Abstract
Immunresponsen er avgjørende for å overleve ved å ødelegge mikroorganismer og pre-kreftceller. Men betennelse, en del av dette svaret, kan resultere i kortsiktige og langsiktige skadelige bivirkninger.
Mclk1
+/- muterte musene kan være langlivet til tross for å vise et hair-trigger betennelsesreaksjon og kronisk aktiverte makrofager som følge av høy mitokondrie ROS generasjon. Her spør vi om dette fenotype er gunstig eller bare tolerert. Vi brukte modeller for smitte av
Salmonella
serovarene og fant at
Mclk1
+/- mutanter montere en sterkere immunrespons, kontrollere bakteriell spredning bedre, og er motstandsdyktig mot celle og vevsskade som resulterer fra reaksjonen, inkludert fibrose og typer av oksydativ skade som anses for å være biomarkører for aldring. Dessuten ble disse samme typer vevskade funnet å være lav i ubehandlede 23 måneder gamle mutanter. Vi undersøkte også oppstart av tumorvekst etter transplantasjon av mus LLC1 carcinoma celler i
Mclk1
+/- mutanter, samt under spontan tumorigenesis i
Mclk1
+ /-
Trp53
+/- doble mutanter. Tumor ventetid ble økt med
Mclk1
+/- genotype i begge modellene. Videre har vi brukt transplantasjon modell for å vise at milt CD8 + T-lymfocytter fra
Mclk1
+/- pode mottakere viser forbedret cytotoksisitet mot LLC1 celler in vitro.
Mclk1
+/- mutanter dermed vise en sammenslutning av en forbedret immunrespons med delvis beskyttelse mot aldersavhengige prosesser og fra patologier som ligner på de som finnes med økt frekvens i løpet av aldringsprosessen. Dette tyder på at immun fenotypen til disse mutantene kan bidra til deres levetid. Vi diskuterer hvordan disse funnene tyder på et bredere syn på hvordan immunresponsen kan påvirke aldringsprosessen
Citation. Wang D, Wang Y, Argyriou C, Carrière A, Malo D, Hekimi S (2012) En forbedret immunrespons
Mclk1
+/- Mutant Mus er assosiert med delvis beskyttelse mot fibrose, kreft og utvikling av biomarkører for aldring. PLoS ONE 7 (11): e49606. doi: 10,1371 /journal.pone.0049606
Redaktør: Yann Herault, IGBMC /ICS, Frankrike
mottatt: 16 august 2012; Godkjent: 11 oktober 2012; Publisert: 14.11.2012
Copyright: © 2012 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet har vært finansiert av et stipend fra den kanadiske Institutes of Health Research til SH (MOP-97869) og McGill University. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
immun~~POS=TRUNC systemet~~POS=HEADCOMP er viktig for umiddelbar overlevelse som svar på akutte utfordringer fra infeksjoner og kreftceller. Imidlertid som tilfellet er for andre organer, er funksjonen av immunsystemet svekkes i løpet av aldring på en måte som kan være skadelig [1], [2], og markører for immunosenescence er omvendt assosiert med langvarig overlevelse [3], [4]. Immunsystemet har også vært innblandet i aldringsprosessen på en annen måte. Det har blitt foreslått at aktiviteten av immunsystemet kan faktisk forårsake en del av fenotypen observert hos eldre individer [5]. Spesielt prosessen med betennelse, som utløses av den medfødte immunsystemet, har vært implisert i å utløse eller forverre utvikling av kroniske sykdommer av aldring, inkludert, type II diabetes [6], aterosklerose [7], tumorvekst [8] og alle de metabolske konsekvenser av fedme [9]. I tillegg fører kronisk inflammasjon til progressiv fibrose [10], et sårhelende reaksjon som involverer akkumulering av ekstracellulære matriksproteiner og kryssbinding av kollagen ekstracellulært. Fibrose er et kjennetegn på aldring i en rekke forskjellige organer, inkludert leveren [11], og kan føre til unormale vev strukturer, og resultere i alvorlig organdysfunksjon. Videre har det blitt foreslått at i mennesker, episode av sterk betennelse i spedbarnsalder føre til langsiktige skadevirkninger på grunn av forbedrede inflammatoriske prosesser senere i livet [12]. Denne hypotesen er basert på observasjon at historisk nedgang i alders dødelighet ble innledet med fall i tidlig alder dødelighet på grunn av færre episoder av alvorlig infeksjon og dermed betennelse.
I motsetning til vår tidligere studie av langlivede
Mclk1
+/- mus mutanter ikke støtter tanken om at betennelsen utløser eller forverrer aldringsprosessen [13].
Mclk1 plakater (aka
Coq7
) koder et enzym som er involvert i ubiquinone (UQ) biosyntese [14], og tap av en kopi av
Mclk1 product: (i
Mclk1
+/- mutanter) resulterer i i) endret UQ fordeling i mitokondrielle membraner [15], ii) forandret funksjon av den mitokondrielle respiratoriske kjeden [16], iii) en økning i dannelsen av mitokondrielle reaktive oksygenforbindelser (mitROS) [16], iv) en reduksjon i hastigheten av utviklingen av oksidative biomarkører av aldring [17], og v) en øket levetid [17], [18]. I disse mutanter økningen i mitROS fører til øket ekspresjon av immunregulator HIF-1α i makrofager [13]. HIF-1α er blitt funnet å være nødvendig for forskjellige aspekter av immunsystemet, inkludert som en utløser for differensiering av makrofager langs den inflammatoriske bane av aktiverings [19]. I samsvar med disse observasjoner har vi funnet at
Mclk1
+/- mutanter aktiverte makrofager, og at mutantene omsettes med en mye sterkere umiddelbar økning av sirkulerende inflammatoriske cytokiner ved behandling med meget lave nivåer av lipopolysakkarid (LPS ) [1. 3]. Derfor, i
Mclk1
+/- mutanter, i motsetning til forventningene, ble en høy inflammatorisk reaktivitet funnet å være assosiert med en langsom utvikling av biomarkører for aldring og med en økt levetid. Et viktig spørsmål er om endret immunrespons av
Mclk1
+/- mutanter kan delta i å bringe om lang levetid fenotype.
For å ta opp dette spørsmålet, vi har bedt om forbedret immunrespons hos
Mclk1
+/- mus er faktisk gunstig for organismen i form av motstand mot bakteriell infeksjon, kreft og type markører for skader som anses å være biomarkører på aldring.
Resultater
Mclk1
+/- Mutants bedre kontroll Infeksjoner etter
Salmonella
Typhimurium
Vi testet ytelsen
Mclk1
+/- mutanter i en modell for smitte av
S
. Typhimurium. Vi brukte
Mclk1
+/- mutanter og søsken villtype kontroller på 129S6 /SvEvTac (129S6) genetisk bakgrunn. Mus med denne bakgrunnen er villtype på
Slc11a11
locus og kan overleve
S
. Typhimurium-infeksjon, men kan ikke fjerne bakteriene helt og dermed utvikle en kronisk infeksjon [20]. Vi injisert mutanter og villtype-kontroller intravenøst i en dose på 1140 CFU per mus og avsluttet leverbakteriemengden (CFU per gram vev) etter 40 dager. Mutantene viser en liten, men statistisk signifikant reduksjon av ~9%, en indikasjon på en noe mer effektiv immun kontroll av
S.
Typhimurium-infeksjon (figur 1A).
A. Lever bakterielle belastning ble evaluert 40 dager etter smitte i 3 måneder gamle mus og var lavere i
Mclk1
+/- mutanter. Tre uavhengige eksperimenter ble utført. I hvert forsøk var den gjennomsnittlige CFU per gram vev fra hver mutant (
Mclk1
+/-) og villtype dyr (
Mclk1
+ /+) var normalisert til gjennomsnittet av villtype gruppen i det eksperimentet. I alt 35 vill-type dyr og 23 mutanter ble normalisert på denne måten og resultatene slått sammen. Gjennomsnitt ± S.E.M. av bassenget er vist. * Indikerer p 0,05. B. leverfibrose ble bestemt i infiserte og ikke-infiserte grupper på dag 40 etter smitte ved hjelp Picrosirius Red farging. Den fraksjon av arealet av seksjoner som flekker for kollagen er vist. Gjennomsnitt ± S.E.M. er vist. Det var 9-14 dyr i hver gruppe. C. og D. Oksidativ skade på proteiner ble evaluert ved Oxyblot analysen. Alle prøver som ble brukt var fra kullbror par. En representant Resultatet vises i C. Intensiteten av flekker i hvert kjørefelt ble kvantifisert og normalisert ved at villtype i samme blot. Gjennomsnitt ± S.E.M. i hver gruppe er vist i diagrammet, og parrede t-tester ble brukt for sammenligning. E. oksidativ skade på DNA ble bestemt ved måling 8-OHdG nivåer ved hjelp av renset total lever DNA. Kull parene ble brukt (
Mclk1
+/- vs.
Mclk1
+ /+): 5 par uten infeksjon og 6 par ofret 40 dager etter smitte. Gjennomsnitt ± S.E.M. i hver gruppe er vist i grafen; paret t-test ble anvendt for sammenligning. F. Plasma ALT-aktiviteten ble målt 40 dager etter infeksjon. Det ble 8-14 dyr i hver gruppe og gjennomsnitt ± S.E.M. i hver gruppe er vist. For B-F, forskjellene mellom de mutante og vill-type-gruppene er signifikant med, men ikke uten, infeksjon på p 0,05. Alle eksperimentene i dette tallet ble utført med menn.
Mclk1
+/- Mutants Sustain Mindre vevsskade i Response til
S.
Typhimurium infeksjon
bakteriell infeksjon og immunreaksjon mot det fører til skade på vev, inkludert oksidativ skade. I leverprøver fra samme dyr som på figur 1A vi også testet fibrose (figur 1B), oksidativ skade på proteiner, ved hjelp av oxyblot (figur 1C og 1D), og oksidativ skade på DNA, ved å måle nivåene av 8-OHdG (figur 1E). I plasmaprøven fra disse dyrene målte vi alanin-amino-transferase (ALT), et mål for skade på leverceller (figur 1F). Det var en stor økning i alle fire målene i infiserte dyr sammenlignet med ikke-infiserte kontroller. Men økningen var betydelig mindre markert i muterte dyr for alle fire målene. Faktisk, i tilfelle av fibrose var det ingen økning i det hele tatt. Nivåene av fibrose var svært lav, men forskjellen mellom genotypene etter smitte er betydelig likevel, og er også i tråd med andre funn på følsomhet for fibrose i
Mclk1
+/- mutant mus (se nedenfor ). Legg merke til at i dette eksperimentet vi ikke kan fastslå hvorvidt det lavere nivået av skaden skyldes den reduserte bakteriemengde eller en endring i nivået for skade produsert av immunresponsen i seg selv.
Mclk1
+/- mutanter viser en endret immunreaksjon til
S.
enteritidis Infeksjon
Vår opprinnelige observasjoner at immunsystemet påvirkes av høy mitokondrie oksidativt stress i
Mclk1
+/- mutanter ble utført på C57BL /6J bakgrunn [13]. For eksempel, er det på denne bakgrunn som vi har observert at mutantene svart på et lavt nivå av LPS behandling med en mye større høyde av sirkulerende plasma cytokiner. Men
S.
Typhimurium infeksjoner er dødelig på C57BL /6J bakgrunn, som bærer et tap-av-funksjon mutasjon på
Slc11a11
locus [21]. I kontrast, eksperimentelle intravenøse infeksjoner med en annen serovar,
Salmonella
enteritidis, kan være helt fjernet fra leveren 40 dager etter smitte på C57BL /6J bakgrunn [22]. Hvis du vil koble funn med eksperimentelle infeksjoner til vårt tidligere arbeid på denne bakgrunn vi først testet om immunreaksjon på
S.
Enteritidis var annerledes i mutantene, som det var å LPS. Ved hjelp av en analyse (Luminex) der nivået på 10 plasma cytokiner kan samtidig vurderes, bestemmer vi cytokin nivåer 7 dager etter infeksjon med
S.
Enteritidis (figur 2A). Vi har funnet at både pro-inflammatoriske cytokiner (Th1-IL-1 p, IL-6 og IFN-y) og anti-inflammatoriske cytokiner Th2 (IL-4 og IL-10) ble forhøyet sammenlignet med kontroller. I tillegg har IL-2, IL-5 og GM-CSF viste en klar trend mot en tilsvarende høyde. Samlet sett tyder disse funnene at flere aspekter av immunreaksjon til
S.
Enteritidis infeksjon i
Mclk1
+/- mutanter er mer uttalt enn i villtypen.
Tre måneder gamle kullsøsken av begge genotyper ble smittet intravenøst med 1800 CFU per mus, deres plasma samles etter 7 dager og evaluert for cytokin nivåer. For hvert cytokin verdiene ble normalisert til gjennomsnittsverdien målt for
Mclk1
+ /+ kontrollgruppe. Utvalgsstørrelsen var 32-38 for hver genotype. Stjernene representerer p 0,05. B. Tre måneder gamle mus på C57BL /6L bakgrunn ble tildelt i 3 grupper av 9-12 mus for hver genotype. Hver mus ble infisert intravenøst med 10
3 CFU
S.
Enteritidis. Bakterie belastninger i leveren ble målt på dag 7, 21 og 42 etter smitte. C. Plasma ALT-aktiviteten ble målt på dag 7, 21 og dag 42 etter infeksjon. 5-13 mus i hver genotypisk gruppe ved hvert tidspunkt ble anvendt, og gjennomsnitt ± S.E.M. er vist. Alle eksperimentene i dette tallet ble utført med partall av både menn og kvinner.
For å finne ut om de forskjellige reaktivitet til infeksjonen som vitne av høyere cytokin nivåer ble endre clearance av bakterier fra lever vi bestemme bakteriemengden på 7, 21 og 42 dager etter infeksjon (figur 2B). Det ble ikke observert noen signifikant forskjell mellom mutanten og villtype bakteriemengden til enhver tid etter infeksjon. Imidlertid, til tross for lignende bakteriemengde, skader på leveren, som målt via plasma ALT nivåer, ble redusert på dag 7 i
Mclk1
+/- mutanter og viste den samme tendens mot reduksjon i andre dager (figur 2C).
Mclk1
+/- Mutants Sustain en tregere Økning av Tissue skade over tid og som svar på
S
. enteritidis Infeksjon
i en tidligere studie, observerte vi at den gradvise utviklingen av mitokondrie og oksidative biomarkører på aldring ble bremset i
Mclk1
+/- mutanter i forhold til søsken
Mclk1
+ /+ kontroller [17]. For å kunne fortsette våre studier i C57BL /6J bakgrunn vi først undersøkt om noen av markører for skade som vi hadde observert å være lavere etter
S.
Typhimurium-infeksjon oppførte seg som biomarkører på aldring i C57BL /6J mus . For dette vi først fastslått at leverfibrose, et mål for kumulativ skade på vev og plasma-alanin aminotransferase (ALT) aktivitet er et mål på kontinuerlig leverskade [23], øker med alderen i denne bakgrunnen (figur 3A og 3B). Vi deretter målt fibrose og ALAT hos unge (3 måneder gammel) og gamle (23 måneder gammel) mutanter og kontroller på C57BL /6J bakgrunn (figur 3C og 3D). For begge merkene var det ingen forskjell i unge dyr, men en markert reduksjon i mutantene sammenlignet med kontroller ble observert i gamle dyr.
A. Nivået av leverfibrose i villtype C57BL /6J mus av ulik alder ble bestemt. Utvalgsstørrelser var 5-16 og gjennomsnitt ± SEM av hver aldersgruppe er vist. Stjernene indikerer statistisk signifikans i forhold til den umiddelbart yngste aldersgruppen av en t-test. * Står for P 0,05, ** for P 0,01, og *** for P 0,001. B. Plasma ALT-aktiviteten av villtype C57BL /6J mus ble målt og gjennomsnitt ± S.E.M. av hver aldersgruppe er vist. Utvalgsstørrelser var fra 5 til 14. C. Nivået av leverfibrose hos unge og gamle
Mclk1
+/- mutanter på C57BL /6J bakgrunn og deres
Mclk1
+ /+ søsken ble bestemt. Utvalgsstørrelse var 5 for 3 måneder gammel kohort og 17-20 for 23 måneder gamle kohort. D. ALT aktivitet i
Mclk1
+/- mutanter og
Mclk1
+ /+ søsken på C57BL /6J bakgrunn ble målt til 3 måneder og 23 måneders alder . Det var fem mus for hver genotype i 3 måneder gamle årsklasse, og fra 15 til 16 mus i 23 måneder gammel kohort. E. Nivået av leverfibrose ble bestemt etter 3 runder med enteritidis smitte
S.
. Det var 11-16 mus i hver gruppe; gjennomsnitt ± S.E.M. i hver gruppe er vist. Stjernene indikerer statistisk signifikans sammenlignet med villtype-gruppen av en t-test. * Står for P 0,05. Alle eksperimentene i dette tallet ble utført med partall av både menn og kvinner.
En hypotese for å forklare den lave skader i gamle
Mclk1
+/- mutanter er at det resultater fra en levetid på mindre skadelige immunresponser mot infeksjoner og andre inflammatoriske prosesser (som foreslått av forsøkene med
S.
Typhimurium). For ytterligere å teste denne ideen vi tok fordel av det faktum at
S.
Enteritidis er fullstendig fjernet fra leveren på mindre enn to måneder i C57BL /6J bakgrunn [22]. Det ble derfor gjennomført en gjentatt-infeksjon studie hvor mus ble infisert 3 ganger på 2 måneder intervall starter på 3 måneders alder, og plasma ALT samt leverfibrose ble målt én måned etter siste infeksjon. Som vist i figur 3E, ble leverfibrose i villtype dramatisk forhøyet sammenlignet med alderstilpassede friske kontroller. Graden av skaden ble observert i området fra det som ble observert i ikke-infiserte, men eldre, 13 måneder gamle mus (figur 3A), noe som bekrefter at leverfibrose er en kumulativ skade markør som er akselerert av infeksjon. I motsetning til villtypen situasjonen,
Mclk1
+/- mutanter var upåvirket av 3 runder på infeksjon (figur 3E), forsterker vår tolkning at den nedre delen av fibrose hos infisert gammel
Mclk1
+/- mutanter (figur 3C) kan være et resultat av et liv med mindre skadelige immunresponser, som i sin tur kan være en del av det som gjør det mulig for mutantene «levetid. Fremtidige studier for å forstå den lave fibrotisk reaksjon i
Mclk1
+/- mutanter bør omfatte studiet av signalisering gjennom TGF-β, et molekyl som er ofte knyttet til regulering av fibrose.
i motsetning til fibrose, ALT nivåer var helt upåvirket etter tre runder med infeksjon (ikke vist). Dette er i tråd med hva vi hadde observert etter en enkelt runde av smitte med
S enteritidis (figur 2C).
, Når ALAT, som var lavere i
Mclk1
+/- mutanter umiddelbart etter infeksjonen var tilbake til det normale 40 dager senere. Dette er i motsetning til hva vi har observert med
S.
Typhimurium-infeksjon, som ikke er fjernet, men fortsatt kronisk, og hvor ALAT er fortsatt sterkt forhøyet etter 40 dager (figur 1F). Dette bekrefter at ALT er ikke et mål på akkumulering av skade, men heller av den pågående skader. Disse funnene tyder også på at de høye ALAT observert i gamle villtype dyr (Figur 3D) er et mål på løpende patologiske prosesser.
Mitokondrie Oksidativt stress Per Se ikke stimulere immunrespons Nor Reduser Fibrotiske Damage
Mutants heterozygote for en knockout av mitokondrie superoxide dismutase genet
Sod2, etter som er fullt levedyktig, vise forhøyet mitokondrie oksidativt stress som
Mclk1
+/- mutanter [17 ], [24], [25]. Vi undersøkt om effekten av
Mclk1
+/- mutasjon på immunrespons og skaden ble også indusert i
Sod2
+/- mutanter.
Mclk1
+/- mutanter reagere på meget lave nivåer av LPS (0,01 mg /kg) med en dramatisk økning av serum cytokinnivåer, spesielt TNF-α, som ble observert ved den multiple-cytokin Luminex test samt av en TNF-α-spesifikk ELISA [13]. Vi testet 3 måneder gamle
Sod2
+/- mutanter for reaktivitet til meget lavt nivå av LPS og fant ingen økning av plasma TNF-α sammenlignet med villtype-kontroller (Figur 4A). Vi har også testet nivået av leverfibrose i alderen mutanter (16 måneder gamle) (figur 4B). Det var ingen nedgang i fibrose i mutantene, men en sterk trend som antyder en dramatisk økning i fibrose. Disse funnene er i tråd med hypotesen om at reduksjonen i alders- og infeksjon avhengig skade, spesielt fibrose, observert i
Mclk1
+/- mutanter skyldes deres forbedret immunrespons, snarere enn fra andre fysiologiske endringer som kan være forårsaket av forhøyet mitokondrie oksidativt stress.
å. TNF-α nivåer i plasma på 3 måneder gamle
Sod2
+/- mutanter og styrer to timer etter intraperitoneal injeksjon av 0,01 mg /kg LPS, målt ved hjelp av ELISA. En t-test indikerer ikke noen forskjell i TNF-α nivåer mellom
Sod2
+/-
mutanter og kontroller (n = 15-17, feilfelt representerer S.E.M.). B. Nivået av leverfibrose i
Sod2
+/- mutante hanner og kontroller ved 16 måneders alder ble bestemt. Det var 6 og 11 mus i
Sod2
+/- og
Sod2
+ /+ grupper, henholdsvis. Alle eksperimentene i dette tallet ble gjennomført med kun menn.
indirekte bevis for forsinket startfasen og /eller vekst i
Mclk1
+/- Mutants
Vurderer noen effekt av
Mclk1
+/- mutant genotype på kreft er interessant av to grunner:
i
) kreft er helt klart en aldersavhengig sykdom og
ii
) kreften hastigheten antas å bli holdt lav ved mekanismer av immunovervåkning. For å teste muligheten for at fenotype av
Mclk1
+/- mutanter påvirker kreftutviklingen vi bygget et
Mclk1
+/-
Trp53
+/- dobbelt mutantstamme på C57BL /6J bakgrunn.
Trp53
+/- mutanter spontant utvikle svulster, særlig sarkomer, etter omtrent ett år [26]. Vi produserte grupper av
Trp53
+/- (n = 20) og
Mclk1
+/-
Trp53
+/- ( n = 37) hunner ved å krysse
Trp53
– /- hannene til
Trp53
+/-
Mclk1
+/- kvinner. Vi undersøkte overlevelsen av disse dyrene og målte størrelsen av synlige sarkomer på tidspunktet for død. Den gjennomsnittlig og maksimal levetid for de doble mutanter ble økt i forhold til
Trp53
+/- dyr (figur 5A), tyder på en langsommere initiering eller vekst av svulster. Men den totale forekomsten av sarkom utvikling var sammenlignbar mellom de to genotyper (ikke vist) og vekten av sarkomer som kan bli identifisert i løpet av obduksjon viste bare en trend mot mindre svulster i de doble mutanter (figur 5B). Imidlertid kan disse resultatene fortsatt peke til tregere startfasen eller vekst fordi svulster ble scoret ved obduksjon og doble mutanter levde lengre, noe som tyder på at dyrene hadde mer tid til å utvikle svulster tilstrekkelig store til å score.
A. Kaplan-Meier overlevelseskurver av
Mclk1
+ /+
Trp53
+/- (n = 20) og
Mclk1
+ /-
Trp53
+/- (n = 37) mus. Betydningen av forskjellen var P 0,05 ved log-rank (Mandel-Cox) test med GraphPad Prism versjon 5.00 for Windows (GraphPad Software, San Diego). B. vekt på spontan sarkom scoret ved obduksjon av dyrene i A., og uttrykt som prosent av kroppsvekten;
Mclk1
+ /+
Trp53
+/- (n = 9) og
Mclk1
+/-
Trp53
+/- (n = 19). C. kroppsvekter over tid av dyrene i A. D.-F. En kohort distinkt fra dyrene i A. ble analysert for tegn på kakeksi;
Mclk1
+ /+
Trp53
+/- (n = 12) og
Mclk1
+/-
Trp53
+/- (n = 8). Alle mus ble humant avlivet ved 54 ukers alder. Baklabb muskel vekt ble målt og uttrykt som i forhold til kroppsvekt (D). De mRNA ekspresjonsnivåer av to muskel spesifikk E3 ubiquitin-ligaser, Atrogin-1 og MuRF1, ble målt ved hjelp av RT-PCR, vist i (E) og (F), respektivt. Betydning for den aldrende kurvene ble etablert av en log-rank test. Betydningen nivåer for dataene i B. og D.-F. ble testet ved t-tester, med stjernene som stiller til p 0,05. Alle eksperimentene i dette tallet ble gjennomført med bare kvinner.
Trp53
+/- mutanter brått begynte å miste vekt etter 54 uker, antagelig på grunn av tumorindusert kakeksi , men denne effekten var mye mindre alvorlig i den doble mutanter (figur 5C). For å undersøke dette spørsmålet ytterligere produserte vi ytterligere to grupper av
Trp53
+/- (n = 12) og
Mclk1
+/-
Trp53
+/- (n = 8) doble mutanter. Ved 54 ukers alder, umiddelbart før den observerte begynnelsen av vekttap i den innledende forsøket, vi undersøkte parametere knyttet til kakeksi, som muskelvekt og ekspresjon av kreftkakeksi assosierte gener i muskler, så som de som koder for den muskel-spesifikke ubiquitin ligaser MuRF1 (
Trim63
) [27] og Atrogin-en (
Fbxo32
) [28] (figur 5E-F). Muskel vekt var høyere i de doble mutanter, og
MuRF1 Hotell og
Atrogin-en
genekspresjon var lavere. Merk at tregere utvikling av kakeksi er forenlig med tanken om en tregere initiering og vekst av svulster.
direkte bevis for forsinket startfasen i
Mclk1
+/- Mutants
for å få mer direkte bevis for en effekt av
Mclk1
+/- på startfasen og vekst vi valgt en modell [29] hvor 10
4 Lewis lungekarsinom celler ( LLC1 celler, aka 3LL celler) ble podet subkutant i 3 måneder gamle mutanter og kontroller (Figur 6A). Med denne modellen har vi funnet at startfasen ble betydelig forsinket i
Mclk1
+/- mutanter (figur 6B). En trend mot lavere svulst forekomst ble også observert, men var ikke signifikant (ikke vist). Men når en synlig svulst hadde dukket opp svulsten veksten var ikke forskjellig i de to genotyper (figur 6C).
A. LLC1 mus lungekreft celler ble injisert subkutant i riktig supra-scapulær areal på 10 uker gammel
Mclk1
+/- mutanter (n = 19) og søsken kontroller (n = 18) i C57BL /6J bakgrunn i en dose på 10
4 celler /mus. Tidspunktet for første opptreden av synlige svulster ble registrert og deres vekst senere fulgt. Panelet viser tumor størrelser på dag 28 etter vaksinasjon. B. Gjennomsnittlig dag svulst utseende etter pode i begge genotyper. Stjernene indikerer signifikans på P 0,01 av en t-test. C. Tumor vekstkurver avsløre igjen forskjellen i ventetid, men viser også tilsvarende vekstrater når svulster har dukket opp. Data etter dag 28 er ikke tilgjengelig for svulster på villtype dyr fordi disse dyrene måtte bli humant avlivet på grunn av tumorstørrelse. D. To kullene av 8-12 mus for hver genotype ble anvendt for å måle milt lymfocytt cytotoksisitet mot LLC1 celler in vitro etter 15 og 20 dager etter inokulering. Gjennomsnitt ± S.E.M. i hver gruppe er vist. Stjernene indikerer signifikans på p 0,05 av en t-test. Alle eksperimentene i dette tallet ble utført med partall av både menn og kvinner.
Forbedret immunreaksjon mot tumorceller i
Mclk1
+/- Mutants
Vi har søkt å finne ut om immunforsvaret spilte en rolle i svulsten latency fenotype av
Mclk1
+/- mutanter observert i pode modell. Cytotoksiske CD8 + T-celler antas å delta i immunreaksjon mot kreftceller [30], [31]. Således, ekstrahert vi miltlymfocytter fra pode-verter, isolerte CD8 + T-celler ved magnetiske kuler separasjon og testet for deres cytotoksisitet mot LLC1 celler in vitro [29], [32]. Etter at både 15 og 20 dager etter poding cytotoksisiteten av lymfocyttene fra
Mclk1
+/- var større enn for kontrollene (figur 6D). På dag 15 og dag 20 var det ingen eller kun meget små svulster på disse dyrene (på lignende måte som hva vi observert i kohort vist i figur 6C). Dette tyder på at forskjellen i immunsystemet reaktivitet mot podet celler, noe som fører til flere, eller mer aktive, cytotoksiske effektorceller kunne være ansvarlig for forsinkelsen i startfasen.
Diskusjoner
Vi har vist tidligere at
Mclk1
+/- mutanter opprett høy mitokondriell oksidativ stress så unge dyr [16], [17]. Dette var en overraskelse fordi
Mclk1
+/- mutanter alder sakte, som vurdert av biomarkører av aldring, og kan være langvarige, mens mitROS har generelt vært ansett for å være skadelig og muligens en årsak til aldring. I lys av de mange funn som ROS er signalmolekyler og at dyr som nakne muldvarp-rotter kan være langlivet på tross av forhøyet oksidativt stress [33], [34], vi har tolket våre funn til å bety at mitROS ikke forårsaker aldring, men kan i stedet være knyttet til aldring fordi de fungerer som signalmolekyler som slår på beskyttelsesmekanismer som en reaksjon på aldersavhengig molekylær skade [35], [36]. I vår påfølgende søk etter mitROS-avhengige beskyttende mekanismer avdekket vi at immunforsvaret til
Mclk1
+/- mutanter ble aktivert og svært reaktive, muligens via stabilisering av HIF-1α ved mitROS i lever og i makrofager og muligens i andre vev [13].
Den høye mitokondrie oksidativt stress i
Mclk1
+/- mutanter kan ikke i seg selv være ansvarlig for sin gunstige fenotype, som å senke oksidativt stress i mitokondriene kan produsere gunstige fenotyper [37], og som
Sod2
+/- mutanter, som har en mitokondrie fenotype svært lik som
Mclk1
+ /- mutanter [17], ikke viser det samme langsom utvikling av biomarkører for aldring [17]. Her viser vi i tillegg at
Sod2
+/- mutanter, i motsetning til
Mclk1
+/- mutanter, viser ikke en overdrevet heving av plasma TNF-α som respons på LPS, og heller lav fibrose (figur 4). Forskjellen mellom de effekter som høy mitokondrie oksidativt stress har i
Mclk1
+/- og
Sod2
+/- mutanter kan være knyttet til rollen som MCLK1 i UQ biologi. Ja, vi har nylig funnet ut at
Mclk1
+/- mutanter har lave UQ nivåer i den indre mitokondrielle membranen, noe som sannsynligvis er ansvarlig for mitokondrie fenotype, men også vise forhøyede UQ nivåer i ytre mitokondriemembranen , som kan forandre hvordan mitROS signal til resten av cellen [15].
Her har vi bedt om endret immunrespons hos
Mclk1
+/- mutanter er faktisk beskyttende og dermed kunne delta i å fremme lang levetid. I vår tidligere studie [13] vi stort sett utforsket betennelse. For eksempel, testet vi effekten av LPS på sirkulerende cytokiner to timer etter behandlingen.
