /dose 1 mg kg, og 69,4% tumorvekst-inhibering ved den høyere /kg dose 10 mg (Fig. 4C , p 0,01). Dessuten, selv om musene som mottok kg dose på 10 mg /opplevde et mindre tap i kroppsvekt, var det ingen signifikant forskjell i kroppsvekt tap (P 0,05) mellom de tre gruppene, noe som indikerer at FBA-TPQ kan ha en akseptabel sikkerhetsprofil (fig. 4D).
for å validere
in vitro
funn om virkningsmekanismen til FBA-TPQ, vi videre undersøkt
in vivo
uttrykk nivå av proteiner som ble undersøkt i de dyrkede celler (fig. 4E). I samsvar med den
in vitro
data, de protein uttrykk mønstre i den behandlede xenograft tumorvev var hovedsakelig de samme som de cellulære observasjoner (se fig. 3C og fig. 4E), noe som bekrefter at anti-tumor-effekter av FBA-TPQ er, i det minste delvis formidlet gjennom induksjon av ROS stress og påfølgende mitokondrie sammenbrudd, noe som fører til forandringer i cellulære kaskader som er involvert i apoptose, celleproliferasjon og cellesyklusprogresjon.
diskusjon
Denne studien er den første til å systematisk undersøke roman syntetisk makaluvamine analog FBA-TPQ s
in vitro Hotell og
in vivo
anti-tumor effekter i eggstokkreft celler. Vi demonstrerte at FBA-TPQ utøver sin anti-canceraktiviteter på A2780 og OVCAR-3-celler ved inhibering av cellevekst og proliferasjon. Videre studier bruk den mer følsom OVCAR-tre cellelinje avslørt at det kan indusere celle apoptose og cellesyklus arrest. Slike funksjonelle utfall oppnås gjennom en kaskade av reaksjoner i disse banene, inkludert induksjon av cellulær ROS stress, døds reseptor aktivering og mitokondrie kollaps, og påfølgende regulering av p53-MDM2 og PI3K-Akt tilhørende veier.
I våre tidligere studier viste vi at FBA-TPQ er den mest potente makaluvamine analog med hensyn til induksjon av DNA-skade, apoptose, cellesyklus-stans og inhibering proliferasjon i brystkreftceller [6]. Men de mulige mekanismer som ligger til grunn for disse antitumoraktiviteter og forbindelsens potensiell anvendelse ved andre cancertyper hadde ikke blitt klarlagt. Fokuset i denne studien var å finne ut om FBA-TPQ kunne representere en lovende kandidat for fremtidig anti-kreft narkotika utvikling, og for ytterligere å belyse virkningsmekanismen (e) av handlingen.
Vi først observert at FBA- TPQ utøver betydelige cytotoksisitetstester og celleproliferasjonsprosesser hemming effekter mot A2780 og OVCAR-3 celler. Etterfølgende vurdering viste en doseavhengig effekt av FBA-TPQ på OVCAR-3-celler apoptose, og cellesyklusprogresjon (G2 /M fase cellesyklus-stans). Disse observasjonene ble videre støttet av uttrykk profilering av relaterte proteiner i OVCAR-3 celler ved hjelp av Western blotting. I et forsøk på å utforske den mekanismen (e) for underliggende de observerte biologiske aktiviteter av FBA-TPQ, fant vi at FBA-TPQ kan indusere celle ROS stress og påfølgende mitokondrie kollaps, noe som gir en potensiell forklaring på cascade utløse
in vitro
kreft effekter, inkludert apoptose. Deretter vurderte vi
in vivo
aktivitet av FBA-TPQ i OVCAR-3 eggstokkreft xenograft modell, og viste at FBA-TPQ igjen kan utøve potent tumorici-dal aktivitet, med opptil 69,4% tumorvekstinhibitering på den /kg dose 10 mg. Vi systematisk (begge
in vitro Hotell og
in vivo
) evaluerte sin underliggende mekanisme (r) av handlinger, og vår
in vivo
studier bekreftet at FBA-TPQ utøver sin potente anti-tumor effekter hovedsakelig ved å påvirke celledeling, indusere celle apoptose og cellesyklus arrest.
spalting av PARP og procaspase-3 er godt dokumenterte indikatorer for apoptose [18], [19]. Medlemmer av Bcl-2-familien, slik som Bcl-2 og Bax, er kjent kritiske regulatorer som er ansvarlige for celleoverlevelse /apoptose [20] – [22]. Vi har vist en doseavhengig spaltning av PARP og procaspase-3, så vel som en doseavhengig reduksjon i Bcl-2 /Bax forholdet i FBA-TPQ-behandlede celler og svulster, noe som gir bevis for at FBA-TPQ induserer apoptose. Basert på våre tidligere data som viser at FBA-TPQ kan fungere som en DNA-ødeleggende middel, vurderte vi ROS nivå i OVCAR-3 celler etter FBA-TPQ inkubasjon, som oksidasjon (sammen med metylering, depurinering og deaminering) forårsaket av ROS stress kan bidra til DNA-skader [23]. Faktisk, observerte vi en doseavhengig økning i det cellulære ROS nivå, samt en doseavhengig bortledning av mitokondriemembranen potensial. Siden tapet av mitokondriemembranen potensialet er ansett som et tidlig hendelse i apoptose [18], [24], kan vi konkludere med at FBA-TPQ utløser den observerte apoptose i ovčar-3 celler ved å fremkalle et forhøyet nivå av cellulær ROS, som fører til etterfølgende mitokondriemembranen kollaps [23], [24].
celler utnytte cellesyklus sjekkpunkter for å sikre riktig cellesyklus utførelse for å beskytte delende celler fra potensielt dødelig skade på DNA [25], [26]. Celler kan bli arrestert i G2 /M-fasen for å gjennomgå DNA-reparasjon eller apoptotisk celledød [26], [27]. For ytterligere å undersøke effekten av FBA-TPQ på cellesyklus-stans som et resultat av dens induksjon av DNA-skade, evaluerte vi dens modulering av ekspresjonen av viktige proteiner involvert i G2 /M-signalering, og det observert en reduksjon doseavhengig i uttrykket av CDC25C og CDK1 /Cyclin B1, hvis aktivering er nøkkelen for G2 /M progresjon [26], [28], [29]. Dette bekrefter at FBA-TPQ fremmer G2 /M arrest av OVCAR-3-celler etter ROS-indusert skade.
Aktivering av p53 er en stor virkningsmekanisme for mange DNA-ødeleggende midler [6]. Vi observerte en doseavhengig økning i mutant-p53 uttrykk i OVCAR-3 celler, som er konsistent med vår forrige rapport at celler svare på FBA-TPQ skade uavhengig av p53 status [6]. Vi har også observert nedregulering av MDM2 og en samtidig reduksjon i E2F1, og økt ekspresjon av Rb, p21 og p27 [30], [31], noe som indikerer at aktivering av p53-MDM2 tilbakekoblingssløyfe er sannsynligvis ansvarlig for FBA- TPQ behandling-indusert økning i apoptose og cellesyklus arrest og nedgangen i cellevekst og spredning i A2780 og OVCAR-3 celler. Den Akt signalveien spiller avgjørende roller i regulering av celleoverlevelse [32], [33]. Aktiveringen av Akt av PI3K (fosfoinositid-3-OH-kinase) kinase kan regulere transkripsjonelle faktorer som er ansvarlig for pro- og anti-apoptotiske proteiner, så vel som vekstfaktorer for å overleve som respons på ekstracellulære stimuli eller skade [32]. Fosforylert Akt (p-Akt) er rapportert å være i stand til å hindre den p53-avhengig apoptose og veksthemming ved fosforylering MDM2 [34]. Våre data viste en nedgang doseavhengig i p-Akt (og t-Akt) og dens oppstrøms aktivator PI3K (katalytisk subenhet) og en økning i Fas-(død reseptor), noe som tyder på at den FBA-TPQ stimulus -suppresses den PI3K-Akt (p-Akt) reaksjonsvei og fosforylerer MDM2 til å regulere ekspresjonen av vekstfaktorer (E2F1, Rb, p21 og p27, etc.) eller apoptotisk (PARP, Bcl-2, Bax og caspase-3, etc.) og cellesyklusrelatert (CDC25C, Cdk1 og Cyclin B1, etc.) proteiner, noe som resulterer i sammensatte vedvarende anti-kreft effekt
betraktning den høye dødeligheten av kreft i eggstokkene [1] -. [4], er det nødvendig å utforske nye agenter som kan fungere via nye virkningsmekanismer for å forbedre eggstokkreft terapi. Foreliggende studie antyder at den mest effektive makaluvamine analog, FBA-TPQ kan være en ny og lovende anti-eggstokkreft middel, i tillegg kan det fortrinnsvis og potente hemmere av eggstokkreft OVCAR-3 celle (men ikke ikke-tumorigen OSE celle) vekst. Ifølge vår
in vitro Hotell og
in vivo
data, mener vi at FBA-TPQ kan hemme ovarialcancer vekst ved å utløse Fas-relatert /ROS-forbundet, og PI3K-Akt mediert /p53-MDM2 relatert økning i mobilnettet apoptose og cellesyklus arrest og nedgangen i celleproliferasjon (fig. 5). Disse funnene ble bekreftet på proteinnivået i
in vitro Hotell og
in vivo
, og var i samsvar med vår microarray dataanalyse (se tekst S1, fig. S1, Bord S1, S2, S3 ), som FBA-TPQ utøver sin aktivitet hovedsakelig gjennom dens induksjon av ROS og DNA-skade, regulering av «pathway in cancer», «p53 signalveien» og «fosfatidylinositol signaleringssystem «(f.eks PI3K-Akt), samt dens negativt regulering av CDK (f.eks CDK1 og tilhørende CDC25C og CyclinB1).
i konklusjonen, vår studie viste at FBA-TPQ kan utøve potente cytotoksiske og celleproliferasjonsprosesser hemming effekter mot A2780 og OVCAR-3 celler. Med unntak for induksjon av apoptose, kan det også indusere cellesyklus-stans og hemme OVCAR-3 xenografttumorer vekst inn i ROS /død-reseptor-initiert, og PI3K-Akt mediert /p53-MDM2-relaterte celleproliferasjon og apoptose og cellesyklus progresjons forbundet baner (vist i fig. 5). Men den nøyaktige mekanisme (r) av forbindelsen, og hvorvidt den utøver de samme virkninger i andre tumorer typer er ennå ikke godt klarlagt. I fremtiden studien, sammen med våre tidligere rapporterte funn [6], vil sikkert forbedre vår forståelse om virkningsmekanismer av makaluvamine analog og vil også gi grunnlag for deres fremtidige kliniske utviklingen av FBA-TPQ som en roman anti -cancer agent.
Materialer og metoder
Komponenter og reagenser
Alle kjemikalier var alle analytisk kvalitet. FBA-TPQ var en slags gave fra professor Sadanandan Velu (UAB, Birmingham, AL, USA). Propidiumjodid (P4170) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, Missouri, USA). JC-1 fargestoff (5,5 «, 6,6′-tetraklor-1,1′, 3, 3»-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine jodid) (T-3186), TRIZOL-reagens og CM-H
2DCFDA [5- (and-6) -chloromethyl-2 «, 7»- dichlorodihydrofluorescein diacetate acetyl ester] (C6827) ble kjøpt fra Invitrogen-Molecular Probes Co (City, State, USA). Den CellTiter 96® AQ
ueous One Solution (G3580) Cell Proliferation Assay (MTS assay) kit ble kjøpt fra Promega Co., Ltd. (Madison, WI). DC-proteinanalysesettet (500-0113) ble oppnådd fra Bio-Rad (Hercules, CA, USA), og ECL-systemet pluss ble anskaffet fra Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, UK). Alle cellekultur forsyninger ble oppnådd fra Invitrogen-Gibco Co. (City, State, USA). Anti-human MDM2-antistoff ble oppnådd fra Calbiochem® av EMD Chemicals Inc. (Darmstadt, Tyskland), ble Caspase-3 (8G10) antistoff innkjøpt fra Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA), og den anti -humant β-aktin (AC-74) antistoff ble erholdt fra Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO). Anti-human p53 (SC-98), Fas (SC-8009), PI3K110a (SC-7189), PI3K85a (SC-423), AKT (SC-8312), p-AKT (SC-7985-R), PARP (H-250, SC-7150), Bax (SC-493), Bcl-2 (SC-509), Rb (SC-50), p21 (SC-817), p27 (SC-528), E2F1 (SC -193), CDK1 (SC-8395), cyclin B1 (SC-595), og CDC25C (SC-13138) antistoffer, sammen med alle sekundære antistoffer (anti-mus, anti-geit og anti-kanin immunglobulin G) ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA).
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og cellekultur
menneskelig ovarialcancer A2780 og OVCAR-3 celler og menneskelig eggstokkreft IOSE144 (Udødelig ikke- tumorigene Ovarian Surface Epitelceller) som opprinnelig ble hentet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Virginia) var gaver fra Dr. Jing Fang (institutt for Nutritional Sciences, Shanghai, Kina). Alle celler ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin i henhold til ATCC instruksjoner. FBA-TPQ ble oppløst i DMSO og deretter fortynnet i cellekulturmedium (under 0,1%, endelig inkubering konsentrasjon).
celleviabilitet Assay
cellevekst og levedyktighet ble bestemt ved MTS-analyse ved bruk av den CellTiter 96® AQ
ueous en løsning Cell Proliferation Assay kit (G3580, Promega). I korte trekk, 4 x 10
3-celler (pr brønn) ble sådd ut i 96-brønners plater og ble enten behandlet i 48 timer med FBA-TPQ (oppløst i DMSO 0,1%, sluttkonsentrasjon) ved serie konsentrasjoner (0 , 100, 500, 750, 1000, 1500 og 2500 nM), eller ble behandlet i forskjellige tidspunkter (0, 24, 48 og 72 hr) med FBA-TPQ i konsentrasjoner på 0, 500, 750 og 1000 nM. Etter 24~72 timers behandling, ble 20 ul av MTS-løsning tilsatt til hver brønn. Platene ble inkubert i ytterligere 2~4 timer ved 37 ° C, hvoretter absorbansen ved 490 nm ble målt ved anvendelse av en SpectraMax
190 mikroplateavleser (Molecular Devices, USA) for å beregne celleoverlevelsesprosentene.
Påvisning av apoptose
Cell apoptose ble oppdaget via en Annexin V-FITC kit kjøpt fra BioVision, Inc [6], [17]. I korthet, en x 10
6-celler ble sådd ut i 6-cm skåler og behandlet med testforbindelsen (FBA-TPQ) ved 0,5, 1,5 og 2,5 uM i 24 timer før analyse. De flytende og trypsinert adherente celler ble samlet og fremstilt for påvisning i henhold til produsentens instruksjoner. Prøvene ble analysert med en FACSAria ™ flowcytometer (Becton Dickinson, USA) etter inkubering i mørke ved romtemperatur i 5 min. Celler positive for tidlig apoptose (Annexin V-FITC farget bare se Q
4 i figur 2A) og for sent apoptose (Annexin V-FITC og PI farget, se Q
2 i figur 2A) ble kombinert.
Cell Cycle Analysis
propidiumjodid (PI) farging ble utført for å fastslå effekten av FBA-TPQ på cellesyklusen [6]. I korte trekk, 6 x 10
5-celler som ble sådd ut i 6-cm skåler ble eksponert for FBA-TPQ (ved 0, 0,5, 1,5 og 2,5 uM) og inkubert i 12 timer forut for analyse. Cellene ble trypsinert, vasket med PBS og fiksert i 1 mL 70% etanol (700 pl 100% etanol tilsatt til 300 ul PBS) ved 4 ° C over natten, etterfulgt av sentrifugering (3000 rpm, 5 min), inkubering med RNase (100 ug /ml) og farging med propidiumjodid (50 ug /ml) i 15 minutter i mørket. DNA-innholdet ble analysert av en Cell Lab Quanta ™ SC flowcytometer (Beckman Coulter, USA).
Måling av reaktive oksygen arter (ROS)
Produksjonen av ROS ble målt ved bruk av 5- (og-6) -chloromethyl-2 «, 7»- dichlorodihydrofluorescein diacetat acetyl-ester (CM-H2DCFDA). I korthet Celler (~ 7 x 10
5) ble sådd ut i 6-cm skåler og utsatt for FBA-TPQ i 4 timer ved serie konsentrasjoner (0, 1,0, 2,0 og 3,0 uM), hvoretter cellene ble høstet og vasket med PBS en gang og deretter inkubert med 5 uM CM-H2DCFDA (i DMSO) i 30 minutter ved 37 ° C i fenol-rød-fritt RPMI 1640-medium.
