Abstract
Bakgrunn
regulering av apoptose i henhold basal (ikke- stress) forhold er avgjørende for normal utvikling hos pattedyr, og også for normal cellulær omsetning i ulike vev gjennom hele livet. Mangelfull regulering av basal apoptose, eller dets forstyrrelse, kan resultere i nedsatt utvikling og /eller sykdomstilstander omfattende kreft. I motsetning til stress-fremkalt apoptose reguleringen av apoptose i henhold basale betingelser er dårlig forstått. For å løse dette problemet har vi sammenlignet basal- og stress-indusert apoptose i humane epitelceller normale og kreft opprinnelse. For dette formålet vi fokusert vår studie på opposisjonelle pro-apoptotiske JNK /anti-apoptotiske NFkB veier.
metodikk /hovedfunnene
Kombi RNAi pluss genet knockout ble ansatt for å få tilgang til og kartlegge basal regulatorisk pathways av apoptose. Følg-on, inngående analyser inkludert eksogene uttrykk for fosforylering mutanter og kromatin immunoprecipitation. Vi viser at basal apoptose blir konstitutivt trykkes av JNK2 i et utvalg av humane kreftcellelinjer. Denne effekten ble ikke observert i ikke-cancerceller. Dempe JNK2 av RNAi resulterte i JNK1-avhengig apoptose av cancerceller via oppregulering av AP-en faktor c-juni Uventet oppdaget vi at JNK1 og c-Jun fremme basal apoptose i fravær av «aktiverende phosphorylations» vanligvis indusert av stress. Hypo-fosforylert c-Jun akkumulert til høye nivåer etter JNK2 stanse, auto-reguleres sitt eget uttrykk og undertrykkes uttrykk for BCL-3, en uvanlig IkB protein og regulator av NFkB. Basal apoptose ble formidlet av komponenter av TNFa svar veien, men var mekanistisk forskjellig fra TNFa-indusert apoptose.
Konklusjon /Betydning
Våre resultater viser at mekanistisk forskjellige mekanismer operere for å regulere apoptose i pattedyrceller i henhold til basal (fysiologisk) mot stressinduserte betingelser. Vi beskriver også en ny apoptotisk nettverk som styrer den basale overlevelse av kreftceller. Slik informasjon er viktig for å forstå normal celle omsetning i pattedyr utvikling og senere gjennom hele livet. Denne informasjonen åpner også nye muligheter for terapeutisk intervensjon i menneskets proliferative sykdomstilstander inkludert kreft
Citation. Ahmed SU, Milner J (2009) Basal Cancer Cell Survival Innebærer JNK2 Undertrykkelse av en roman JNK1 /c-Jun /Bcl -3 apoptotisk Network. PLoS ONE 4 (10): e7305. doi: 10,1371 /journal.pone.0007305
Redaktør: Andreas Bergmann, University of Texas MD Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 10. august 2009: Godkjent: 07.09.2009; Publisert: 06.10.2009
Copyright: © 2009 Ahmed, Milner. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble støttet av en Yorkshire kreftforskning kjerne forskningsprogram prisen til JM. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
c-jun N-terminale kinaser (JNKs) er medlemmer av mitogen-aktivert protein kinase familien (MAP kinaser, MAPK) og aktiveres som reaksjon på cellulært stress [1], [2]. Som svar på stress JNK1 og JNK2 aktiveres via dual fosforylering av T183 og Y185 av MAPK kinaser (MAPKK), spesielt MKK4 og MKK7 [3], [4]. MAPK og MAPKKs utgjør en del av et signal transduksjon superfamilien som omfatter de ekstracellulære signalregulerte kinaser (ERK) og p38 MAPK. Funksjonene til JNK1 og JNK2 er bestemt av celletype og av arten av den spenning er ansvarlig for deres aktivering. Innledende studier identifisert JNKs ved deres evne til å fosforylere den N-terminale ende av c-Jun, et medlem av den aktiverende protein 1 (AP-1) transkripsjonsfaktor familie [5]. Deretter JNKs ble vist å fosforylere og regulere aktiviteten av andre AP-1-proteiner, så vel som flere proteiner involvert i celle-proliferasjon og apoptose, inkludert p53, c-Myc, Bcl-2 og Bim [2], [6].
AP-1 faktorer er en gruppe av strukturelt og funksjonelt beslektede medlemmer av juni proteinfamilie (c-Jun, JunB og JUND) og Fos proteinfamilie (c-Fos, FosB, fra-1 og fra-1) [7]. Dimeriserende innenfor disse familiemedlemmene danner en AP-en transkripsjonsfaktor og den relative overflod av individuelle AP-1 underenheter og dimer sammensetning er viktige faktorer som bestemmer celle skjebne. Repertoaret av AP-en dimer sammensetning tillater skreddersøm av et AP-1-mediert reaksjon av private celletyper til en gitt stimulus. Post-translasjonell modifikasjon og protein turnover er to mekanismer for regulering av AP-1-aktivitet. For eksempel, som respons på stress den trans potensialet av c-Jun aktiveres av JNK-mediert N-terminal fosforylering [8], [9], mens stabiliteten av c-Jun-proteinet er nedregulert via GSK-3-mediert C-terminal fosforylering som er rettet mot c-Jun for ubiquitinylation og degradering via E3 ligase Fbw7 [10].
en viktig aktivator av JNK-apoptotiske reaksjonsveien er tumornekrosefaktor α (TNF-alfa), et pro-inflammatorisk cytokin som regulerer celleoverlevelse via fremme enten celleproliferasjon eller apoptose [11]. TNFa i inngrep med sin trimere reseptor, TNFR1, på den ytre overflaten av cellemembranen. TNFa /TNFR1 interaksjons resulterer i dannelse av en intracellulær heterogene protein kompleks (kompleks 1) på cytoplasmatiske hale av TNFR1. I sin tur dette komplekset fører til aktivering av JNK og også av IKB-kinase (IKK). Elegant studier
in vitro Hotell og
in vivo
har vist at i hepatocytter utsatt for TNFa, aktivert JNK1 fosforylerer og aktiverer E3 ubiquitin ligase ITCH [1], [12]. Aktivert ITCH induserer ubiquitinylation og nedbrytning av cFLIP (mobil FLICE-hemmende protein) som ellers spesifikt hemmer aktivering av pro-caspase 8 (også kalt FLICE). Caspase 8 aktivering resulterer i apoptose [1], [10]. Denne pro-apoptotiske veien er mot balansert NFkB som opp-regulerer c-FLIP uttrykk og dermed hemmer pro-caspase 8 aktivering og apoptose [13].
NFkB er en transkripsjonsfaktor som består av homo- eller heterodimerer av medlemmer av Rel familien av proteiner, inkludert p65 (rela), relB, c-Rel, P50 og P52 (oversikt i [14]. transkripsjonsaktiveringsdomener er fraværende i p50 og P52 som således må danne heterodimerer for å transactivate målrette gener. hoved~~POS=TRUNC forsamlingen~~POS=HEADCOMP er en heterodimer av p65-p50, men forskjellige dimer sammensetninger dannes også. NFkB er underlagt regulering av protein-protein interaksjoner med IkB proteiner. IκBα og IκBβ fortrinnsvis rettet mot p65-P50 heterodimerer. Fosforylering av IKB av IKB kinaser utløser IKB degradering med utgivelsen av dimer NFkB som translocates inn i kjernen og regulerer genuttrykk. BCL-3 er en uvanlig IkB som fortrinnsvis binder p50-p50 og P52-P52 NFkB homodimerer [15], [16]. BCL-3 er lenger skilles fra andre IkB proteiner i at det kan lokalisere til kjernen, er det ikke degradert ved aktivering av NFkB og det har syv, i stedet for seks, ankyrin vendende domener. Nukleær lokalisering av Bcl-3 er forenlig med dens evne til å danne et ternært kompleks med DNA-bundet P50: P50 homodimerer av NFkB, og også for å hjelpe til opptak av p50 inn i kjernen (se [17] og referanser deri). BCL-3 ble først beskrevet i B-celle kronisk lymfatisk leukemi [18] og regnes som en antatt oncoprotein.
I tillegg til sine roller i stressresponsen JNK1 og JNK2 også arbeide under basal, non-stress vilkår som dokumentert av vevsspesifikke abnormaliteter observert i JNK1 – /- og JNK2 – /- mus. For eksempel JNK1 – redusert mus utstillings T-celledifferensiering og defekt immunitet [19] – /. Viktigere JNK1 – /- mus også utvikle spontane tarmsvulster, noe som indikerer at JNK1 fungerer som en tumor suppressor for vevstype [20]. Men mekanismene for JNK1 og JNK2 fungerer i henhold basal, fysiologiske forhold er dårlig forstått.
For å undersøke de enkelte rollene JNK1 og JNK2 i humane epitelceller henhold basale forhold vi ansatt en kombinasjon av (i) RNAi indusert i fravær av påført belastning, (ii) gene knock-out cellelinjer, og (iii) eksogent gen ekspresjon. I en rekke humane cellelinjer vi oppdaget at JNK1 er aktivt pro-apoptotiske men er konstitutivt inhiberes ved nærværet av JNK2 i kreftceller. Denne effekten ble ikke observert i ikke-cancerceller. Co-tie eksperimenter viste at disse basale, motstridende pro- og anti-apoptotiske funksjonene JNK1 og JNK2 er i stor grad uavhengig av up-stream kinaser MKK4 og MKK7. Dette var i samsvar med mangel på merkbar endring i JNK1 fosforylering tross JNK1 avhengig apoptose etter uttømming av JNK2. Ytterligere eksperimenter viste at den basale JNK1 pro-apoptotiske reaksjonsvei involverer c-Jun pluss komponentene av TNFa-responsive MAP kinase pathway kombinert med NFkB vei via c-Jun-mediert nedregulering av Bcl-3. Således basal regulering av kreftcelleoverlevelse ser ut til å være avhengig av de motstående funksjoner av JNK2 /Bcl-3 (Pro-overlevelse) og JNK1 /c-Jun (pro-apoptotiske) og for å være under konstitutiv kontroll av JNK2.
Resultater
Selektiv knock-down av JNK2 forbedrer JNK1 uttrykk
for RNAi vi ansatt syntetiske sirnas under forhold som tidligere vist seg å gi effektiv knock-down av målet mRNA uten aktivering av p53 mobil stressrespons [21], [22]. RNAi kontroller inkludert BCR-ABL siRNA, som ikke har noen mRNA-mål i epitel-celler, og derfor tjener som en ikke-funksjonell siRNA kontroll, og lamin A /C siRNA, som retter seg mot lamin A /C-mRNA og tjener som en funksjonell siRNA kontroll (Methods ). Selektiv knock-down av JNK1 og JNK2 mRNA ble gjengitt med to ulike siRNAs for hvert mål (Metoder og S1 fig.). Effektiviteten av mRNA knock-down ble bestemt ved kvantitativ PCR og var lik for både JNK1 og JNK2 (ca 75% reduksjon, jf. Figur 1A for JNK1 mRNA nivåer). RNAi-indusert stanse av Lamin A /C eller JNK1 fremkalte ikke noen endring i p53 eller p21
WAF1, en p53-avhengig target genet (Fig. 1B for JNK1 siRNA og fig. S2 for Lamin A /C siRNA) , noe som bekrefter at vilkårene i RNAi
per se
du ikke starte en p53 stressrespons. Imidlertid JNK2 stanse resulterte i en ~3 ganger økning i p53-protein (fig. 1B) hvilket antyder at JNK2 direkte eller indirekte regulerer omsetningen av p53-protein. Dette er konsistent med den rapport som JNKs kan regulere den basale omsetning av p53 [23]. Interessant, co-stanse av JNK1 med JNK2 avskaffet økning i p53 (Fig. 1B) antyder at JNK1 og JNK2 utøve koordinerte effekter på omsetningen av p53.
(A) JNK1 mRNA nivåer, og ( B) JNK1, JNK2, og også p53 og p21 protein nivå bestemmes 48 timer etter transfeksjon med JNK1- og JNK2-sirnas som indikert (Methods). (C) Fase kontrast av HCT116 cellene 48 timer etter transfeksjon med JNK1- og JNK2-sirnas. (D) Apoptose bestemmes av annexin V merking av siRNA-behandlede celler i forhold til ubehandlede kontroller i en rekke humane cellelinjer (Methods. Merk: apoptose resultatene er representative for minst tre gjentatte eksperimenter med mindre feilfelt er inkludert for gjentatt analyser av en enkelt eksperiment). (E) caspase 8 og dets spaltningsprodukter, aktivert caspase 7 og effektor caspase 3 følgende RNAi-mediert stanse av JNK1 og JNK2 som angitt. Actin = lasting kontroller. HCT116 p53 + /+ og HCT116 p53 – /- er isogene kloner av menneskelige HCT116 tykktarmskreftceller (metoder)
Uventet, i HCT116 kolorektal kreft celler JNK2 knock-down konsekvent resulterte i en -50%. økningen i JNK1 mRNA nivåer og en ~3 ganger økning i JNK1 protein nivåer (fig. 1A og 1B). Lignende resultater for JNK1 mRNA ble oppnådd i isogene HCT116 p53
+ /+ og HCT116 p53
– /- celler (Fig. 1A og 1B), noe som indikerer at effekten er p53-uavhengig. Således, i HCT116-celler, tilstedeværelse av JNK2 direkte eller indirekte undertrykker basal JNK1 ekspresjonsnivåene.
JNK2 knock-down induserer apoptose
Knock-down av JNK2 resulterte i apoptose i en rekke kreft cellelinjer inkludert HCT116-celler (fig. 1C og 1D). Apoptose ble bestemt av annexin V farging (Methods) og involvert pro-caspase 8 aktivering og effektor caspases 3 og 7 (Fig. 1E). Denne apoptotiske virkning av JNK2 uttømming var uavhengig av p53 som vist ved HCT116 p53 – /- celler (Fig. 1C og 1D). I ikke-kreftceller JNK2 lyddemping ikke indusere apoptose (ARPE19 og MCF10A epitelceller, og WI-38 fibroblaster) til tross for effektiv JNK2 mRNA knock-down (Fig. 1D og data ikke vist). I motsetning til JNK2 stanse, gjorde stanse av JNK1 ikke påvirker levedyktigheten i noen av cellelinjene som ble testet (fig. 1C og 1D). Samlet indikerer disse resultatene at JNK2, men ikke JNK1, er avgjørende for basal levedyktighet i en rekke humane kreftcellelinjer, inkludert MCF7 brystcancer epitelceller, men er unnværlig for basal levedyktigheten av ikke-cancerceller inkludert MCF10A bryst epitelceller.
Apoptose er JNK1 avhengig
neste co-forstummet JNK1 med JNK2 for å undersøke deres funksjonelle sammenhengen i reguleringen av kreft celle overlevelse. I alle tilfeller der JNK2 lyddemping indusert apoptose fant vi at samtidig stanse JNK1 med JNK2 reddet JNK2 fattige celler fra apoptose (Fig. 1 D). Dermed kan vi konkludere med at JNK1 og JNK2 mot-balansere hverandre i opprettholdelsen av kreftcellelevedyktighet og som JNK2 konstitutivt undertrykker JNK1-mediert apoptose i henhold til basale betingelser.
JNK1-avhengig apoptose er uavhengig av forbedret JNK1 S63 /73 fosforylering
De ovenfor angitte resultater indikerer at JNK1 er primet for å indusere apoptose i humane epiteliale kreftceller, men er konstitutivt trykkes av JNK2. Både JNK1 og JNK2 er nedstrøms formidlere av MAP-kinase apoptotiske sti og aktiveres som reaksjon på stress ved MKK4 og /eller MKK7 fosforylering på T183 /Y185 (Innledning). Vi neste forhold JNK1 og JNK2 fosforylering etter basal (RNAi) og stress-indusert (UV eller TNF-alfa) forhold.
Som forventet UV-bestråling indusert sterk fosforylering ved restene T183 /Y185 av både JNK1 og JNK2 proteiner i HCT116 cellene (fig. 2A). Tilsvarende behandling av HCT116-celler med TNFa også indusert JNK1 og JNK2 fosforylering på T183 /Y185 (Fig. 2B, øvre panel). I dette siste tilfelle JNK1 fosforylering dominerte løpet JNK2 fosforylering. Disse resultatene viser klart fosforylering av JNK1 og JNK2 som reaksjon på genotoksiske spenning (UV) og til reseptor-mediert spenning (TNFa) i HCT116-celler. Både UV-bestråling og TNFa indusert apoptose (data ikke vist)
(A) Sammenligning av JNK1 /JNK2 fosforylering status i kontroll, JNK2-forstummet og etter UV-bestråling (HCT116-celler, metoder).. p-JNK1 = fosforylert JNK1, pJNK2 = fosforylert JNK2 (pilen). (B) Effekter av TNFa på fosforylering status for JNK1, JNK2 og c-Jun. (C) Co-tie c-Jun med JNK2 redder HCT116-celler fra apoptose (annexin V merking Methods). (D) JNK1, JNK2 og c-Jun protein nivåer 48 timer etter RNAi-mediert stanse av JNK2 og c-juni P53 og P21 proteinnivåer er også vist. (E) c-Jun mRNA nivåer etter JNK1 og JNK2 lyddemping. (F) Brett økning i c-Jun mRNA nivåer i HCT116 cellene sammenlignet med ARPE19 celler 48 timer etter JNK2 lyddemping. (G) Knockdown av c-Jun mRNA og proteinnivåer i HCT116 p53 + /+ celler etter c-Jun siRNA behandling.
Under basale forhold, når JNK1 var aktivt pro-apoptotiske følgende JNK2 stanse det var ingen merkbar økning i JNK1 T183 /Y185 fosforylering (fig. 2A, sammenlign kontroll kjørefelt med JNK2 siRNA kjørefelt). Dette er i slående kontrast til stressrelaterte tilstander (Fig 2A. Sammenligne JNK2 siRNA kjørefelt med UV kjørefelt). Således utleder vi at JNK1 er i stand til å fremme apoptose i fravær av å «aktivere» T183 /Y185 phosphorylations som er karakteristisk indusert som reaksjon på stress. Co-tie oppstrøms kinaser MKK4 eller MKK 7 med JNK2 bare delvis reddet JNK1-avhengig apoptose (Fig. S3), noe som ytterligere underbygger den evne JNK1 å fremme apoptose i fravær av forbedrede T183 /Y185 phosphorylations.
Vi konkluderer med at under basale forhold, kan JNK1 aktivt fremme apoptose uten gjennomgår forbedret T183 /Y185 fosforylering karakteristisk for den cellulære stressrespons. Dette basale pro-apoptotiske funksjon av JNK1 er tydelig i humane epiteliale kreftceller (men ikke i ikke-cancerceller) og er konstitutivt inhibert av endogen JNK2. For å undersøke basal apoptotiske sti henhold JNK1 kontroll vi neste gjennomført en rekke samarbeid stanse forsøk med sikte på å identifisere viktige pro-apoptotiske meglere knyttet til den JNK1 avhengige apoptose følgende JNK2 lyddemping.
c-Jun er en viktig formidler av basal apoptose og er underlagt motstridende effekter av JNK1 og JNK2
for å be om c-Jun er nødvendig for apoptose etter basale forhold vi co-forstummet c-Jun med JNK2 (figur 2;. effektiviteten av c-Jun mRNA knockdown er vist i fig. 2G). Resultatene viser tydelig at c-Jun co-lyddemping redder JNK2-forstummet HCT116-celler fra apoptose dermed identifisere c-Jun som en viktig formidler av apoptose lagt JNK2 undertrykkelse henhold basale forhold (Fig. 2C).
c-Jun protein akkumulert til høye nivåer følgende JNK2 stanse i HCT116-celler (figur 2D,. økt c-Jun ble også observert i RKO og Løvø celler etter JNK2 stanse, ikke vist) Parallelt med en økning i c-Jun mRNA (fig. 2E). Interessant nok var denne effekt opphevet når JNK1 ble ko-stilnet med JNK2 (fig. 3A til c-Jun-proteinet og Fig. 2E for c-Jun mRNA) som indikerer at oppregulering av c-Jun er avhengig av den fortsatte tilstedeværelsen av JNK1 . JNK1 tie alene forårsaket en reduksjon i c-Jun mRNA og protein (fig. 2E og S4 fig.). Disse kombinerte observasjoner tyder på at JNK1 og JNK2 utøve motstridende effekter på c-Jun uttrykk og at JNK1 er nødvendig for vedlikehold av basale c-Jun mRNA og protein uttrykk nivåer, mens JNK2 konstitutivt undertrykker c-Jun mRNA og protein uttrykk nivåer. Lignende resultater ble observert i HCT116 p53
+ /+ og HCT116 p53
– /- celler (se for eksempel figur 2E.). Interessant økte c-Jun mRNA-nivåer ble ikke observert i JNK2-stilnet ARPE19-celler (fig. 2F) var i overensstemmelse med mangel av apoptose i disse celler (Fig. 1D).
(A) Totalt c-Jun-protein og phosphorylations på S63, S73 og T91 følgende enten UV-bestråling (høyre fil) eller JNK1 og JNK2 RNAi-indusert stanse. (B) Skjematisk viser
c-Jun
og amplicon brukes for å påvise c-Jun på arrangøren. (C) Totalt og fosforylerte former for c-Jun bundet på c-Jun arrangøren oppdaget av kromatin immunoprecipitation (chip) med c-Jun og c-Jun phospho-spesifikke antistoffer. Histogram viser fold-berikelse i forhold til IgG kontroller (metoder).
Våre resultater identifisere motstridende effekter av JNK1 og JNK2 på c-Jun. I dette henseende skiller de seg fra observasjoner oppnådd ved bruk av en «kjemisk genetikk framgangsmåte hvori den katalytiske ATP-bindende lomme av JNK2 ble utvidet ved mutasjon [2]. Konklusjonen fra dette sistnevnte tilnærmingen var at JNK1 og JNK2 både positivt regulere c-Jun uttrykk. Det er imidlertid mulig at en utvidelse av den ATP-bindende lomme av JNK2 kan forstyrre den romlige molekylære organisasjon av det tilstøtende β-tråd-lignende region av JNK2 protein. Siden β-strand-lignende domene er viktig for JNK2 protein-protein interaksjoner foreslår vi at lokaliserte forstyrrelse på dette nettstedet kan kompromittere bindings kjennetegn JNK2 protein for sine mål underlag. Dette kan påvirke funksjonen til mutant JNK2 på måter ytterligere til den anslåtte effekter på molekylær tilgang til den utvidede ATP bindende lommen på JNK2
En annen studie som sammenlignet murine fibroblaster avledet fra JNK1 -. /- Og JNK2 – /- mus indikerte at JNK1 og JNK2 kan fungere som motstridende regulatorer av c-Jun [3]. Våre egne resultater under basale betingelser, er i samsvar med denne rapporten, og viser at i HCT116-celler (i) JNK2 Silencing fører til oppregulering av c-Jun-mRNA fulgt markert akkumulering av c-Jun-protein, og (ii) oppregulering av c-Jun under disse betingelser er avhengig av JNK1.
oppregulering av JNK1 i JNK2-utarmet cellene er uavhengig av c-Jun
Gitt at basal oppregulering av c-Jun (i JNK2-utarmet celler) krever JNK1 (se ovenfor) vi lurte på om c-Jun, i sin tur, er nødvendig for oppregulering av JNK1 protein følgende JNK2 lyddemping (fig. 1B). Men økningen i JNK1 konsekvent observert i JNK2-forstummet celler var upåvirket ved samtidig stanse c-Jun med JNK2 (figur 2D,. Øvre panel). Dette indikerer at økt mRNA og protein uttrykk for JNK1 følgende JNK2 uttømming er uavhengig av c-juni
Hypo-fosforylert c-Jun binder c-Jun promoter
Stress-indusert S63 /S73 fosforylering av c-jun av JNK kinaser utgivelser c-jun fra en hemmende kompleks og dermed gjør c-jun å binde og transactivate målet arrangører [24]. Stress-indusert fosforylering av c-Jun i HCT116-celler behandlet med UV-bestråling, er vist i fig. 3A. Men selv om vi har observert høy opphopning av c-Jun protein følgende JNK2 stanse (fig 3A;. JNK2 siRNA kjørefelt) dette var uavhengig av økt N-terminal fosforylering på S63, S73 eller S91 (fig 3A.)
JNK2 lyddemping induserer en markant økning i c-Jun mRNA nivåer (se ovenfor, fig. 2E). Å spørre om økt c-Jun transkripsjoner skyldtes, i hvert fall delvis, til en positiv autoregulerende feed-back loop vi utført kromatin immunoprecipitation (chip) for c-Jun /c-Jun-promotor komplekser (Fig. 3B og 3C) . I ubehandlede HCT116-celler c-Jun var ikke målbart på c-Jun promoteren (fig. 3C, kontroller). Etter UV-bestråling c-Jun ble fosforylert ved S63 og S73 (fig. 3A) og fosforylert protein ble bundet til c-Jun promoteren som indikert av Chip-analyse ved anvendelse av anti-fosfo-T63 /73 c-Jun-antistoffer (fig. 3C). I JNK2-utarmet celler under basale betingelser, ingen endring i c-Jun T63 /73 fosforylering var tydelig i forhold til kontrollene (fig. 3A). Likevel c-Jun i disse celler ble bundet til c-Jun promoteren (fig. 3C). Mangel på fosforylering av kromatin-bundet c-Jun ble bekreftet av mangel på reaktivitet med anti-fosfor-T63 /73 c-Jun-antistoffer (Fig 3C;. Sammenligne prøvene fra UV-bestrålt celler med JNK2-forstummet celler). Dermed har vi konkludere med at S63 /73 hypo-fosforylert c-Jun binder seg til sin egen promoter følgende JNK2 utarming og vil trolig bidra til de høye c-Jun mRNA uttrykk nivåer (~9-dobling i løpet av kontrollen, se fig. 2E) Induced under disse basale betingelser.
c-Jun-protein opphopning korrelerer med tap av fosforyleringen ved S243
Det er mulig at c-Jun opprettholdes på lave nivåer i HCT116-celler, lavere enn observert for ikke- -cancer ARPE19 celler (data ikke vist), via kontinuerlig c-Jun proteinnedbrytning. Nedbrytning av c-Jun innebærer C-terminal fosforylering ved S243 som primtall c-Jun for gsk3-mediert fosforylering på T239. Dette genererer et vedlegg stedet for Fbw7 E3 ubiquitin ligase, noe som resulterer i polyubiquitinylation og c-Jun degradering [10]. I vår nåværende studie bemerket vi at JNK1 lyddemping forårsaket en liten men reproduserbar økning i c-Jun S243P (se figur 4B-4D,. Kontroll kjørefelt cp JNK1 siRNA kjørefelt S243P immunoblotter). Omvendt JNK2 tie reproduserbart forårsaket reduserte nivåer av c-Jun 243P, av og til ikke-detekterbare tross massiv akkumulering av totalt protein (figur 4B-4D,. Kontrollfilen cp JNK2 siRNA for S243P immunoblot). Dermed JNK1 og JNK2 utøve motsatte effekter på c-Jun fosforylering på S243, en endring knyttet til de-stabilisering av c-Jun protein.
(A) skjema som viser steder av fosforylering av c-Jun av JNK, GSK -3 og ERK, og deres respektive funksjonelle konsekvenser. Merk at S243P er en forutsetning for T239 fosforylering (indikert med buet pil). (B) immunoblot som viser effekter av JNK1, JNK2 og GSK3p lyddemping, alene og i kombinasjoner, på et panel av HCT116 cellulære proteiner. (C) og (D) immunoblotter følgende kombi stanse av JNK1 og JNK2 med Fbw7 og ERK. (E) Eteriske pro-apoptotiske mellom fastsatt av co-lyddemping med JNK2. (F) apoptose følgende JNK2 lyddemping henhold basale forhold er uavhengig av Bax som dokumentert av Bax +/- og Bax – /-. HCT116 isogene kloner
gsk3, ERK, Fbw7 og ITCH er viktige formidlere av basal JNK1 avhengig apoptose
i en videre rekke samarbeid stanse forsøkene vi vise at kinaser gsk3, ERK, og ubiquitin 3 ligase Fbw7 er også viktige formidlere av JNK1 avhengige apoptose i JNK2 fattige celler (fig. 4E). Men ingen av disse komponenter viste seg å støte mot S243 fosforylering eller akkumuleringen av c-Jun-proteinet (figur 4B, 4C og 4D,. Kolonnene GSK3p, Fbw7 og ERK henholdsvis). Dette var uventet siden, som reaksjon på stress, har alle tre er forbundet med c-Jun nedbrytning via S239 og S243 fosforylering (ERK og GSK3p henholdsvis) og ubiquitin-formidlet nedbrytning (Fbw7) [10], [25], [26] . Det virker som under basale forhold, gsk3, ERK og Fbw7 funksjon som viktige formidlere av apoptose via underlag annet enn c-juni
Bax og CKII er unnværlig for basal JNK1 /JNK2 apoptotiske sti
Etter stresset Bax er en pro-apoptotiske formidler av JNK-indusert apoptose [27], [28]. Å spørre om Bax er også nødvendig for basal JNK1 /JNK2 regulerte apoptotiske sti vi brukte isogen Bax +/- og Bax – /- HCT116-celler [2]. JNK2 stanse indusert apoptose i både HCT116 Bax
+/- og HCT116 Bax
– /- celler (figur 4F.) Indikerer at Bax ikke er nødvendig for apoptose under disse basale forhold. Co-stanse CKII, en antatt kinase for c-Jun [3], også klarte å redde JNK2 fattige HCT116-celler fra apoptose (fig. 4E). Dermed både Bax og CKII vises unnværlig for basal JNK1 /JNK2 apoptotiske sti.
Interaksjon mellom c-Jun og ITCH
Den pro-apoptotiske sti indusert av TNFa kulminerer i fosforylert JNK1 avhengig aktivering av kløe, nedbrytning av c-FLIP og caspase 8 aktivering (se Innledning). Her viser vi at ITCH er også en viktig pro-apoptotiske megler styrt av JNK1 /JNK2 henhold basale forhold og at samtidig stanse ITCH med JNK2 redder celler fra apoptose (Fig. 5A og 5B).
(A) og (B) Protein og apoptotiske nivåer observert etter ITCH og JNK2 lyddemping i HCT116 cellene. (C) Komplekser av endogene ITCH-c-Jun proteiner oppdaget før JNK2 knebling er tapt etter JNK2 uttømming.
For ytterligere å undersøke pro-apoptotisk rolle ITCH henhold basale forhold vi har utført immunoprecipitation /immunoblot analyse for endogene komplekser av ITCH-c-Jun før og etter RNAi-mediert stanse av JNK2 (fig. 5C). Betydelig, ITCH-c-Jun komplekser kunne påvises etter kontroll forhold, men disse kompleksene ble tapt følgende JNK2 lyddemping (Fig. 5C).
apoptose fortsetter via c-FLIP og caspase 8
Co- stanse caspase 8 med JNK2 reddet celler fra apoptose (fig. 4E). Denne effekten var begrenset til basale forhold siden caspase 8 RNAi ikke klarte å redde apoptose etter UV-bestråling (data ikke vist). c-FLIP lyddemping alene indusert apoptose i HCT116-celler [29]. Co-tie c-Jun, gsk3, eller Fbw7 med c-FLIP ikke klarte å redde celler fra apoptose (fig. 6A), noe som indikerer at hver av disse pro-apoptotiske mellom fungere up-stream av c-FLIP (Fig. 7A-skjematisk ). Således basal og stress-indusert apoptotisk MAP-kinase-baner konvergerer på nivået av c-FLIP. Som forventet, co-tie caspase 8 med c-FLIP reddet celler fra apoptose (Fig. 6A og 6B).
(A) Nivåer av apoptose observert etter samtidig stanse av c-FLIP med pro-apoptotiske meklere . (B) Protein nivåer viser pro-caspase 8 cleavage og c-Jun akkumulering etter c-FLIP uttømming av RNAi.
(A) Skjematisk viser villtype c-Jun (wt-c-Jun) og ikke-phosphorylatable mutant c-Jun konstruerer. (B) Annexin V måling av apoptose etter overekspresjon av wt-c-Jun eller mut-c-Jun som angitt. (C) immunoblotter viser total og fosforylert c-Jun følgende overekspresjon, SIRT1 lasting kontroll vist. (D) Nivåene av apoptose etter kombinert siRNA behandling i nærvær eller fravær av ikke-target-mut-c-Jun, (se materialer og metoder).
Over-ekspresjon av eksogene c-Jun induserer apoptose
neste spurte om høy grad uttrykk for c-Jun alene er tilstrekkelig til å indusere apoptose. Over-uttrykk for eksogen villtype c-Jun indusert apoptose i HCT116 kreftceller (Fig. 7A og 7B). Viktigere, over-uttrykk for en c-Jun fosforylering mutant, som S63, S73, T91 og T93 er alle mutert til alanin, også indusert apoptose dermed re-håndheve bevis for pro-apoptotiske funksjoner av hypo-fosforylert c-Jun (Fig . 7A og 7B). Legg merke til at eksogen ekspresjon av et annet protein, SIRT1, ikke induserer apoptose i HCT116-celler [22] som indikerer at de foreliggende resultater er spesifikke for c-juni Protein uttrykk fra c-Jun konstruerer og fosforylering status viser fosforylering på alle områder undersøkes på villtype c-Jun (Fig. 7C). Dette er en indikasjon på cellulært stress som respons på eksogent gen over-ekspresjon. Merk at dette er i kontrast til den vedvarende c-Jun hypo-fosforylerte status følgende RNAi-mediert genet Slå under basale betingelser som anvendes gjennom hele dette arbeidet (se for eksempel fig. 3A). Den c-Jun fosforylering mutant manglet reaktivitet med anti-fosfor-S63, S73 og T91 antistoffer som forventet (antistoff mot fosfoserin- 93 var ikke tilgjengelig). Selv om både muterte og villtype eksogene c-Jun proteiner ble fosforylert på T239 og S243 (Fig. 7C) vi tror at dette var ikke avgjørende for induksjon av apoptose siden endogen c-Jun er nødvendig for apoptose tross mangel på C-terminal fosforylering (se for eksempel fig. 4B-4D følgende JNK2 stanse). Betydelig, over-ekspresjon av eksogent c-Jun induserte ikke apoptose i ikke-kreft ARPE19-celler (fig. 7B). Disse generelle observasjoner ytterligere re-håndheve våre konklusjoner (i) at forhøyede nivåer av hypo-fosforylert c-Jun er pro-apoptotiske i HCT116 kreftceller, og (ii) at effekten er spesifikk for kreftceller (HCT116) og er ikke observert
