Abstract
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall for både menn og kvinner. Tidlig diagnostisering av lungekreft har en 5-års overlevelse på 48,8%, men nesten 35% av stadium I pasienter tilbakefall etter kirurgisk reseksjon, og dermed som varsler en dårlig prognose. Derfor detektering av lungekreft i tidlig stadium og videre å identifisere pasienter med høy risiko ville tillate muligheten for å tilveiebringe adjuvant terapi og muligens øke overlevelse. Det er mye som tyder på at immunsystemet frembringer et autoantistoff respons på neoplastiske celler. Deteksjonen av slike antistoffer har vist seg å ha diagnostisk og prognostisk verdi. Her tok vi fordel av high-throughput Luminex teknikk for å multiplekse en total av 14 tumor-assosierte autoantigener for å detektere autoantistoff fra pasientens sera. De 14 antigener ble uttrykt av in vitro transkripsjon /translasjon system med HaloTag på N-terminalen. Fusjonsproteinene ble deretter kovalent immobilisert på de Luminex mikrosfærer konjugert med halogen-link ligand, og dermed eliminere proteinrenseprosedyren. Seraprøver fra kreftpasienter og friske kontroller ble interaksjon med mikrosfære-antigen-komplekset for å måle autoantistoffer. Vi har utviklet en rask multiplex detection system for måling av autoantistoff signatur fra pasientsera med minimal kryssreaksjon. Et panel av syv autoantistoff biomarkører har generert en AUC 80% i å skille de lungekrefttilfellene fra friske kontroller. Denne studien er den første rapporten ved å kombinere Luminex plattform og HaloTag teknologi for å oppdage humoral immunrespons hos kreftpasienter. På grunn av fleksibiliteten av den Luminex teknologi, kan denne fremgangsmåten brukes til andre forhold, for eksempel smittsom, nevrologiske og metabolske sykdommer. Man kan se for seg at dette multiplex Luminex system samt panel på sju biomarkører kan brukes til å screene høyrisiko befolkning med påfølgende CT test basert på blodprøve resultat
Citation. Jia J, Wang W Meng W, Ding M, Ma S, Wang X (2014) Utvikling av en multipleks antistoffer Test for påvisning av lungekreft. PLoS ONE 9 (4): e95444. doi: 10,1371 /journal.pone.0095444
Redaktør: Nupur Gangopadhyay, University of Pittsburgh, USA
mottatt: 6 oktober 2013; Godkjent: 27 mars 2014; Publisert: 22 april 2014
Copyright: © 2014 Jia et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Natural Science Foundation (81172072), Science Foundation for Distinguished Young Scholars (R2101405), Infrastruktur og Facility Development Program of Science and Technology Department of Zhejiang-provinsen (2011F10015), Major Science and Technology Innovation Prosjekt av Hangzhou ( 20112313A01), Kina. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall for både menn og kvinner over hele verden. I 2012 ble det anslått at 226,160 mennesker vil bli diagnostisert med lungekreft og 160,340 pasienter vil dø av sykdommen. Dagens 5-års overlevelse for pasienter er 16% frem til 2007, blant de laveste av alle krefttilfeller, noe som har forbedret bare marginalt i det siste tiåret [1]. De fleste lungekreftpasienter er diagnostisert ved slutten /fjern trinn således med lav overlevelse, på grunn av mangel på perceivable symptomer på et tidlig stadium av tumorigenesis [2].
Dataene tyder på at diagnostisering av lungekreft når det er liten og lokalt definert kan øke herde sjansen [3], [4]. Tidlig diagnostisering av lungekreft kunne gi en betydelig bedre 5-års overlevelse opp til 48,8% sammenlignet med 3,3% av sen /fjern scenen [5]. Derfor ville deteksjon av tidlig stadium lungekreft og identifisering av høyrisikopasienter gi potensial adjuvant behandling og muligens øke overlevelse.
Dagens metoder for diagnostisering av lungekreft krever en biopsi og patologisk undersøkelse av vev vanligvis etter oppdagelsen av lesjon på brystet X-ray eller datastyrte tomografi. Det er for tiden ingen blodprøve tilgjengelig for lungekreft. Flere metoder har blitt utviklet for å identifisere biomarkører for diagnostisering av lungekreft [6], [7]. Blant disse har immunsystemet vist seg å produsere autoantistoffer mot neoplastiske celler i tillegg til feilregulert tumorassosierte antigener [8], [9], derfor påvisning av slike antistoffer har diagnostisk og prognostisk verdi [10], [11]. Viktigst, eksisterer humorale immunresponser flere måneder eller år før de kliniske symptomer, og dermed autoantistoffer kan bli brukt for tidlig diagnose av kreftpasienter [7], [9], [12]. I tillegg er det rapportert at B-celler og B-celle-tilknyttede antistoffer fremme de novo karsinogenese [13], som tyder på at den humorale immunrespons kan spille en direkte rolle i progresjon av kreft.
(1) De HaloTag aminligander ble konjugert til Luminex magnetiske kuler via den aktiverte karboksylsyre med COOH-radikal gruppe. Forskjellige farger representerer ulike typer Luminex perler. (2) De rekombinante Halo-merkede proteiner ble kovalent immobilisert på de Luminex perler konjugert med HaloTag ligand via reaktive kloralkan linkerne på ligander. Hver perle ble immobilisert med forskjellig protein separat. (3) – (4) På grunn av den kovalente binding, hver perle-proteinkompleks individuelt gikk gjennom kraftig vasking og deretter kombinert for å gjøre mikrosfære bassenget. (5) Et protein-koblede mikrosfære-blanding ble så like aliquotted inn i en 96-brønns plate. Hver brønn inneholder flere autoantigen biomarkører og kan anvendes for en enkelt serumprøve. (6) De antistoffer i sera bundet til antigenet konjugert mikrokulene, og ble påvist ved R-fykoerytrin-konjugert anti-humant antistoff. Signalet ble lest på Luminex 200 Bioanalyzer.
I denne studien har vi beskrevet en ikke-invasiv diagnostisk system på Luminex Xmap plattform for å oppdage serum autoantistoffer for diagnostisering av lungekreft. Kandidaten autoantigener ble valgt ut fra litteratur og uttrykt av in vitro transkripsjon /translasjon systemet med HaloTag på N-terminalen. Uten rensning ble de rekombinante proteiner som er kovalent immobilisert på Luminex vulst. Serumprøver ble inkubert med vulsten-autoantigen kompleks for å måle mengden av autoantistoffer. Et panel av syv antigener, nemlig p53, NY-ESO-1, Livin, Ubiquilin1, BIRC, p62 og PRDX, ble brukt i en multivariat statistisk modell for å skille kreftpasienter fra friske kontroller. Dette er den første studien av detektere multiplex autoantistoff på Luminex teknologi.
Materialer og metoder
Uttrykk av rekombinante proteiner
cDNA for 14 autoantigener ble klonet inn i Flexi vektor ( Promega, USA) med en HaloTag ved N-terminus. Halo tagget rekombinante proteiner ble uttrykt av in vitro transkripsjon /translation system (Promega). Den HaloTag-proteinet ble også fremstilt som negativ protein. Proteinene ble oppdaget av Western blot hjelp kanin anti-HaloTag antistoff (Promega).
Western Blot analysen
Halo tagget rekombinante proteiner ble uttrykt av
in vitro
transkripsjon /translation system, og deretter utsatt for Western blot. Kort fortalt ble totalt 3 mL protein lysat lastet opp på 12% SDS-PAGE, deretter elektro overført til PVDF membran (GE). Proteinet lysat med HaloTag kun protein (31 kDa) ble lastet som kontroll. Etter blokkering ble membranene blottet med kanin anti-HaloTag antistoff (Promega), etterfulgt av inkubasjon med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Proteintech). Protein signalene ble oppdaget av ECL-reagens (GE), og fotografert ved hjelp av Alpha Innotech Fluor Chem FC2 chemiluminescence bildeanalysesystem (Alpha Innotech).
Pasientserumprøver
Studiet ble godkjent av Institutional Review Board of Zhejiang Academy of Medicine Sciences. Alle deltakere som følger sera ble gitt skriftlig informert samtykke.
Pasientene med lokalisert lungekreft ble samlet ved Institutt for Oncology, Hangzhou første folks sykehuset fra august 2010 til mars 2012. Det er totalt 117 pasientprøver oppfylt følgende kriteriene for denne studien: 1) fra biopsi-påvist klinisk lokalisert lungekreft, 2) ingen tidligere lungekreft behandling, 3) dato for serum trukket umiddelbart før dato for operasjonen, 4) ingen andre samtidige ondartede sykdommer og autoimmune sykdommer. Av disse 117 prøvene, ble 44 prøvene valgt tilfeldig for å brukes i utviklingen og validering av Luminex plattformen, mens 25 prøver ble brukt for biomarkør utvelgelse, og resten 48 prøver ble brukt for multipleks biomarkør analyse. Tilsvarende, for å tjene som kontrollpersoner, sykehuset gitt 110 seraprøver i aldersspennet 29-76 med ingen historie av kreft samlet mellom 2011 og 2012. Disse 110 prøvene ble også tilfeldig delt inn i tre grupper i denne studien, spesielt 35 prøver for Luminex utvikling, 25 prøver for biomarkør utvalg og 50 prøver for multiplex analyse.
Bøyning av HaloTag Amine Ligand til Luminex mikrosfære
den minste mengde HaloTag Amine (O4) ligand (Promega, USA) for maksimal konjugering effektivitet på Luminex sfærer (Luminex Corp.) ble bestemt som følger. En total av 5 x 10
6 Luminex magnetiske mikrokuler ble konjugert med en serie fortynning av HaloTag Amine Ligand: 0,0016 mg, 0,008 mg, 0,04 mg, 0,2 mg, 1 mg. Kort sagt ble mikrokulene suspendert i en oppløsning av 100 mmol /l MES (pH 6,0), inneholdende 5 mg /ml 1-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid (Thermo Scientific) og HaloTag Amine Ligand. Etter en 2-timers inkubering i mørket, ble mikrokulene ble vasket og resuspendert i 100 mmol /l MES (pH 4,5) og lagret ved 4 ° C.
Luminex mikrokuler kombinert med HaloTag ligand ble inkubert med renset HaloTag protein i en serie av fortynning fra 0 til 5 ug ug. MFI (gjennomsnittlig fluorescens intensitet) representerer bindingen signal og ble oppdaget av anti-HaloTag antistoff.
Utvikling og validering av Protein-mikrosfære Complex
ligand-mikrosfære kompleks i forskjellige perle regioner ble hver inkubert med rekombinante HaloTag fusjonsproteiner ved omgivelsestemperatur i mørke i 60 minutter. Etter inkubering, ble mikrosfærene vasket med PBS inneholdende 0,1% BSA og 0,5% Tween 20, og resuspendert i PBS inneholdende 0,1% BSA for validering.
Mengden protein konjugert til mikrosfære ble målt ved anvendelse av kommersielt antistoff ( kanin-anti-p62-antistoff, kanin-anti-p53-antistoff, Santa Cruz) mot hverandre målproteinet. I korthet ble serielle fortynninger av hvert antistoff (som varierer fra 0 til 5 ug /ml i PBS, 1% BSA) ble inkubert med 3000 mikrosfærer konjugert med forskjellige proteiner i en 96-brønns plate i 1 time. Etter vasking med PBS /1% BSA, ble mikrokulene inkubert med R-fykoerytrin-konjugert sekundært antistoff i 30 minutter. Det resulterende kompleks ble på nytt vasket og resuspendert i PBS /1% BSA før lesing på Luminex 200 Bioanalyzer (Luminex Corp). MFI-verdien representerer bindende signal.
For å teste deteksjon evne til Luminex system, 44 kreft og 35 helse kontrollseraprøver ble tilfeldig valgt, og NY-ESO-1 autoantistoff ble målt ved Luminexe system. I korthet forskjellige mikrokuler konjugert med rekombinant NY-ESO-1 og HaloTag hver for seg ble kombinert og alikvotert inn i en 96-brønns plate. Serumprøvene ble fortynnet ved 1:200 i PBS /1% BSA og inkubert med perlene over natten ved 4 ° C med risting. De autoantistoff signaler ble deretter detektert ved R-fykoerytrin-konjugert anti-humant polyklonalt antistoff (Rockland) i 0,5 timer med konstant omrøring. Etter tre vaskinger ble reaksjonskomplekset resuspendert i PBS /1% BSA for lesing på Luminex 200 Bioanalyzer. MFI-verdiene ble representert av MFI (NY-ESO-1) minus MFI (HaloTag).
fluorescensstyrkene ble også sammenlignet med et kommersielt ELISA-sett (Biovalue, USA). Forsøket ble utført i henhold til produsentens instruksjon.
Påvisning av autoantistoffer i serum
Forskjellige mikrokuler konjugert med rekombinante proteiner og HaloTag hver for seg ble kombinert og alikvotert inn i en 96-brønners plate for å detektere autoantistoffer i serum. Serumprøvene ble fortynnet ved 1:200 i PBS /1% BSA og inkubert med perlene over natten ved 4 ° C med risting. De autoantistoff signaler ble deretter påvist ved Luminex som tidligere beskrevet.
Statistical Analysis
Både univariable og multivariate analyser ble anvendt. Forskjeller mellom to grupper ble evaluert av t-test. Korrelasjonen mellom enkelt-plex og multi-plex systemer eller mellom ELISA og Luminex single-plex systemet ble evaluert ved hjelp av Pearsons korrelasjonskoeffisient (R). Klasse prediksjon ble undersøkt ved hjelp av BRB-Array Tools pakke (versjon 3.6), tilgjengelig på https://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html. Alle beregningene ble utført ved hjelp av R statistisk programmeringsspråk (https://cran.r-project.org/) og Bioconductor pakker. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av programvaren SPSS 13.0 (SPSS), GraphPad Prism 5.0, og Excel. p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
er den generelle tilnærming med studien er vist i fig.. 1
For å kovalent å immobilisere de rekombinante proteinene til Lumimex mikrosfære, den HaloTag amin-ligand ble først konjugert til Luminex mikrosfærene via den aktiverte karboksylsyre med COOH-radikal gruppe ved forskjellige konsentrasjoner (Fig. 2A). Koblingsgraden økte på en konsentrasjonsavhengig måte som påvist ved HaloTag standard protein (fig. 2A). I tillegg, MFI nådde til platå ved 0,2 mg og 1 mg amin-ligand, noe som indikerer metning av aminet ligand på perleoverflaten. I denne studien ble 0,2 mg ligand anvendes for å konjugere mikrosfære.
(A) Titrering av HaloTag amin ligand konjugert på Luminex mikrokulene. Det rensede HaloTag standard protein ble anvendt for å påvise effektiviteten av konjugering i en serie av konsentrasjoner. MFI (gjennomsnittlig fluorescensintensitet) representerer bindings signal som detekteres ved hjelp av anti-HaloTag antistoff. (B) Validering av Luminex microsphere kompleks kombinert med HaloTag Amine Ligand. De Luminex Perlene ble koplet med 0,2 mg av HaloTag Ligand og signalene ble detektert som (A).
Luminex mikrosfærer konjugert med 0,2 mg amin-ligand ble ytterligere bekreftet ved bruk av standard HaloTag protein ved forskjellige konsentrasjon. Dataene viste at den maksimale MFI selv på 1,25 mikrogram av standard protein demonstrere optimal konjugering tilstand (Fig. 2B).
For å raskt skjermen søkerautoantigener, ble et panel av 14 proteiner uttrykt av
in vitro
transkripsjon /translasjon system. Etter å ha bekreftet ved Western blot (Fig. 3A), de rekombinante fusjonsproteiner med den HaloTag var direkte inkubert med mikrosfære-ligand-kompleks uten proteinrensing. Den kovalente binding mellom HaloTag og ligand former hurtig under de generelle fysiologiske betingelser og er meget spesifikk og i det vesentlige irreversibel, noe som ga et kompleks som er stabilt selv under stringente betingelser. Proteinet mengde immobilisert til den enkelte Luminex mikrosfære ble deretter undersøkt ved hjelp av de kommersielle antistoffer mot de tilsvarende antigen-proteiner. Som vist på fig. 3B, MFI-signalene ble målt på en konsentrasjonsavhengig måte påvist ved anti-P62 og anti-HaloTag antistoffer.
(A) Et representativt Western Blot av de rekombinante autoantigenene med HaloTag ved N-terminus uttrykt ved in vitro transkripsjon /translation system. (B) Validering av Luminex sfærer kombinert med rekombinante HaloTag proteiner. De immobiliserte proteiner ble påvist ved hjelp av anti-P62 og anti-HaloTag antistoffer separat, og de signaler som var i en konsentrasjonsavhengig måte. (C) sammenligning av den NY-ESO-1-autoantistoffer i sera påvist ved Luminex og ELISA. Totalt 44 lungekrefttilfellene og 35 friske kontroller ble tilfeldig valgt å sammenligne NY-ESO-1 autoantistoff målt ved Luminex system og ELISA-analysen. R
2 = 0.92 indikerer høy korrelasjon mellom Luminex og ELISA-plattformer i å oppdage NY-ESO-1 autoantistoff.
For å undersøke om Luminex systemet kan gjenkjenne autoantistoff fra menneskelige prøve, 44 lunge kreft og 35 friske serumprøver ble tilfeldig valgt og den NY-ESO-1-autoantistoff ble sammenlignet ved bruk av Luminex system og et kommersielt ELISA-sett (Biovalue, USA). Begge analyseplattformer oppdaget betydelig høyere beløp av NY-ESO-1 autoantistoff hos kreftpasienter sammenlignet med friske kontroller (Fig. 3C). Enhetlige lineær regresjonsanalyse viste at korrelasjonskoeffisient (Pearsons r) var 0,92 for NY-ESO-1-antistoffer målt ved både Luminex og ELISA-teknikker, noe som tyder på at to metoder hadde en høy grad av enighet i å oppdage NY-ESO-1 autoantistoff (
p
. 0,01)
neste utviklet multiplekset Luminex system. Fire protein-mikrosfære-komplekser (NY-ESO-1, p53, P62, og PRDX) samt en HaloTag konjugert vulst som referanse kontroll var like kombinert og fordelt inn i en 96-brønns plate. Den anti-p53-antistoff ble anvendt til å detektere p53 mikrokule i denne multipleks-system. Dataene viser at MFI-signaler ble sterkt korrelert med de av den enkelte perle system (single-plex) (fig. 4A), som viser multipleks system er gyldig for autoantistoffer deteksjon. I tillegg, bortsett fra p53-mikrokule, mikrokuler, inkludert alle andre NY-ESO-1, p62, PRDX produsert bakgrunnssignaler som indikerer det var ingen kryss-reaktivitet mellom perlene i denne multipleks system (Fig. 4B).
(A) sammenligning av de p53 koplet perlene i en singleplex (individuell vulst) og multipleks (flere perler) system. MFI-verdien ble påvist ved en serie fortynning av p53-antistoff. (B) Ingen kryssreaktivitet mellom ulike biomarkører i multiplex system. En multipleks-system inneholdende fem mikrokuler kombinert med NY-ESO-1, p53, p62, PRDX og HaloTag separat ble inkubert med p53-antistoff, og bare de p53-mikrokulene omsettes med anti-p53-antistoff, mens andre mikrosfærer påvises bakgrunns MFI-verdier. (C) Det signal som korrelasjonen av de p53-mikrokuler i den singleplex og multipleks-system. (D) Samme som (C), men ved hjelp av P62 kombinert sfærer.
neste søkt å teste korrelasjonen av både en- og fler plex Luminex systemer ved å sammenligne autoantistoff signalene fra tilfeldig utvalgte serumprøver oppdaget av begge systemene separat. Som vist i fig. 4C og fig. 4D, korrelasjonskoeffisienten (Pearson r) var 0,84 for p53 mikrosfære (
p
0,01), mens 0,81 for p62 mikrosfære (
p
0,01), The Pearson r var også over 0,80 til andre protein-mikrosfære-komplekser (data ikke vist) indikerer den høye korrelasjonen mellom enkelt- og multi-plex-systemer.
Basert på multipleks Luminex system, vist vi et panel av 14 kandidatautoantigener til detektere de sirkulerende antistoffer fra uavhengige 25 lungekreft og 25 friske kontroll tilfeldig valgt fra prøven kohort i denne studien. Syv autoantigener, inkludert p62, BIRC, Livin-1, p53, PRDX, NY-ESO-1 og Ubiquilin, produsert bemerkelsesverdig høyere MFI signaler i lungekreftpasienter sammenliknet med friske kontroller (Mann-Whitney p value 0,05) (fig . 5).
ved siden fastslått hvorvidt det panel av biomarkører 7 kan anvendes for ikke-invasiv påvisning av lungekreftpasienter. Vi skjermet uavhengige 48 lungekrefttilfellene og 50 kontrollseraprøver med ulike lungekreft typer og stadier av den Luminex multipleks system. De grunnleggende parametere av de 48 kreftpasienter og kontroller 50 er oppsummert i tabell 1, inkludert alder, kjønn, røyking og drikking status. Etter separasjon i kreft og kontroll klasser, ble nøyaktigheten av binære utfall prediksjon beregnet ved hjelp av ulike maskinlæringsalgoritmer tilgjengelig på BRB Array Tools. Hver prøve verdi for hver av disse 7 biomarkører ble multiplisert med de tilsvarende koeffisienter avledet fra univariate logistikk regresjoner på treningssett med kreft /kontroll som en binær respons variabel, og deretter verdiene ble summert. Den opprettede indeks Stillingen ble deretter vurdert av ROC-kurven, som ga en ren indeks av en testnøyaktigheten ved å plotte følsomhet mot 1- spesifisitet for hvert resultat verdien av testen. Tre prediksjon algoritmer ble brukt til å generere den ROC, inkludert forbindelsen kovariat prediktor (CCP), diagonalt lineær diskriminant analyse (DLDA), og Bayesian forbindelse kovariat prediktor (BCCP). Spesielt, analyse ga en meget sammenlignbar ROC for alle tre algoritmer med henholdsvis AUC 0,82 (CCP), 0,81 (DLDA), 0,81 (BCCP) (fig. 6), noe som viser den sterke diskriminerende effekt av de 7 biomarkører. Ingen sammenheng med alder, kjønn, status å røyke eller drikke ble observert for denne biomarkør panel.
Diskusjoner
Påvisning av sirkulerende antistoffer mot tumorassosierte antigener er en lovende tilnærming for tidlig diagnostisering av kreft, og de teknologiene har blitt mye utviklet [14], [15]. Til dags dato, er ELISA den konvensjonelle metode for deteksjon av autoantistoff i serum, men dens anvendelse på multipleksing autoantistoff signatur er begrenset. Nylig ble protein microarray og Luminex Xmap teknologier vedtatt for å måle den serologiske autoantistoff panelet [16], [17].
Luminex Xmap er høy i hele plattform med overlegen sensitivitet og spesifisitet enn ELISA [18], [19 ], [20]. I denne studien har vi beskrevet en enkel Luminex metode basert på HaloTag teknologi for å oppdage de autoantistoffer fra pasientsera. De HaloTag proteiner ble kovalent bundet til linkerne kloralkan konjugert til mikrokulene [21], [22]. På grunn av den spesifikke kovalent binding, blir de rå Halo-merkede fusjonsprotein lysatene selektivt immobilisert til de Luminex perlene og deretter gå gjennom under kraftig vasketrinn, og dermed hopper over langtekkelig proteinrensemetode.
Det er vel etablert at multipleksing enkelt biomarkører (dvs. autoantistoff profilering) kunne gi en betydelig øke sensitivitet og spesifisitet av kreft biomarkører i diskriminerende kreftpasienter fra friske kontroller [23]. Hensikten med denne studien var å dra nytte av Luminex teknikk for å multiplekse et panel av 14 tumor-assosierte autoantigener ved påvisning av lungekreftpasienter. Disse autoantigener ble valgt basert på deres prestasjoner i å skille kreft fra friske kontroller beskrevet i litteraturen. For eksempel ble p53 påvist autoantistoffer i omtrent 15% av kreftpasienter [24], [25]. Ubiquilin 1 ble funnet å være en lovende biomarkør for lungekreft med en AUC på over 0.7 [26]. Livin-en autoantistoff ble rapportert i 19 av 37 lungekreftpasienter (51,3%) [27]. I tillegg ble 25 (47%) av 53 NSCLC testet positivt for autoantistoffer mot PRDX i sera [28]. Autoantistoff til NY-ESO-1, BIRC, og p62 ble også påvist hos lungekreftpasienter med 20%, 19,5% og 18,8% sensitivitet henholdsvis [29], [30], [31].
Multiplex den tumor-assosierte antigenene er blitt grundig undersøkt ved hjelp av ELISA [32], [33], [34], [35], [36] eller mikroarray [37]. Denne studien er den første rapporten ved å kombinere Luminex plattform og HaloTag teknologi for å oppdage humoral immunrespons hos lungekreftpasienter. Panelet av 7 biomarkører oppnådd over 80% nøyaktighet i å oppdage lungekreft fra friske kontroller. Disse autoantistoffer, men har ingen tilknytning til kreft histologier, stadier og typer grunn til det ytterste av utvalgsstørrelsen. Derfor vil oppfølgingsstudien være nødvendig i en stor pasient kohort med en blanding av tumortyper og stadier for å validere resultatene av autoantistoffer over kreft histologier og typer, spesielt sammenhengen mellom sykdommen kreft og autoantistoff titer. Man kan tenke seg at denne multipleks Luminex systemet så vel som panelet av syv biomarkører kan bli anvendt for å screene høyrisiko populasjon med påfølgende CT test basert på blodtestresultatet.
Utnyttelse av immunresponsen mot tumorer gir en unik mulighet for å utvikle nye verktøy for den serologiske diagnostisering av kreft, så vel som en leder for terapi. En test basert på påvisningen av autoantistoffer mot tumorantigener i sera fra pasienter som kan ha stor betydning for tidlig påvisning av kreft på grunn av den langvarige tidsforløpet av karsinogenese og fordi et påvisbart nivå av antistoffer mot kreftfremkallende stimulans kan danne vel før tumoren fenotype oppstår. Som andre kreftformer, utvikler lungekreft som resultatene av avsporing av heterogene og flere regulatoriske prosesser. Derfor er det ikke en eneste biomarkør som trenger å bli klarlagt. Multipleksede biomarkør mønstre har en betydelig høyere positiv prediktiv verdi enn enkeltmarkører i diskriminerende syke pasienter fra ikke-kreft kontroller.
Den autoantistoff testen har store løftet, men mye mer forskning med omfattende prøver er nødvendig for å bekrefte testens pålitelighet og å tilpasse teknikken for massescreening. I tillegg vil leger også behov for å finne ut om tidlig diagnose forbedrer resultatet for pasienter med lungekreft, og dermed bidra til å produsere antistoffer for sykdomsbehandling. Derfor, bygge bro over gapet mellom grunnforskning og klinisk praksis representerer det viktigste målet i nær fremtid for å gjøre det mulig for leger å skreddersy risikojustert screening og behandlingsstrategier for dagens lungekreftpasienter.
