Abstract
D, L-Sulforaphane (SFN), en syntetisk racemisk analog av brokkoli bestanddel L- sulforaphane, er en svært lovende kreft chemopreventive agent med
in vivo
effekt mot kjemisk indusert samt onkogen-drevet kreft i prekliniske gnagermodeller. Kreft chemopreventive virkning av SFN er karakterisert ved G
2 /M-fase cellesyklus-stans, apoptose-induksjon, og hemming av cellemigrering og invasjon. Videre hemmer SFN flere onkogene signalveier ofte hyperaktive i humane kreftformer, inkludert kjernefysiske faktor-kB, Akt, signal svinger og aktivator av transkripsjon 3, og androgen reseptor. Foreliggende studie ble designet for å bestemme hvilken rolle Notch signalering, som er konstitutivt aktiv i mange humane kreftformer, i kreft effekter av SFN ved hjelp av prostata kreftceller som en modell. Eksponering av humane prostatacancerceller (PC-3, LNCaP og /eller LNCaP-C4-2B) til SFN så vel som dens naturlig forekommende tio-, sulfinyl- og sulfonyl-analoger resulterte i spaltning (aktivering) av Notch1, Notch2, og Notch4, som ble fulgt av en nedgang i nivåene av full-lengde Notch former spesielt på 16- og 24-timers tidspunkter. Den SFN-mediert spalting av Notch isoformer ble assosiert med sin transcriptional aktivering som gjenspeiles av RBP-Jk-, HMS-1A /B- og HEY-1 luciferase reporter analyser. Migrasjon av PC-3 og LNCaP celler ble redusert betraktelig ved RNA interferens fra Notch1 og Notch2, men ikke Notch4. Videre SFN-mediert hemming av PC-3 og LNCaP cellevandring var bare marginalt påvirket av knockdown av Notch1 og Notch2. Påfallende, SFN administrasjon til Transgene Adenokarsinom av Mouse Prostate transgene mus klarte å øke nivåene av kløyvde Notch1, kløyvde Notch2, og HMS-1-proteiner
in vivo
i prostata intraepitelial neoplasi, godt differensiert karsinom eller dårlig differensiert prostata kreft lesjoner. Disse resultatene indikerer at Notch aktivering er i stor grad unnværlig for SFN-mediert hemming av cellemigrasjon, som bør sees på som en terapeutisk fordel som Notch aktivisering er hyppig i humane prostatakreft
Citation. Hahm ER, Chandra-Kuntal K, Desai D, Amin S, Singh SV (2012) Notch Aktivering Er unnværlig for D, L-Sulforaphane hemming av menneskelig Prostate Cancer Cell migrasjon. PLoS ONE 7 (9): e44957. doi: 10,1371 /journal.pone.0044957
Redaktør: Xiaolin Zi, University of California Irvine, USA
mottatt: 22 juni 2012; Akseptert: 10. august 2012; Publisert: 07.09.2012
Copyright: © Hahm et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne undersøkelsen ble støttet av National Cancer Institute stipend CA115498-07. Denne forskningen brukt en vev og forskning patologi anlegget støttet av et stipend fra National Cancer Institute (P30 CA047904). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
D, L-Sulforaphane (SFN), en syntetisk analog av racemisk brokkoli-avledet L-isomer (L-SFN), er et meget lovende cancer Kjemopreventivt middel med bemerkelsesverdig aktivitet i prekliniske dyremodeller [1], [2]. Talalay og medarbeidere var de første til å observere forebygging av 9,10-dimetyl-1,2-benzanthracene-indusert mammary kreft hos rotter ved denne forbindelsen [3]. Kreft chemopreventive effekt av SFN eller L-SFN ble senere utvidet til andre kjemiske karsinogenisitetsstudier modeller. For eksempel ble SFN administrasjonen vist seg å undertrykke azoxymethane-indusert colonic avvikende krypten foci i rotter [4]. Likeledes, SFN behandlingen resulterte i forebyggelse av benzo [a] pyren-indusert forestomach kreft og inhibering av ondartet progresjon av lungeadenomer indusert av tobakk karsinogen 4- (methylnitrosamino) -1- (3-pyridyl) -1-butanon i mus [5 ], [6]. Nyere studier har benyttet transgene musemodeller for å etablere Kjemopreventivt effekt av SFN mot onkogen-drevne kreftformer. For eksempel, kost administrering av 300 og 600 ppm SFN i 3 uker til ApcMin /+ mus resulterte i undertrykkelse av polypper i tynntarmen på en doseavhengig måte [7]. Tidligere studier fra vårt laboratorium har vist at oralt inntak av seks mikromol SFN (tre ganger per uke) begynner på 6-7 ukers alder betydelig hemmet forekomst og byrden av prostata intraepitelial neoplasi (PIN) og /eller godt differensiert prostatakreft (WD ) så vel som lungemetastase multiplisitet i transgene mus Adenokarsinom av prostata (TRAMP) mus uten å forårsake noen bivirkninger [8]. I samsvar med disse dataene [8], 8-ukers gammel tramp mus fôret med 240 mg av brokkoli spirer /mus /dag viste en betydelig nedgang i prostata tumorvekst i en annen studie [9]. Videre vekst av PC-3 human prostatacancerceller xenopodet i hann atymiske mus var signifikant forsinket ved oral behandling med SFN [10]
På grunn av lovende resultater i prekliniske gnagermodeller [3] -. [8], [10] belysning av mekanismen underliggende kreft chemopreventive svar på SFN har vært tema for intens forskning i løpet av det siste tiåret. Mekanismer som bidrar til kreft kjemoprevensjon av SFN omfatter: inhibering av CYP2E1 [11], cellesyklus-stans [12], [13], apoptoseinduksjon [12], [14], undertrykkelse av angiogenese [15], hemning av histon-deacetylase [16 ], proteinbinding [17], induksjon av fase 2-enzymer [18], epigenetisk undertrykkelse av
hTERT product: [19], og hemming av selvfornyelse av brystkreft stamceller [20]. Mekanistiske studier med kultiverte kreftcellene har også avdekket SFN-mediert hemming av ulike onkogene veier ofte hyperaktive i humane kreftformer, inkludert kjernefysiske faktor-kB, androgen reseptor, BCL-2, BCL-XL, og signal svinger og aktivator av transkripsjon 3 [14 ], [21] – [23]. Aktivering av signal svinger og aktivator av transkripsjon 3 overfører beskjeden beskyttelse mot SFN-indusert apoptose, mitokondrier-avledet reaktive oksygenforbindelser (ROS) gir startsignal for apoptose engasjement i kreftceller eksponert for denne agenten [14], [24].
Notch signalering har vært innblandet i prostata kreftutvikling og metastasering [25] – [28]. For eksempel, en studie med tumorprøver fra 154 menn viste overekspresjon av Jagged-en, en Notch ligand, i metastatisk prostatakreft sammenlignet med lokalisert kreft og benign prostata sykdom [26]. Likeledes Bin Hafeez et al. [27] fant økt uttrykk for Notch1 i prostatakreft. Videre knockdown av
Notch1
hemmet invasjon av humane prostatacancerceller i assosiasjon med inhibering av matriks-metalloproteinase-9 (MMP-9) og urokinase-plasminogen-aktivator [27]. Nedregulering av Notch1 og dens ligand taggete-1 har blitt vist å hemme proliferasjon av prostata kreftceller [28]. Denne studien benyttet dyrkede humane prostatakreftceller (PC-3, LNCaP og LNCaP-C4-2B), og dorsolateral prostata vev fra kontroll og SFN-behandlede tramp mus [8] for å avgjøre hvilken rolle Notch1, Notch2, og Notch4 i kreft effekter av SFN.
Resultater
SFN Behandling økte nivåer av Spaltet Notch1, kløyvde Notch2, og spaltet Notch4 i dyrkede humane prostata kreft celler
Notch aktivering involverer binding av reseptoren til tilstøtende ligander etterfulgt av en konformasjonell forandring i reseptoren og Notch spalting formidles av den γ-sekretase-komplekset på et sted som ligger innenfor den Notch transmembrandomenet [29]. Den netto resultatet av disse reaksjonene er frigjøring av Notch intracellulære domenet inn i cytoplasma, noe som deretter translocates til kjernen for å regulere target genekspresjon [25], [29]. Vi brukte PC-3 (en androgen-uavhengig prostatacancer human cellelinje som mangler funksjonell p53), LNCaP (en androgen-responsive human prostatacancer cellelinje med vill-type p53), og LNCaP-C4-2B (en androgen-uavhengig variant av LNCaP-cellelinje) for å studere rollen til Notch signalisering i kreft effekt av SFN. Nivåer av spaltet Notch1, spaltes Notch2, og spaltes Notch4 proteiner ble økt markert ved behandling med SFN i PC-3 (fig. 1A), LNCaP (Fig. 1B), og LNCaP-C4-2B-celler (fig. 1C), enskjønt med ulike kinetikk. For eksempel, i motsetning til LNCaP-celler (Fig. 1B), spalting av Notch1 ved behandling med SFN var forbigående (økt spaltning sees bare på 8 time- tidspunkt) i PC-3-celler (Fig. 1A). Molekylære basis for cellelinjespesifikke forskjeller i Notch aktivering av SFN er ikke klar, men Notch aktivering ved SFN var ledsaget av en reduksjon i nivåene av full-lengde Notch1, Notch2, og Notch4 i hver cellelinje, spesielt ved 16- og 24-timers tidspunkter (fig. 1A-C). Spesielt, Notch2 var generelt mer følsomme for spaltning ved SFN sammenlignet med Notch1 eller Notch4 (Fig. 1 A-C). Sammen er disse resultatene indikerte at SFN behandlingen resulterte i spaltning av Notch1, Notch2, og Notch4 i begge androgen-uavhengig og androgen-responsive humane prostatakreftceller.
Immunoblotting for spaltede og full-lengde Notch1, Notch2, og Notch4 ved hjelp av lysater fra (A), PC-3, (B) LNCaP, og (C) LNCaP-celler etter C4-2B 8-, 16- eller 24-timers behandling med DMSO eller SFN (10 eller 20 uM). Blotter ble strippet og re-undersøkt med anti-aktin antistoff som en lasting kontroll. Immunoblotting for hvert protein ble utført minst to ganger ved hjelp av uavhengig av hverandre fremstilles lysater. Tall over bandet representerer endringer i proteinnivåer i forhold til tilsvarende DMSO-behandlet kontroll.
Effekter av naturlig forekommende analoger av SFN på Notch Activation i PC-3 og LNCaP celler
anvendes naturlig forekommende tio-, sulfinyl- og sulfonyl-analoger av SFN med forskjellig alkylkjedelengde (fig. 2A) for å bestemme om aktivering av hakk var unik for SFN. Åtte timers eksponering av PC-3 (Fig. 2B) og LNCaP celler (Fig. 2C) til tio (Iberverin, Erucin, og Berteroin) og sulfinylhalogenider-analoger (Iberin og Alyssin) resulterte i spalting av Notch1 og Notch2 (Fig . 2B, C). Videre er tio og sulfinyl–analoger var forholdsvis mer potente i å forårsake spalting av Notch1 og Notch2 i sammenligning med sulfonyl-analoger (Cheirolin, Erysolin, og Alyssin sulfon) i både PC-3 (Fig. 2B) og LNCaP-celler (Fig . 2C). Overraskende, ble nivåene av spaltede Notch4 redusert i varierende grad ved behandling med tio- og sulfinyl–analogene, men ikke sulfonyl-analoger i begge cellelinjer. Sammen er disse resultater indikerte at de naturlig forekommende tio- og sulfinyl–analoger av SFN var effektive til å forårsake spaltning av Notch1 og Notch2. På den annen side synes Notch4 aktivering unik for SFN.
(A) Kjemiske navn, vanlige navn, og kjemiske formler av analogene som brukes i den foreliggende undersøkelse. Immunoblotting for spaltet Notch1, Notch2, og Notch4 ved hjelp av lysater fra (B) PC-3, og (C) LNCaP-celler etter 8 timers behandling med DMSO eller forskjellige analoger (10 eller 20 uM). Blotter ble strippet og re-undersøkt med anti-aktin antistoff som en lasting kontroll. Immunoblotting for hvert protein ble utført minst to ganger ved hjelp av uavhengig av hverandre fremstilles lysater. Tall over bandet representerer endringer i proteinnivåer i forhold til DMSO-behandlet kontroll.
Effekt av SFN Behandling på transkripsjonen aktivitet av Notch
Vi fortsatte å teste om SFN-mediert spalting av Notch1 , Notch2, og Notch4 ble ledsaget av transcriptional aktivering av Notch hjelp luciferaserapportørplasmid analyser. Den RBP-Jk [C proteinbinding faktor 1 /lyddemper av naken /Lag1 (CBF1 /Su (H) /Lag en)] er en direkte nedstrøms modulator av Notch signalering [25], [29]. Eksponering av PC-3 og LNCaP-celler til 20 uM SFN til 8 og /eller 24 timer førte til en statistisk signifikant økning i RBP-Jk luciferase reporter-aktivitet (Fig. 3A). I samsvar med disse resultatene, ble nivåene av atom HES-1, en nedstrøms mål for Notch, økt ved 24-timers behandling av PC-3 og LNCaP-celler med SFN sammenlignet med dimetylsulfoksyd (DMSO) -behandlet kontrollceller (Fig. 3B ). Luciferase aktivitet forbundet med Notch målgener
HMS-1A /B Hotell og
HEY-en product: (Fig. 3 C, D) ble også økt betydelig etter behandling med 20 mikrometer SFN i prostatakreftceller . Sammen utgjør disse observasjoner indikerte at SFN behandling forårsaket transkripsjonen aktivering av hakk i dyrkede prostatakreftceller.
(A) Virkning av behandling på SFN RBP-Jk luciferase reporter-aktivitet (et mål på transkripsjonen aktivitet av Notch) på PCen -3 og LNCaP celler etter 8- eller 24-timers behandling med DMSO eller 20 mikrometer SFN. (B) immunfluorescens mikroskopiske bilder som viser kjernefysiske nivåer av HMS-1 protein i PC-3 og LNCaP celler etter 24 timers behandling med DMSO eller 10 mm SFN (× 100 mål forstørrelse). (C) HMS-1A /B luciferase reporter aktivitet i PC-3 og LNCaP celler etter 8- eller 24-timers behandling med DMSO eller 20 mikrometer SFN. (D) HEY-1 (PC-3 celler) eller HMS-1A /B (LNCaP-C4-2B celler) luciferaserapportørplasmid aktivitet etter 8- eller 24-timers behandling med DMSO eller 20 mikrometer SFN. I panelene A, C og D, viste resultater er gjennomsnitt ± SD (n = 6; kombinerte data fra to uavhengige eksperimenter hver utført i triplikat). * Signifikant forskjellig (
P
0,05) sammenlignet med tilsvarende DMSO-behandlet kontroll av Student
t
-test (paneler A, C og D). Hvert eksperiment ble utført to ganger.
Effekt av RNA interferens fra Notch1 på SFN-mediert hemming av PC-3 og LNCaP Cell Migration
nedregulering av Notch1 ble vist å hemme prostata kreftcelle migrering og invasjon [28]. Vi laget derfor eksperimenter ved hjelp av PC-3 og LNCaP celler for å bestemme konsekvensene av Notch1 aktivering på SFN-mediert hemming av cellemigrasjon. PC-3 og LNCaP-celler transient transfektert med en Notch1 målrettet siRNA oppviste 80% eller større reduksjon i nivåene av full-lengde Notch1 når sammenlignet med celler transfektert med en styre siRNA (Fig. 4A). RNA-interferens fra Notch1 alene resulterte i en signifikant reduksjon i PC-3 og LNCaP cellevandring (Fig. 4B, C). Men SFN-mediert hemming av PC-3 og LNCaP cellevandring var bare marginalt påvirket av knockdown av Notch1 (fig. 4C). Basert på disse resultatene, konkluderer vi med at Notch1 aktivering er i stor grad unnværlig for SFN-mediert hemming av prostata kreft celle migrasjon.
(A) Immunoblotting for full-lengde Notch1 protein ved hjelp lysates fra PC-3 og LNCaP celler forbigående transfektert med en kontroll (uspesifikke) siRNA eller en Notch1 målrettet siRNA. (B) Representative bilder (Boyden kammer assay) som viser migrering av PC-3 og LNCaP-celler transfektert med en kontroll (ikke-spesifikk) siRNA eller en Notch1 målrettet siRNA og behandlet i 24 timer med DMSO eller 10 uM SFN (x 100 forstørrelse). (C) Kvantifisering av PC-3 og LNCaP cellemigrering fra dataene som er vist i panel B. To til tre felt på hvert filter ble skåret for cellemigrering under en invertert mikroskop. Data representerer prosent cellevandring normalisert for å styre siRNA-transfekterte celler behandlet med DMSO (gjennomsnitt ± SD, n = 6; kombinerte data fra to uavhengige eksperimenter hver utført i tre eksemplarer). Signifikant forskjellig (
P
0,05)
acompared med respektive DMSO-behandlede kontroller (celler transfektert med kontroll siRNA eller Notch1 målrettet siRNA), og
bbetween kontroll siRNA transfekterte celler og Notch1 målrettet siRNA-transfekterte celler ved hjelp av en enveis ANOVA etterfulgt av Bonferroni multiple sammenligningstest. Hvert eksperiment ble utført to ganger.
Effekt av Notch2 Protein knockdown på SFN-mediert hemming av PC-3 og LNCaP Cell Migration
Vi har vist tidligere at stanse av full-lengde Notch2 protein reduserer signifikant migrering evne til både PC-3 og LNCaP-celler [30]. Vi gikk videre til å teste hvorvidt Notch2 aktivering ved SFN påvirket dets evne til å inhibere PC-3 og LNCaP cellemigrering. Nivå av full-lengde Notch2 protein ble redusert med henholdsvis 90% og 60%,, ved forbigående transfeksjon av PC-3 og LNCaP celler med en Notch2 målrettet siRNA sammenlignet med tilsvarende celler transfektert med kontroll siRNA (Fig . 5A). I samsvar med våre tidligere observasjoner [30], knockdown av Notch2 protein alene redusert PC-3 og LNCaP celle migrasjon (Fig. 5B, C). Den SFN-mediert hemming av PC-3 og LNCaP cellemigrasjon ble beskjedent forsterket av RNA interferens fra Notch2 (Fig. 5C). For eksempel ble PC-3-celle migrasjon hemmet med 43% og 18% (tilsvarer 59% inhibering), henholdsvis, etter 24 timers behandling av kontroll siRNA transfekterte celler med 10 pM SFN og RNA-interferens av Notch2 alene. Migrasjon av PC-3 cellers ble hemmet med 67% ved behandling med SFN i Notch2 forstummet celler. Disse resultatene antydet at Notch2 aktivering av SFN formidles marginal motstand mot sin hemmende effekt på cellevandring.
(A) Immunoblotting for full-lengde Notch2 protein ved hjelp lysates fra PC-3 og LNCaP celler transient transfektert med en kontroll ( uspesifikke) siRNA eller en Notch2 målrettet siRNA. (B) Representative bilder (Boyden kammer assay) som viser migrering av PC-3 og LNCaP-celler transfektert med en kontroll (ikke-spesifikk) siRNA eller en Notch2 målrettet siRNA og behandlet i 24 timer med DMSO eller 10 uM SFN (x 100 forstørrelse). (C) Kvantifisering av PC-3 og LNCaP cellemigrering fra dataene som er vist i panel B. To til tre felt på hvert filter ble skåret for cellemigrering under en invertert mikroskop. Data representerer prosent cellevandring normalisert for å styre siRNA transfekterte celler behandlet med DMSO (gjennomsnitt ± SD, n = 6; kombinerte data fra to uavhengige eksperimenter hver utført i tre eksemplarer). (D) Analyse av histon-assosierte DNA-fragment slipper inn i cytosol i PC-3 og LNCaP-celler transfektert med en kontroll (ikke-spesifikk) siRNA eller en Notch2 målrettet siRNA og behandlet i 24 timer med DMSO eller SFN. Data representerer anrikning av histon-assosierte DNA-fragment slipper inn i cytosol i forhold til kontroll siRNA transfekterte celler behandlet med DMSO (gjennomsnitt ± SD, n = 6; kombinerte data fra to uavhengige eksperimenter hver utført i tre eksemplarer). I panelene C og D, signifikant forskjellig (
P
0,05)
acompared med respektive DMSO-behandlede kontroller (celler transfektert med kontroll siRNA eller Notch2 målrettet siRNA), og
bbetween kontroll siRNA transfekterte celler og Notch2 målrettede siRNA transfekterte celler ved enveis ANOVA etterfulgt av Bonferroni multippel sammenligningstest. Hvert eksperiment ble utført to ganger.
O’Neill et al [31] har vist at tidligere Notch2 regulerer apoptose i det minste i MDA-MB-231 humane brystcancerceller. Derfor var det bare logisk å avgjøre om Notch2 aktivering påvirket SFN-indusert apoptose. Som vist på fig. 5D, knockdown av Notch2 protein alene ikke har noen meningsfull innvirkning på histon-assosierte DNA-fragment slipper inn i cytosol, noe som er et godt akseptert metode for kvantifisering av apoptose. Den SFN-mediert histon-assosierte DNA-fragment slipper inn i cytosol ble noe opphevet ved RNA-interferens av Notch2 i LNCaP-celler, men denne forskjellen var ikke statistisk signifikans i PC-3-cellelinjen (fig. 5D). På grunn av marginale effekter og cellelinje spesifikke forskjeller, konkluderer vi med at Notch2 aktivering har minimal innvirkning på evnen til SFN å indusere apoptose i hvert fall i prostata kreft celler.
Notch4 aktiveringen var unnværlig for SFN-mediert hemming av PC -3 Cell Migration
Neste, vi gikk videre for å finne ut hvilken rolle Notch4 aktivering i SFN-mediert hemming av celle migrasjon ved hjelp av PC-3 celler. Nivå av full-lengde Notch4 protein ble redusert med 70% ved transient transfeksjon av PC-3-celler med en Notch4-målrettet siRNA sammenlignet med celler transfektert med kontroll siRNA (Fig. 6A). I motsetning til Notch1 (fig. 4C), eller Notch2 (fig. 5C), RNA interferens av Notch4 alene hadde minimal effekt på PC-3-celle migrasjon (fig. 6B, C). Videre hemming av PC-tre cellemigrasjon som følge av SFN eksponering ble ikke påvirket av RNA interferens fra Notch4 (Fig. 6C). Dermed aktivering av Notch4 var også unnværlig for SFN-mediert hemming av PC-tre cellemigrasjon i hvert fall i PC-3 celler. Lignende studier med Notch4 siRNA ble ikke utført i LNCaP celler.
(SFN) -mediert hemming av PC-tre celle migrasjon. (A) Immunoblotting for full-lengde Notch4 protein ved hjelp lysates fra PC-3 celler transient transfektert med en kontroll (uspesifikke) siRNA eller en Notch4 målrettet siRNA. (B) Representative bilder (Boyden kammer assay) som viser migrering av PC-3-celler transfektert med en kontroll (ikke-spesifikk) siRNA eller en Notch4 målrettet siRNA og behandlet i 24 timer med DMSO eller 10 uM SFN (x 100 objektiv forstørrelse). (C) Kvantifisering av PC-tre cellemigrasjon fra data som er vist i panel B. To til tre felt på hvert filter ble scoret for celle migrasjon under en invertert mikroskop. Data representerer prosent cellevandring normalisert for å styre siRNA-transfekterte celler behandlet med DMSO (gjennomsnitt ± SD, n = 6; kombinerte data fra to uavhengige eksperimenter hver utført i tre eksemplarer).
aSignificantly forskjellig (
P
0,05) sammenlignet med de respektive DMSO-behandlede kontroller (celler transfektert med kontroll siRNA eller Notch4 målrettet siRNA) ved en-veis ANOVA, etterfulgt av Bonferroni multiple sammenligningstest. Hvert eksperiment ble utført to ganger.
Imzmunohistochemical Analyse for Spaltet Notch1, kløyvde Notch2, og HMS-en Proteiner i dorsolateral Prostata vevssnitt fra Kontroll og SFN behandlet tramp Mus
Vi brukte arkiverte parafininnstøpte prostata vev fra vår tidligere gjennomført TRAMP studie [8] for å bestemme
in vivo
effekten av SFN administrasjon på nivåer av kløyvde Notch1, kløyvde Notch2, og HMS-1 proteiner. Representative bilder for kløyvet Notch1, spaltes Notch2 og HMS-1 protein uttrykk i PIN, WD og dårlig differensiert prostatakreft (PD) av kontroll og SFN-behandlede tramp mus er vist i fig. 7A. Overraskende, SFN administrasjon unnlot å øke nivåene av disse proteiner i PIN, WD, og PD. Men en beskjeden, men signifikant reduksjon i samlede nivået på spaltet Notch2 (kombinert uttrykk i PIN, WD, og PD) var merkbar i dorsolateral prostata av SFN-behandlede tramp mus sammenlignet med kontroll tramp mus.
(A) Representative immunhistokjemiske bilder som viser uttrykk for spaltet Notch1, kløyvde Notch2, og HMS-1-proteiner i prostata intraepitelial neoplasi (PIN), godt differensiert prostatakreft (WD), og dårlig differensiert prostatakreft (PD) i dorsolateral prostata fra Tramp mus av de angitte grupper (× 200 objektivforstørrelsen). (B) Kvantifisering av uttrykk (kombinert analyse i PIN, WD, og PD) er vist som H-score (gjennomsnitt ± SD, n = 5). Statistisk signifikans ble bestemt av Student
t
-test.
Diskusjoner
Notch signalering er ganske komplisert involverer samspill mellom fire reseptor (Notch1, Notch2, Notch3, og Notch4) og fem ligander [Jagged1, Jagged2, Delta-lignende og ligander (Dll1, Dll3, og Dll4)] [25], [29]. Hakk signalering er involvert i celle skjebne bestemmelse i embryonale og voksent vev [32], [33] og normal prostatisk utvikling, samt i patogenesen av prostatakreft [25]. Overekspresjon av Jagged-en ble vist i metastatisk prostatakreft sammenlignet med lokalisert kreft og benign prostata sykdom [26]. Dessuten ble Notch1 knockdown vist å hemme MMP-9 og invasjon av PC-3-celler [27]. Nedregulering av Jagged1 har vist seg å hemme proliferasjon av prostata kreftceller [28]. RNA-interferens fra Notch1 inhiberer prostatacancer cellemigrering og invasjon [28]. Denne studien viser at SFN behandling aktiverer Notch signalering i menneskelig prostata kreft cellelinjer uavhengig av androgen-respons. Den SFN-mediert aktivering av Notch1, Notch2, og Notch4 er preget av deres cleavage og økt transkripsjonen aktivitet. Aktivering av Notch1 og Notch2, men ikke Notch4, er ikke unik for SFN som noen av de naturlig forekommende analoger er effektive i å forårsake spalting av både Notch1 og Notch2 i PC-3 og LNCaP-celler. I samsvar med litteraturdata [28,] vi også funnet at knockdown av Notch1 og Notch2 reduserer migrasjon av prostata kreft celler uavhengig av androgen-respons. Overraskende, Notch aktivering ved SFN har minimal innvirkning på dets evne til å hemme prostatacancer cellemigrering. Spesielt knockdown av Notch1, Notch2 eller Notch4 har ingen innvirkning i det hele tatt eller bare marginal effekt på SFN-mediert hemming av prostata kreft celle migrasjon. Disse observasjonene tyder på at Notch aktivering er unnværlig for SFN-mediert hemming av prostata kreft celle migrasjon.
Evidence fortsetter å akkumulere for å indikere at strukturelle forskjeller i naturlig forekommende isothiocyanates (ITC) kan dypt påvirke deres aktivitet. For eksempel, autophagy induksjon ved SFN tjener til å beskytte mot apoptose [34]. Det motsatte, autophagy bidrar til celledød induksjon av fenetyl-isotiocyanat (PEITC) [35], som er et naturlig forekommende bestanddel av vannkarse med strukturell likhet med SFN (dvs. tilstedeværelse av ITC funksjonell gruppe). Denne studien gir enda et eksempel for å illustrere mekanistiske forskjeller i strukturelt relaterte ITC forbindelser (f.eks SFN og PEITC). Vi har tidligere vist at, i motsetning SFN (liggende studie) Notch aktivering av PEITC hindrer dets hemmende effekt på prostatakreft cellevandring [30]. Disse observasjonene understreker forsiktighet i ekstrapolering av mekanistiske resultater mellom strukturelt-forskjellige ITC forbindelser.
Aktivering av Notch2 ved overekspresjon av sin intracellulære domenet har vist seg å fremme apoptose i MDA-MB-231 humane brystkreftceller [31] . Fordi apoptoseinduksjon anses som en viktig mekanisme i kreft chemoprevention av SFN [12], [14], var det av interesse å finne ut hvilke konsekvenser Notch2 aktivisering på proapoptotiske respons på SFN. I motsetning til MDA-MB-231 celler, knockdown av Notch2 har ingen innvirkning på apoptose i enten PC-3 eller LNCaP celler. Videre SFN-indusert apoptose ble minimalt påvirket av knockdown av Notch2 i PC-3 og LNCaP celler. Dermed proapoptotiske rolle Notch2 kan være et fenomen unikt for MDA-MB-231 celler.
Vi har vist tidligere at SFN administrasjon hemmer forekomsten og belastning (berørte området) for PIN- og WD, men ikke PD, som samt lungemetastaser mangfold i Tramp mus [8]. Interessant, ikke er i stand til å øke nivåene av kløyvde Notch1, kløyvde Notch2 eller HMS-en SFN administrasjon
in vivo
i dorsolateral prostata av Tramp mus (studien). På den ene side er disse resultatene tyder på at forebygging av prostatacancer ved å SFN i TRAMP mus ikke er relatert til Notch signalering. Samtidig, på muligheten for at en mer intens doseringsregime av SFN (for eksempel høyere konsentrasjoner og daglig administrasjon) kan være nødvendig for å lokke fram Notch aktivering
in vivo
kan ikke kastes. Observert avvik mellom
in vitro Hotell og
in vivo
systemer om effekten av SFN på hakk aktivisering kan også være relatert til svulstens mikromiljø. Imidlertid er det videre arbeidet for å utforske disse mulighetene.
I konklusjonen, resultatene av den nåværende ikke bare avsløre
in vitro Hotell og
in vivo
forskjeller i effekt av SFN på Notch aktivisering men også indikere at aktivering av Notch1, Notch2, og Notch4 er i stor grad unnværlig for cellulære responser til SFN (f.eks hemming av cellevandring eller apoptose) minst i menneskelige prostata kreft celler.
Metoder
Etikk erklæringen
Vi brukte arkiverte vevssnitt fra vår tidligere utgitt
in vivo
studie [8] for å bestemme effekten av SFN administrasjon på uttrykk for spaltet Notch1, kløyvde Notch2, og HMS-1 proteiner. Bruk av mus og deres omsorg ble godkjent av og i samsvar med University of Pittsburgh Institutional Animal Care og bruk komité retningslinjer.
Reagenser og cellelinjer
SFN ble syntetisert som beskrevet av Conaway et al. [6], mens dets naturlig forekommende analoger ble innkjøpt fra LKT Laboratories (St. Paul, MN). Stamløsninger av SFN og dets analoger ble fremstilt i DMSO, lagret ved -20 ° C, og fortynnet med friskt medium umiddelbart før bruk. Det samme volum av DMSO (sluttkonsentrasjon 0,1%) ble tilsatt til kontrollprøvene. Cellekultur reagenser slik som føtalt bovint serum, antibiotika blandinger, fosfat-bufret saltvann (PBS), og trypsin ble anskaffet fra Invitrogen Life Technologies-(Carlsbad, CA). Antistoffer mot spaltede Notch1, og full-lengde Notch2 var fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA); et antistoff som er spesifikt for påvisning av spaltet Notch2 var fra EMD-Millipore (Billerica, MA); antistoffer mot full-lengde Notch1, Notch4 (dette antistoffet detekterer både full lengde og spaltede former), og HMS-en var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA); og anti-actin-antistoff var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Små forstyrrende RNA rettet mot Notch1, Notch2, og Notch4 ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology. En uspesifikk kontroll siRNA ble kjøpt fra Qiagen (Germantown, MD). PC-3 og LNCaP human prostatacancercellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og dyrket som beskrevet tidligere [14], [24]. LNCaP-C4-2B cellelinje ble kjøpt fra UroCor og vedlikeholdes som foreslått av leverandøren.
Immunoblotting
Hele cellelysater ble fremstilt som beskrevet [36] og utsatt for natrium dodecyl-sulfat polyakrylamid gelelektroforese [36], [37]. Den våte-overført Membranen ble inkubert med passende primære og sekundære antistoffer, og de immunoreaktive bånd ble påvist ved anvendelse av forsterket kjemiluminescens-metoden. Multiplexing eller stripping /re-sondering ble utført for noen proteiner i noen eksperimenter.
luciferaserapportørplasmid analysen
transkripsjonen aktivitet av Notch ble bestemt ved hjelp av en Cignal RBP-Jk luciferase reporter kit (SABiosciences- Qiagen) etter leverandørens anbefalinger. For bestemmelse av HMS-1A /B og HEY-en luciferase aktivitet, brukte vi pGL2–1A HES /B og pGL2-HEY-1 plasmider sjenerøst gitt oss av Dr. Kimberly E. Foreman (Avdeling for patologi, Loyola University Medical Center, Maywood, IL). De transient ko-transfekterte celler med ildflue luciferase plasmid og Renilla luciferase ved hjelp FuGENE6 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) ble behandlet med DMSO (kontroll) eller SFN for 8 eller 24 timer.
