Abstract
Side befolkningen (SP) og ABC transportør uttrykk berike for stamceller i mange vev . Vi utforsket om dette fenotype preget menneske blærekreft stamceller (cscs) og forsøkt å identifisere reguleringsmekanismer. Med fokus på ikke-muskel invasiv blærekreft (NMIBC), ble flere humane cellelinjer brukes til å karakterisere SP og ABC transportør uttrykk.
In vitro Hotell og
in vivo
fenotypiske og funksjonelle vurderinger av CSC oppførsel ble foretatt. Ekspresjon av antatte CSC markør ABCG2 ble undersøkt i kliniske prøver NMIBC (n = 148), og en rolle for MAPK signalering, en sentral mekanisme av blære tumorgenesen, ble undersøkt. Resultatene viste at ABCG2 transporter ble hovedsakelig uttrykt og var oppregulert i SP brøkdel av tre ganger (ABCG2
hi) i forhold til ikke-SP (NSP) fraksjon (ABCG2
lav). ABCG2
hi SP celler vises berikelse av stamcellemarkører (Nanog, Notch1 og SOX2) og en tredobling i kolonidannende effektivitet (CFE) i forhold til ABCG2
lave NSP celler.
In vivo
, ABCG2
hi SP celler beriket for tumorvekst sammenlignet med ABCG2
lave NSP celler, i samsvar med cscs. Perk var konstitutivt aktiv i ABCG2
hi SP celler og MEK hemming også hemmet ABCG2
hi SP fenotype og undertrykte betydelig CFE. Videre på å undersøke kliniske NMIBC prøver, ABCG2 uttrykk korrelerte med økt regelmessighet og redusert progresjonsfri overlevelse. I tillegg Perk uttrykk også korrelert med redusert progresjonsfri overlevelse, mens en positiv korrelasjon ble videre påvist mellom ABCG2 og Perk uttrykk. I konklusjonen, bekrefter vi ABCG2
hi SP beriker for cscs i menneskelig NMIBC og MAPK /ERK veien er et egnet terapeutisk mål
Citation. Hepburn AC, Veeratterapillay R, Williamson SC, El-Sherif A, Sahay N, Thomas HD, et al. (2012) Side Befolkning i Human Non-blærekreft beriker for kreftstamceller som vedlikeholdes av MAPK Signale. PLoS ONE 7 (11): e50690. doi: 10,1371 /journal.pone.0050690
Redaktør: Dean G. Tang, The University of Texas M.D Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 27 juli 2012; Akseptert: 23. oktober 2012; Publisert: 30.11.2012
Copyright: © 2012 Hepburn et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av JGW Patterson Foundation og NHS skapet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Transitional karsinom (TCC) i urinblæren har en verdensomspennende årlig forekomst på over 350.000 nye tilfeller og 145.000 dødsfall [1]. I USA er det den femte vanligste kreftformen sto for over 70.000 nye tilfeller i året, og en estimert årlig forbruk på $ 3.5 milliarder på kreftbehandling [2], [3]. Selv om 85% av pasientene stede med mindre aggressive non-muskel invasiv blærekreft (NMIBC), de har en høy risiko for tilbakefall og de med ugunstige egenskaper som multifokal sykdom, høye svulster klasse, med eller uten samtidig carcinoma in situ (CIS) , er spesielt utsatt for sykdomsprogresjon. Intravesikal Bacille Calmette-Guérin (BCG) kan redusere risikoen for utvikling med 27% hos pasienter med høy risiko NMIBC [4], men de som ikke svarer typisk gjennomgå sykelig kirurgi for å fjerne blæren. For pasienter som presenterer med, eller utvikle seg til, muskel invasiv blærekreft (MIBC), er sjansen for å overleve mer enn 5 år etter behandling er ca 50-60% [5], [6]. Denne bakgrunnen indikerer at nye terapeutiske tilnærminger mot NMIBC er sterkt behov for å utrydde sykdommen før en invasiv fenotype utvikler [7].
Nylige fremskritt i kreft biologi har tatt med karakterisering av kreft stamceller (cscs), en liten undergruppe av tumorceller som er tumor initierende og driver produksjon av resten av kreft. Cscs er blitt beskrevet i et økende antall tumorsteder, inkludert hematopoetisk, bryst, tykktarm, prostata melanom og [8] – [12]. Det er blitt klart at det er viktig å målrette disse cellene som de bestemmer behandlingsrespons [13]. Kategoriseringen og valg av en side befolkningen (SP) fenotype ved flowcytometri [14] beriker for cscs i mange svulster [15] – [18]. Nyere demonstrasjon av SP i blærekreft nødvendig videre etterforskning av sin potensielle rolle i karakter cscs [19].
patogenesen av blærekreft vises nært knyttet til forskjellige molekylære stier [20], [21]. Over 70% av NMIBCs havn aktiverende mutasjoner av fibroblast-vekstfaktor-reseptor-3 (FGFR3) som fører til konstitutiv aktivering av MAPK-signalering [22], [23]. Videre oppregulering av EGFR /ErbB-familien reseptorene er assosiert med økende grad og stadier av blærekreft [24], [25]. Av betydning, er SP fenotype mediert av ATP-bindende kassett (ABC) familie av transportørproteiner [14], og den brystkreft-resistente protein-1 (BCRP1) /ABCG2 transportør har vist seg å være den viktigste mediator for denne fenotype [26]. Spesielt er ABCG2 i sin tur reguleres av MAPK [27] og en rolle for MAPK /ERK-signalveien i reguleringen av SP har vært foreslått (Tsichuda et al 2008).
Som et første trinn i å informere utformingen av nye behandlingsformer for NIMBC, rettet vi å karakter cscs i human blærekreft ved bruk av SP utvalg og utforske regulering gjennom MAPK /ERK signaliserer aksen.
RT112, RT4, J82 og 253JB-V celler ble farget med Hoechst 33342 fargestoff alene eller i nærvær av reserpin og analysert ved flow-cytometri måle Hoechst blå vs Hoechst rød fluorescens. SP ble gated og representert som en prosentandel av hele levedyktige cellepopulasjon følgende PI utelukkelse (gjennomsnitt ± SE).
Relativ mRNA uttrykk for ABCA2, ABCG2, MRP1 og P-glykoprotein ble bestemt i SP og NSP fraksjoner av RT112 (A) og RT4 (B) celler ved hjelp av sanntids PCR. Dataene som vises er gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter som hver er utført i triplikat (gjennomsnitt ± SE). * P 0,05 (Student tosidige
t
-test). Hemming studier ble utført på RT112 (C) og RT4 (D) celler ved hjelp ABCG2-spesifikk hemmer fumitremorgin C (FTC) og P-glykoprotein hemmer verapamil.
Materialer og metoder
reagenser og celle~~POS=TRUNC kultur~~POS=HEADCOMP
human blærecancercelle RT4, RT112 og J82 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket i RPMI 1640 (Sigma) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1 % L-glutamin – referert til som fullt media (FM). Den svært metastatisk human TCC cellelinje 253JB-V ble generøst gitt av professor Colin Dinney [28] og dyrket i MEMalpha media supplert med 5% FBS. Alle celler ble dyrket ved 37 ° C i nærvær av 5% CO
2. MEK1 /2 spesifikk inhibitor, U0126 (Cell Signal teknologi), og rEGF (Sigma) ble anvendt i studier for å modulere MAPK-signalering. Kontrollceller for sammenligning inkludert kulturer i basal media (BM) mangler FBS og FM.
Hoechst Dye utstrømning Analyse
Celler ble farget med Hoechst 33342 fargestoff hjelp modifisering av en tidligere beskrevet protokoll [14] . I korthet ble Hoechst 33342 fargestoff (2,5 ug /ml) tilsatt alene eller i nærvær av reserpin (50 uM), verapamil (50 uM) eller fumitremorgin C (10 uM) og cellene ble inkubert ved 37 ° C i 90 minutter og ristet hvert 30. min. marker celleoverflaten analyserer følgende Hoechst 33342 fargestoff flekker ble utført med anti-ABCG2-FITC (klone 5D3, Millipore) co-merking på is i 20 min. Normal mus-IgG-FITC ble anvendt som isotypekontroll (Upstate). Propidiumjodid (PI) (2 ug /ml) gated levedyktige celler. Analyse og sortering ble utført på en FACSDIVA flowcytometer (Becton Dickinson).
RNA Utvinning og Real-time PCR-analyse
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp av høy Pure RNA kit (Roche) og reverstranskribert ved hjelp av tilfeldige primere (Promega) og Hevet III revers transkriptase enzym (Invitrogen). Real time PCR ble utført med SYBR Grønn Mastermix inneholder Rox ™ og UDG (Invitrogen) ved hjelp av ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). For primer sekvenser se tabell S1. Ekspresjonsnivåer ble normalisert til GAPDH husholdningsgenet.
(A) FACS sorterte celler ble sådd i 6-brønns plater ved en tetthet på 1 x 10
2 celler /brønn og koloniene ble tellet etter 2 ukers . Kolonidannende effektivitet (CFE) ble beregnet som beskrevet i Materialer og Metoder. Dataene som vises er den gjennomsnittlige (± SE) av tre uavhengige eksperimenter hvert foretatt in triplo. * P 0,05 (Student tosidige
t
-test). (B) Cell sykkelprofiler RT112 ABCG2
hi SP og ABCG2
lave NSP celler som viser en økning i S-fasen i ABCG2
hi SP brøkdel. (C) Serie utvalg, sub-kultur og cytometri fraksjonering mellom RT112 SP og NSP celler. SP og NSP celler sortert fra RT112 ble dyrket i to uker, restained med Hoechst 33342 fargestoff og reanalysed av flowcytometri. Denne prosessen ble gjentatt 4 ganger.
(A) 1 x 10
3 ABCG2
hi SP og ABCG2
lav NSP sortert RT112 celler ble subkutant injisert i hårløse mus og overvåkes for tumorvekst. (B) Immunhistokjemisk farging av seriesnitt, svulster avledet fra mus injisert med 1 × 10
3 ABCG2
hi SP og restcelle pellets fra mus injisert med 1 × 10
3 ABCG2
lav NSP sorterte RT112 celler, med H E og ABCG2 og ved høyere forstørrelse (20x). Betydelig økt immunoreaktivitets for ABCG2 er sett i ABCG2
HISP avledet svulster. (C) Relativ mRNA uttrykk for ABCG2 i svulster som dannes etter injeksjon av 1 x 10
3 ABCG2
hi SP og ABCG2
lav NSP sortert RT112 celler ble bestemt ved hjelp av sanntids PCR. (D-F) Relativ mRNA uttrykk for Nanog, Notch1 og SOX2 i tumorer dannet etter injeksjon av 1 x 10
3 ABCG2
hi SP og ABCG2
lav NSP sortert RT112 celler ble bestemt ved hjelp av sanntids PCR. (G) Immunhistokjemisk farging av seriesnitt, av svulster som dannes etter injeksjon av 1 x 10
3 ABCG2
hi SP og ABCG2
lav NSP sortert RT112 celler, med Nanog, Notch1 og SOX2.
Colony Forming Assay
FACS-sortert celler ble sådd inn i seks-brønns plater ved en tetthet på 100 celler /brønn. Etter 14 dager ble kolonier fiksert med Carnoy sin fikseringsmiddel og farget med 0,4% krystallfiolett (w /v) for kolonitelling ved hjelp av ColCounter (Oxford Optronix), utelate 64 cellekolonier som de representerer tidlig mislykket kolonier. Colony forming effektivitet (CFE,%) ble beregnet som [(no. Kolonier telles /nei. Celler seeded) × 100].
Cell Cycle
FACS sorterte cellene ble farget med DAPI for celle syklus analyse ved hjelp CyStain DNA 2step kit (Partec). Propidiumjodid (2 ug /ml) gated levedyktige celler. Å diskriminere mot kjernefysisk avfall og dubletter ble cellene inngjerdet på FSC og SSC. Flowcytometri cellesyklusen programvare (Cellquest Pro, BD Biosciences) ble brukt til å beregne DNA innhold og beregne subG1, G1, S-fase og G2M fase statistikk.
In vivo
Tumourigenicity
Dyreforsøk ble utført og gjennomført i henhold til gjeldende lover og forskrifter. Tjue tre kvinnelige atymiske CD1 nakne mus (Charles River, UK) ble injisert med RT112 SP og NSP sortert celler til høyre flanke underhud. Tumor vekst ble overvåket av todimensjonal måling med elektroniske kalippere med tumorvolumet beregnet ved hjelp av formelen
a
2
×
b /2
, der
en
er minste måling og
b
den største. Musene forsøkene ble avsluttet når svulster vokste til maksimalt 750 mm
3. Svulstene ble fjernet og halvert for immunhistokjemiske studier og sanntid PCR studier.
Immunohistochemitry
Formalin fast parafin innebygd arkivmateriale fra pasienter som gjennomgår endoskopisk reseksjon av blære tumor eller radikal cystektomi ble åpnet for immunhistokjemiske studier med riktig informert samtykke og etisk myndighetsgodkjennelse. I alt ble 148 NMIBC tilfeller farget med anti-ABCG2 (1:250; klone BXP-21, Millipore) og anti-p-ERK (1:100, E-4, Santa Cruz Biotechnology) før inkubasjon med sekundær biotinylert geite -mouse IgG antistoff (DAKO). Immunoreaktivitets ble visualisert ved hjelp Vectastain Avidin Biotin Complex Kit (Vector Laboratories) og 3’3′-diaminobenzidetetrahydrochloride. Scoring ble først vurdert av prosent og flekken intensitet. Men det store flertall av kjerner uttrykt ensartet epitelial farging med en enkelt intensitet, med heterogen farging til stede i bare noen få tilfeller. I disse kjernene, intensiteten med ble 50% område av flekker tatt som scorer. Den farging ble anmeldt og scoret uavhengig av tre sakkyndige som ble blindet for de kliniske data for å gi gjennomsnittlig score til fargeintensitet av fraværende (0), svak (1), moderat (2) eller sterk (3). Xenotransplantater ble også farget med anti-Nanog (1:5000, Cell Signal), anti-Notch 1 (1:500, C-20, Santa Cruz Biotechnology) og anti-SOX2 (1:500, Millipore).
Western blotting
Cellene ble lysert i SDS-prøvebuffer (0,125 M Tris pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol, 10% β-merkaptoetanol og 0,01% bromfenolblått) og analysert ved SDS-PAGE på 12% polyakrylamidgeler, etterfulgt av overføring til nitrocellulose Hybond ™ membran (Fisher Scientific). Antistoffer ble anvendt ved de følgende fortynninger: anti-ERK 1:500 (K-23, Santa Cruz Biotechnology) og anti-fosfo-ERK 1:500 (E-4, Santa Cruz Biotechnology). Pepperrotperoksidase-konjugert sekundære antistoffer (DAKO) ble brukt på 1:500 og oppdaget ved hjelp av forbedret chemiluminescence deteksjon kit (Fisher Scientific).
Statistical Analysis
For sanntid PCR studier, de to -endepåfestet sammenkoblet
t
-test ble anvendt for å bestemme statistisk signifikans ved et nivå på P 0,05. For immunhistokjemi, forskjeller i hyppighet og uttrykk for ABCG2 ble undersøkt ved hjelp av Mann-Whitney
U
test for å vurdere korrelasjoner med patologisk kreft klasse og scene. Pasient overlevelse ble analysert ved hjelp av Kaplan-Meier metoden med log-rank test, og multivariat analyse ble utført ved hjelp av Cox modell. Pearsons korrelasjon ble brukt til å korrelere ABCG2 og Perk uttrykk. Alle testene ble gjennomført ved hjelp av SPSS versjon 11.0 programvare (SPSS, Inc.). Alle testene var tosidig og en
P
verdi. 0,05 ble tatt for å indikere statistisk signifikans
(A) Western blot analyse ble utført med fosfor-ERK1 /2 og ERK1 /2 antistoffer. (B) RT112-celler ble plassert i FM alene eller i nærvær av U0126 (10 uM) i 30 minutter før farving med Hoechst 33342. Virkningen av U0126 på «hale» og «topp» ende kamrene ABCG2
HISP
+ ble undersøkt. (C) CFE av ABCG2
hi SP celler med økende konsentrasjoner av UO126 og forskjellige størrelser kolonier (≥1 mm, ≥2 mm og ≥3 mm i diameter).
(A) ABCG2 uttrykk i normal urothelium, lav karakter (LG) og høy klasse (HG) NMIBC er vanligvis uspesifikke og kan sees kjernekraft og cytoplasma. (B) Korrelasjon av ABCG2 farging intensitet med karakteren og stadium i NMIBC. (C) Kaplan-Meier-kurver som viser resultatene av ABCG2 intensitet (0, 1, 2 og 3) med tilbakefall og progresjonsfri overlevelse (p 0,001, analyserer Logg Rank). (D) Kaplan-Meier-kurver som viser resultatene av Perk intensitet (0, 1, 2 og 3) med progresjonsfri overlevelse (p 0,001, analyserer Logg Rank). (E) Korrelasjonen av ABCG2 og perk uttrykk (p = 0,005, Pearsons r = 0,99).
Resultater
SP Cells og ABC Transporter Expression kan identifiseres i Human blærekreft Cells
Vi undersøkte tilstedeværelsen av SP i to NMIBC cellelinjer (RT112 og RT4) og to MIBC cellelinjer (J82 og 253JB-V). Etter farging med Hoechst 33342, ble en SP identifisert i alle de fire cellelinjer som et distinkt hale som strekker seg fra hoved populasjonen med den karakteristiske lave fluoriserende profil i dobbelt bølgelengde-analyse (figur 1). Portstyringsstrategi gjennomføres ble fulgt som beskrevet av Golebiewska et. al. [29] (figur S1). Passende diskriminering av single og levedyktige celler er avgjørende for tilstrekkelig SP karakterisering. Median (± SE) andel av hver total cellepopulasjon føres etter SP var 12,8% (± 1,2%) i RT112, 15,3% (± 1,1%) i RT4, 2,7% (± 0,9%) i J82, og 1,0 % (± 0,5%) i 253JB-V. Den pan-ABC transportør hemmer reserpin bekreftet SP fenotype ved å blokkere Hoechst utstrømming og hemme lav rød /blå flekker fenotype som karakteriserer SP celler.
Vi vurderte ABC transporter uttrykk mønstre av blærekreftcellelinjer ved hjelp av real time PCR. Heterogene uttrykk for flere multilegemiddelresistente gener ble demonstrert i MIBC cellelinjer J82 og 253JB-V. Men i de NMIBC cellelinjer RT4 og RT112 høyere uttrykk for ABCG2 ble sett (figur S2).
ABCG2 er betydelig Beriket innen NMIBC SP Cells og opprettholder denne Phenotype
neste fokusert på NMIBC sykdom og undersøkt den relative mRNA-ekspresjon av fire ABC-transportører (ABCA2, ABCG2, MRP1 og P-glykoprotein) i RT112 og RT4 SP og NSP fraksjoner ved hjelp av sanntids-PCR (figur 2A og 2B) .De resultatene viste at i tillegg til ABCG2 er den største ABC transportør i NMIBC, sitt uttrykk var høyere i SP celler i forhold til NSP celler. Nøkkelrolle ABCG2 i generering av SP-fenotypen ble bekreftet ved fullstendig tap av SP populasjon etter behandling med den ABCG2-spesifikk hemmer fumitremorgin C (FTC) i forhold til den manglende effekt av behandling med P-glykoprotein-inhibitor verapamil (figur 2C og 2D). I motsetning til dette, P-glykoprotein var den mest uttrykt forskjellig og funksjonelt relevant ABC-transportør i MIBC cellelinje J82 (figur S3). Videre fikk vi bekreftet at i NMIBC celler SP fraksjonen ble assosiert med bare høyeste nivåene av ABCG2 (ABCG2
hi) uttrykk (figur S4).
SP Cells Berik for stamcelle Funksjon
in vitro
neste sammenlignet klonogene potensialet RT112 ABCG2
hi SP og ABCG2
lave NSP celler. ABCG2
hi SP celler viste en tredobling i gjennomsnittlig (± SE) kolonidannende berikelse til 56,7% (± 1,6%) fra 18,2% (± 0,2%) i ABCG2
lave NSP celler (figur 3A) . Tilsvarende økning i ABCG2
hi SP clonogenicity sammenlignet med ABCG2
lave NSP celler ble demonstrert i ekstra NMIBC cellelinje RT4 (figur S5). Etter den gating av ikke-levedyktige celler ved anvendelse av propidiumjodid, cellesyklusanalyse viste at en større andel av ABCG2
hi SP-celler i S-fase i forhold til ABCG2
lave NSP-celler, med en gjennomsnittlig (± SE) verdier på 19% (± 5%) versus 5,5% (± 1) til S-fase og 68% (± 8%) versus 94% (± 1%) for G1-fase, respektivt (figur 3B).
for å vurdere muligheten for ABCG2
hi SP celler til å fylle den opprinnelige fenotypiske spekteret av den overordnede RT112 cellelinje, utførte vi serie kulturer og valg av SP og NSP fraksjoner før re-farging med Hoechst 33342 og reanalysing av flyt cytometri (Figur 3C). Resultatene viste at etter den første seleksjonsrunde, kultur og flowcytometri, kulturer avledet fra både SP og NSP celler som hver ga opphav igjen til en tilsvarende fordeling av SP og NSP celler. Hvis denne prosessen ble deretter fortsatte med gjentatte sykluser av utvalget, separat kultur og flowcytometrisk sortering, andelen av celler fra SP subkulturer som ble plassert i SP brøkdel økt med hver runde, mens det var en markert nedgang i SP fraksjon av celler avledet fra NSP subkulturer.
Vi vurderte stamcelle markør uttrykk i RT112 ABCG2
hi SP og ABCG2
lave NSP celler ved real time PCR (figur S6a). ABCG2
hi SP celler viste økt uttrykk av Nanog, Notch1 og SOX2 forhold til ABCG2
lave NSP celler. I tillegg uttrykk for blære basalcellemarkører, inkludert CK14, CD44, CD49f (α6 inte) og CD104 (β4 inte) også forbundet med anrikning av cscs, ble undersøkt (Figur S6B). Alle basale cellemarkører ble uttrykt i ABCG2
hi SP celler, men tilsvarende nivåer av uttrykk ble også sett i ABCG2
lave NSP celler.
SP Cells Berik for Greater Tumor Starte Evne
in vivo
for å undersøke den komparative evne ABCG2
hi SP og ABCG2
lave NSP celler til å danne levedyktige svulster
in vivo,
sortert celler fra hver sub-populasjon var separat injisert subkutant i nakne mus CD1 og implantatet områder overvåkes med hensyn på vekst. Hurtig tumorvekst ble observert i 5 av 5, 5 5, og henholdsvis 3 av 3 dyr etter implantering av 10
3, 10
4, og 10
5 ABCG2
hi SP-celler. Men ABCG2
lowNSP tumorvekst ble utmattet av fortynning av seeding tallene til 10
3 celler, mens fem av fem mus innpodet med 10
3 ABCCG2
hi SP cellene vokste tumorer (tabell 1). Undersøke median tumorvolumet over tid avslørt eksponentiell vekst innen ABCG2
hi SP celle podestoff gruppe i motsetning til de som fikk ABCG2
lav NSP celler (figur 4A).
Immunhistokjemisk analyse av ABCG2 uttrykk i tumorer , som dannes etter injeksjon av 1 x 10
3 ABCG2
hi SP celler i forhold til de gjenværende celle pellets (som ikke var forbundet med noen aktiv vekst) høstet fra mus injisert med ABCG2
lav NSP sortert RT112 celler, viste økt uttrykk i ABCG2
HISP sammenlignet med ABCG2
lowNSP avledet svulster (figur 4B).
ettertid vist økt uttrykk av ABCG2 (figur 4C) og anerkjente embryonale /pluripotente stamceller markører Nanog, Notch1 og SOX2 (figur 4D-F), som er forbundet med tumorgenese [30] under anvendelse av sanntids-PCR i tumorene som dannes etter injeksjonen av ABCG2
hi SP-celler sammenlignet med de gjenværende cellepelletene som er høstet fra mus injisert med ABCG2
lave NSP celler. Disse
in vivo
resultatene var konsistente med de som ble oppnådd med den overordnede
in vitro
dyrkede celler (figur S6a) med høy uttrykk for stamcellemarkører vedlikeholdes i svulster som stammer fra ABCG2
hi SP celler kontrast med lav uttrykk i rest ABCG2
lav NSP. Av notatet, valg av tumor initiere celler ved dette
in vivo
analysen resulterte i anriking av disse stamcellemarkører, over baseline nivå
in vitro
, hvor forskjellene var 11 ganger, 80- fold, 44 ganger og 140 ganger for ABCG2, Nanog, Notch1 og SOX2 uttrykk, henholdsvis (p 0,05). Videre økte Nanog, Notch1 og SOX2 uttrykk av ABCG2
hi SP muse xenografter ble også observert ved immunhistokjemisk analyse (figur 4G).
Hemming av ERK Signale Demper SP Cancer Stem Cell Function
Vi undersøkte den potensielle rolle av MAPK i reguleringen av SP fenotype i NMIBC RT112 celler. Uttrykk av ERK, JNK og p38 samt PI3K /Akt og STAT signalveier ble bestemt av real time PCR (figur S7A). EGFR, ERK1 og ERK2 uttrykk av både ABCG2
hi SP og ABCG2
lave NSP celler ble dokumentert på mye høyere nivåer enn de andre signalkomponenter, noe som antyder at disse enzymene var sannsynlig å spille en betydelig rolle i MAPK signalering i RT112 celler. Enzymatisk aktivering ble senere utforsket og perk ble bekreftet å være konstitutivt uttrykt på et høyere nivå i ABCG2
hi SP celler (figur 5A). Videre forhøyet Perk uttrykk ble også sett i ABCG2
hi SP xenografter (Figur S7b). For ytterligere å teste relevansen av MAPK /ERK veien som et potensielt mål i RT112 ABCG2
hi SP, de funksjonelle effektene av U0126, en spesifikk hemmer for MEK1 og MEK2, ble vurdert. -Celler forbehandlet med U0126 for 30, 60 eller 120 minutter hadde ingen påviselig fosforylert ERK ekspresjon, noe som bekrefter at inhibering av ERK-aktivering, selv i nærvær av EGF stimulering (figur S7C). I tillegg var det ingen signifikant endring i PI-positive celler med behandling av U0126 (p = 0,38) etter farving med Hoechst 33342 (figur S7D). Vi inndelt den ABCG2
HISPs fraksjonen inn i celler lokalisert på toppen av halen og cellene plassert ved enden av halen (figur 5B), som det har blitt rapportert at cellene ved tuppen av SP-hale, som har høyeste Hoechst 33342 utstrømning kapasitet (Hoechst
lav), høyanriket stamcelle befolkningen [31]. Behandling med MEK hemmer hatt en markant hemmende effekt på celler lokalisert i halen slutten av ABCG2
HISP, redusere ABCG2
HISP med 2,5 ganger (5,8% til 2,3%). I motsetning til dette inhibitoren bare redusert ABCG2
HISPs i den ikke-bakparten av 1,5 ganger (2,8% til 1,9%). Disse data viser at U0126 er også utøve sin effekt på ABCG2
hi Hoechst
lave celler. Behandling med U0126 også forårsaket en doseavhengig hemming av CFE i RT112 ABCG2
hi SP og ABCG2
lave NSP celler (figur S7E). Som vi har vist at ABCG2
hi SP celler kan gi opphav til både SP og NSP celler (Figur S7F) og ABCG2
lave NSP celler har svært lave nivåer av Perk, undertrykkelse av ABCG2
lav NSP celle CFE ser ut til å være indirekte gjennom effektene av U0126 på ABCG2
hi SP celler. Av notatet, fortrinnsrett hemming av større kolonier, mer en indikasjon på CSC vekst, ble sett på som tilstedeværelse av koloniene ≥3mm ble hemmet helt ved 10
-6 M (figur 5C). Disse data viser at den ABCG2
hi SP fraksjon er, i det minste delvis, føres av MAPK /ERK-reaksjonsveien, som i sin tur har vi vist å opprettholde ABCG2
lave NSP-celler.
Expression av ABCG2 i klinisk blærekreft korrelerer med Grade, Stage, Regelmessighet og progresjonsfri overlevelse og perk Expression
for å bestemme den kliniske betydningen av vår
in vitro Hotell og
in vivo
cellelinje funn, undersøkte vi uttrykket for ABCG2 i deler av human blærekreft. Vevssnitt fra et panel av 148 NMIBC (Tabell S2 viser kliniske funksjoner) ble behandlet for immunoreaktivitets å ABCG2 (Figur 6A). ABCG2 positivitet ble oppdaget i 143 (97%) tilfeller, og for sammenlikning en del av normal urothelium er inkludert som demonstrerer en større intensitet av basal ABCG2 uttrykk, som er i tråd med den nye bevis for en basal stamcelle [32]. Gjennomsnittlig immunofarging intensitetspoeng for ABCG2 ble vist å være assosiert med tidlig invasiv stadium, PTA (n = 87) som funksjon av PT1 (n = 61), og øker tumor karakter, lav grad (n = 93) sammenlignet med høygradig (n 55 =) (p 0,05) (figur 6B). Median oppfølgingstid var for 59 måneder (inter-kvartil range = 48.3-96.3 måneder), og 31 tilfeller (21%) viste tilbakefall av sykdommen og 23 tilfeller (16%) viste sykdomsprogresjon. Sammenhenger med tid til tilbakefall og progresjonsfri overlevelse (PFS) viste dårligere utfall assosiert med økende ABCG2 uttrykk som vist med Kaplan-Meier-kurver og log-rank-analyser (p 0,001) (figur 6C). Disse korrelasjonene fortsatt statistisk signifikante når stratifisert for klasse, scene og tilstedeværelse av CIS (p 0,001). Ved hjelp av Cox multivariat analyse, som inkluderte variablene i klasse, scene og intensiteten av ABCG2 farging, avslørte at ABCG2 uttrykk forble en selvstendig prediktor for sykdomsprogresjon (p 0,001; RR = 5,1; 95% CI = 02.06 til 09.09). I tillegg øker Perk uttrykk var også assosiert med dårligere utfall (Log-rank p = 0,001) (Figur 6D). Videre ble en positiv korrelasjon demonstrerte mellom ABCG2 og perk uttrykk (p = 0,005, Pearsons r = 0,99) (figur 6E).
Diskusjoner
Nylige fremskritt innen isolering og karakterisering av antatte cscs har gitt innsikt i begge basert på karsinogenese og ført til økende optimisme for å utvikle en mer effektiv målrettet kreftterapi. Studier har presentert data som viser overbevisende at en rekke humane kreftformer følge CSC-modellen, hvorved en liten subpopulasjon av celler i en tumor er i stand til startfasen og ansvarlig for tumorvekst og tilbakefall [8], [9]. Eksistensen av celler med økt tumor initiering potensial er nylig blitt beskrevet i human blærekreft [33] – [35] og SP er vist i blærecancerpasientprøvene [19]. I denne studien karakteriseres vi blære cscs bruker SP og utforsket sin modulasjon av MAPK /ERK signalveien.
På jakt etter en CSC hierarki i human blærekreft, våre
in vitro
studier viste ABCG2
hi SP celler viste en tredobling i kolonidannende effektivitet. Disse dataene ble videre støttet av våre
in vivo
studier der ABCG2
hi SP celler var svulst initiere i forhold til ABCG2
lave NSP celler som viste tap av tumorvekst på 1 x 10
3 cellers fortynning. Disse observasjonene markere berikelse av cscs innenfor ABCG2
hi SP valg. Påfølgende serie transplantasjoner vil ytterligere støtte en hierarkisk CSC forhold i disse svulstene. Men vi har tatt en tilsvarende tilnærming ved å utføre serie valg og
in vitro
kulturer av ABCG2
hi SP og ABCG2
lave NSP kulturer demonstrert evne ABCG2
hi SP celler til repopulate den opprinnelige fenotypiske spekteret av moder RT112 cellelinje. Serie valg av ABCG2
lave NSP celler viste svekkelse i potensial til å regenerere begge populasjoner indikerer fortynning av muligheten til å velge eller generere cscs.
ABCG2 har vist seg å være den viktigste molekylære determinant av SP fenotype [26]. Ja, vi fant SP av NMIBC RT112 og RT4 cellene hadde høyere ABCG2 mRNA uttrykk, ble fullstendig opphevet ved ABCG2-spesifikk hemmer FTC og inneholdt topp 5% av ABCG2
hi uttrykker celler. Korrelasjon til kliniske NMIBC utfall avslørt ABCG2
hi farging å bli assosiert med dårligere kliniske utfall av kreft tilbakefall og progresjon, noe som indikerer en rolle for cscs i blærekreft utvikling. Interessant, SP av MIBC J82 cellelinje som hadde høyere P-glykoprotein-ekspresjon og ble inhibert av verapamil, et P-glykoprotein-spesifikk inhibitor. P-glykoprotein mRNA nivåer har blitt funnet å være forhøyet i blæren svulster høy klasse [36]. I tillegg er den molekylære patologi NMIBC forskjellig fra MIBC [20].
