Abstract
Von Hippel-Lindau tumor suppressor (VHL) er tapt i de fleste klare celle nyrecellekarsinomer (ccRCC). Folliculin (FLCN) er en tumor suppressor hvis funksjon er tapt i Birt-Hogg-Dubé syndrom (BHD), en lidelse preget av nedsatt kreft av flere histologiske typer inkludert klarcellet karsinom, kutan fibrofolliculoma, og pneumothorax. Her utforsket vi om det er sammenheng mellom VHL og FLCN i klart cellenyrekreft cellelinjer og svulster. Vi viser at VHL regulerer ekspresjon av FLCN på mRNA og proteinnivåene i RCC-cellelinjer, og at FLCN proteinekspresjon er redusert i humane tumorer med ccRCC
VHL
tap, sammenlignet med matchet normalt nyrevev. Knockdown av FLCN resulterer i øket dannelse av tumorer ved RCC-celler med vill-type VHL i ortotopiske xenotransplantater i nakne mus, en indikasjon på at FLCN spiller en rolle i den tumor-undertrykkende aktivitet av VHL. Interessant, FLCN, på samme måte som VHL, er nødvendig for aktiviteten av LC3C-mediert autophagic program som vi tidligere har kjennetegnet som å bidra til tumoren undertrykkende aktivitet av VHL. Resultatene viser at det finnes funksjonelle crosstalk mellom to store kreftdempere i nyrekreft, VHL og FLCN, konvergerende på regulering av autofagi
Citation. Bastola P, Stratton Y, Kellner E, Mikhaylova O, Yi Y, Sartor MA, et al. (2013) Folliculin Bidrar til VHL Tumor undertrykkende aktivitet i nyre kreft gjennom forskrift av Autophagy. PLoS ONE 8 (7): e70030. doi: 10,1371 /journal.pone.0070030
Redaktør: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, USA
mottatt: 16. april 2013; Godkjent: 14 juni 2013; Publisert: 29.07.2013
Copyright: © 2013 Bastola et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Myrovlytis Trust , Forskning Grant; NIH /NCI CA122346; BLR D VAmerit AwardB101BX0011100-02; UC P30-ES006096CEG. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
nyre kreft står for 2% til 3% av alle voksne maligniteter i USA. I 2011 ble det rapportert mer enn 64.770 aksjer nye tilfeller og 13.000 dødsfall, og forekomsten øker stadig med 2,5% per år. ccRCC representerer majoriteten (85% til 90%) av voksne nyrekreft, og er den mest ondartet form. Dette kreft er kjennetegnet ved en tidlig tap av VHL tumor suppressor på den korte arm av kromosom 3 i de fleste tumorer (80%). Det er velkjent at tap av VHL resulterer i økt akkumulering og aktivitet av den hypoksi-induserbare transkripsjonsfaktor (HIF), som i sin tur aktiverer ekspresjon av gener som fremmer tumorvekst. Blant disse er angiogene faktorer, noe som fører til økt blodstrøm gjennom tumorer, og dermed forsterke levering av næringsstoffer og oksygen til kreftceller. Gener som stimulerer anaerob glykolyse er også aktivert, og dette støtter tilpasning til redusert næringsstoffer og skift kreftceller mot metabolske veier som fremmer tumorvekst. Nylig oppdaget vi at en annen tumor-undertrykke veien er regulert av VHL. Vi fant at VHL er en viktig regulator av fremgangs macroautophagy (autophagy) [1]. Vi har fastslått at VHL, ved å indusere mikroRNA-204, hemmet LC3B-mediert autofagi som er nødvendig for ccRCC tumorvekst. Videre VHL, ved å hemme HIF, indusert uttrykk og aktivitet av en LC3B paralog, LC3C. I motsetning til LC3B, LC3C fungerer som en tumor suppressor [1].
I prosessen med å søke etter nye VHL-indusert gener som kunne delta i svulsten-undertrykkende aktivitet av VHL, oppdaget vi at tilberedning av vill -type VHL i RCC celler med tapt
VHL
indusert spesifikk og betydelig berikelse for gener uttrykt fra Smith-Magenis locus (SM) på den korte arm av kromosom 17p11.2. Smith-Magenis syndrom er en kompleks nevro lidelse preget av intellektuell svekkelse, kraniofaciale og skjelettavvik, og søvnforstyrrelser [2]. Interessant, inneholder dette locus annen nyre tumor-suppressor genet, folliculin (FLCN), hvis virksomhet er tapt i den genetiske autosomal-dominant lidelse, Birt-Hogg-Dubé syndrom (BHD) [3]. BHD er karakterisert ved hud fibrofolliculomas, lunge cyster, og spontan pneumothorax, samt nyrekreft av blandede histologiske typer, inkludert chromophobe, oncocytic, klar celle, og papillær typen [3]. Hensikten med dette arbeidet var å bestemme om FLCN bidrar til tumoren undertrykkende aktivitet av VHL. Vi viser at FLCN bidrar til VHL-mediert hemming av tumorvekst ved å påvirke LC3B og LC3C autophagic trasé.
Materialer og Metoder
cellekultur Metoder og behandlinger
Vår metode for genererer bassenger av menneskelig VHL (-) og VHL (+) 786-O, A498, og Caki-1 celler ble beskrevet av oss før [1], [4], [5]. RCC4 celler var gave fra Dr. Jamie Kairo (Jefferson University) og ble beskrevet av oss før [6]. Autophagic flukser ble utført som beskrevet tidligere [1]. For protein eller RNA-ekstraksjon, ble celler platet, 24 timer senere ble mediet endret til at med enten 10% eller 0.1% serum, og cellene ble oppsamlet 48 timer senere. Cellene ble deretter lysert i RIPA-buffer med protease, fosfatase, og proteasomal inhibitorer for PAGE-analyse, eller i TRI Reagens for RNA-ekstraksjon. For RNAi eksperimenter, pLKO.1 basert shRNA konstruerer for FLCN (TRCN0000005969, TRCN0000005970, og TRCN0000010979; Åpne Biosystems) var VSV-G konvolutt pakket (Cincinnati Children Hospital Medical Center Viral Vector Core) og infisert inn i celler, som så ble behandlet med plasmid-aktuelle utvalgs reagenser. VHL shRNA konstruksjoner ble beskrevet før [5]. Transductions med lentiviral partikler som ble utført med 2 mikrogram /ml polybrene.
Menneske RCC Svulster
Fresh-frosne prøver av ccRCC tumorer (n = 128) og matchet normale nyreprøver (n = 114 ) ble oppnådd og analysert for
VHL
sekvens og proteinekspresjon, som beskrevet tidligere [4]. Prøver som ble analysert for ekspresjon av protein og mRNA, også som beskrevet tidligere.
Kvantitativ RT-PCR
For mRNA-analyse, ble prøvene først revers transkribert ved hjelp av TaqMan mikroRNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems), og kvantifisert med real-time PCR på en Applied Biosystems 7900HT Fast real-Time CRSystem. QRT-PCR ble utført som beskrevet før, og ved anvendelse av primere beskrevet i tabell S4. Beskrivelse av RNA mikromatriser er gitt i supplerende metoder.
Western Blot analyse
Totalt cellulære lysatene ble oppnådd ved lyse celler i RIPA buffer som inneholder proteinase og fosfatase hemmere. 5 til 30 ug ekstrakter ble separert på 4% til 12% eller 10% polyakrylamidgeler og overført til PVDF-membraner. Semi-kvantitativ immunoblotting for humane RCC-tumorer og matchede normale nyrer ble utført som beskrevet tidligere [4]. Følgende polyklonale antistoffer ble hentet fra Cell Signaling Technology (Danvar, MA): anti-FLCN, anti- S6 kinase 1 og T
389 fosforylering; anti-S6 og S
240/244 fosforylering; anti- 4EBP og T
37/46 eller S
65 fosforylering. Polyklonale anti-LC3B (Abcam, Cambridge, MA) og anti-LC3C (Abgent, San Diego, CA) ble brukt. Den følgende monoklonale antistoffer fra mus ble anvendt: anti-VHL (Pharmingen, San Jose, CA), anti-hemagglutinin (Boehringer Ingelheim, Østerrike); og anti-GAPDH (Abcam, Cambridge, MA).
Mus xenograft Eksperimenter
For intra-nyre injeksjoner, 30.000 celler ble resuspendert i Matrigel til et endelig volum på 30 ul, og deretter langsomt injiseres noen få millimeter under nyre kapsel av 4 til 5 uker gamle atymiske nakne mus. Etter 10 til 12 uker mus ble ofret, ble svulster med nyrer innsamlet og fiksert i 4% paraformaldehyde, parafin innebygd, og H E farget eller behandlet for S6 /S6P flekker i Histopatologi Kjerne på i Avdeling for patologi ved CCHMC
Statistisk analyse av kvantifiserte data
data~~POS=TRUNC normalisering og analyse av RNA mikromatriser er beskrevet i supplerende metoder. Dataene ble avsatt til Gene Expression Omnibus med tiltredelse nummer GSE47106. For deskriptiv statistikk, blir data uttrykt som middelverdi ± SEM, med mindre annet er angitt. Analyse av differensial ekspresjon ble utført ved å bruke t-test eller en-veis analyse av varians (ANOVA) etterfulgt av Tukey-Kramer multippel sammenligningstester. For kvantifisering av immunoblottingforsøk eksperimenter de normaliserte verdier av protein overflod nivåer ble log2 forvandlet til rette robust, avvik-insensitive analyse. Standard box-og-whisker tomter ble brukt til å sammenligne fordelinger av normalisert overflod tiltaket for enkelte proteiner. Forskjellene mellom gjennomsnittsnivåer i to typer prøver ble vurdert ved anvendelse av (tosidig) t-test og ytterligere validert av Wilcoxon test. Forskjeller som resulterer i P 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Etikk erklæringen
Alle forsøk på mus ble utført i henhold til protokollen er godkjent av University of Cincinnati Institutional Animal Care og bruk komité. (protokoll nummer: 06-07-21-01). Alle operasjoner ble utført under isoflurananestesi og alle anstrengelser ble gjort for å redusere smerte. Alle menneskelige prøvene var anonym og unntas fra University of Cincinnati Internal Fagfellerådsmedlemmer protokollkrav.
Resultater
Uttrykk for FLCN er indusert av VHL
Å identifisere VHL-indusert gener som kan delta i den tumor-undertrykkende aktivitet av VHL, utførte vi mRNA microarray forsøk hvor vi sammenlignet genekspresjon i humane RCC 786-O VHL (-) celler og de samme celler med rekonstituert, vill-type VHL (786-O VHL (+)). Statistisk analyse identifisert 1,310 transkripsjoner forskjellig uttrykt i de to celletyper (FDR 0,1 og 50% endring i uttrykket nivå). (Tabell S1)
Interessant, blant de 588 transkripsjoner indusert av rekonstituering av VHL, vi har funnet en betydelig anrikning av gener som befinner seg på den korte arm av kromosom 17 (10,71% av alle signifikant induserte gener), og særlig i cytoband 17p11.2, som inneholder SM-locus (1,7% av alle signifikant induserte gener) (tabell 1 og S2). Det var også en konsentrasjon av gener som induseres av VHL på kromosom 14 (7,85% av alle signifikant induserte gener) med hoved cytoband blir 14q22.1. VHL-mediert induksjon av flere av SM-genene ble ytterligere bekreftet ved kvantitativ RT-PCR (fig. S1). I motsetning til dette, ble gener som ble undertrykt ved VHL anriket på kromosom 7 (63 gener, 9,75% av alle signifikant fortrengte gener) og kromosom 9 (42 gener, 6,5% av alle undertrykte gener) (tabell S3).
SM locus inneholder et gen som koder et annet nedsatt nyre tumor suppressor, FLCN. Analyse av FLCN mRNA og protein avslørte øket ekspresjon av både i 786-O og A498-celler med rekonstituert VHL, sammenlignet med foreldre VHL (-) celler (Fig. 1A og B). I tillegg ble FLCN mRNA og protein uttrykk trykt i Caki1 nyrekreftceller der vi slått ned endogen VHL uttrykk ved hjelp shRNA (Fig. 1C og 1D). Endringen i FLCN mRNA-ekspresjon var i området fra 1,5 til 2 ganger, lik andre SM-gener (se fig. S1). Men induksjon på nivået av protein var i 3 til 4 ganger range, en indikasjon på at posttranskripsjonelt mekanismer spiller en rolle i denne forskriften. I disse studiene har vi også observert VHL-mediert induksjon av p53, et annet gen lokalisert på kromosom 17p13.1 i nærhet av SM-locus, således validere et funn som tidligere er blitt beskrevet av andre, [7].
Rekonstituering av VHL i 786-O og A498 celler førte til induksjon av FLCN og p53 mRNA (A) og proteiner (B). Knockdown av VHL i Caki-1 celler resulterte i redusert FLCN mRNA (C) og protein (D) nivåer; *** P 0,001, ** P 0,01. Scr- rykke kontroll virus.
Fordi VHL er tapt i sporadisk klarcellet nyrecellekarsinom (ccRCC), målte vi uttrykk for FLCN i lysatene fra menneskelige ccRCC svulster sammenlignet med tilstøtende nyrevevet i prøver med kjent
VHL
status. Vi har tidligere beskrevet befolkningen i menneske ccRCC-normal nyre parene som vi brukte for denne analysen [4]. Den FLCN protein ble analysert ved hjelp av semi-kvantitativ immunoblotting som beskrevet tidligere [4] og mRNA ble bestemt ved kvantitativ RT-PCR. Expression of FLCN protein ble markert redusert i ccRCC svulster sammenlignet med normale nyrer i befolkningen av ccRCC med
VHL
slettet (Fig. 2A og 2B). I kontrast, fikk vi ikke se signifikante forskjeller i FLCN nivåer når man sammenligner ccRCC med vill-type
VHL
til tilsvarende normal nyrevevet (Fig. 2C). Interessant nivåene av FLCN mRNA ikke skiller mellom tumor-nyre par i enten gruppe svulster (fig. 2D), som støtter en rolle for posttranskripsjonelt mekanismer i reguleringen av FLCN uttrykk.
Analyse av FLCN protein (A C) og mRNA (D) i prøver av menneskelig ccRCC med kjent
VHL
status, sammenlignet med tilstøtende nyrevevet. A. En representant western blot analyse av FLCN protein i par av nyre (K) og svulst med tapte
VHL plakater (VHL-DEL) separert på 10% SIDE. Den nedre bandet kan representere en degradering eller posttranslational modifisering av FLCN. B og C. Kvantifisering av FLCN protein uttrykk i svulster som hadde mistet
VHL plakater (VHL-DEL) og svulster med villtype
VHL plakater (VHL-WT). Boksene representerer nedre og øvre kvartil atskilt med median (tykk horisontal linje) og Linjene utvides opp til minimums- og maksimumsverdier, unntatt punkter som ligger utenfor 1,5 indre kvartilområdet fra boksen (merket som sirkler). Gjennomsnitt ± SD for hver fordeling er angitt med prikker og lukkede passet på værhår, respektivt. D. Kvantitativ RT-PCR måling av FLCN mRNA nivåer i nyrene og ccRCC VHL-DEL og VHL-WT svulster.
FLCN Bidrar til VHL-mediert Tumor Suppression
For å finne ut om det var en funksjonell kobling mellom FLCN og svulsten-undertrykkende aktivitet av VHL, vi slått ned uttrykk for FLCN i 786-O VHL (+) celler ved hjelp av tre forskjellige shRNAs (fig. 3A). Vi deretter injisert i disse celler under nyre kapsler med nakne mus, noe som resulterte i økt tumorforekomst og større svulststørrelsen sammenlignet med tumorer avledet fra injiserte kontrollceller som ble transdusert med lentiviruser som inneholder krafse sekvens (fig. 3B). Svulstene med FLCN knockdown hadde en svært ondartet, dedifferensieres fenotype (Fig. 3C).
shRNA-indusert knockdown av FLCN fremmer tumordannelse ved 786-O celler med rekonstituert VHL. A. Western blot som viser en reduksjon i FLCN protein ekspresjon i celler som stabilt uttrykker tre forskjellige FLCN shRNAs sammenlignet med celler transfektert med krafse (SCR) kontroll. B. Kvantifisering av forekomst og vekten av tumorer som er dannet av de angitte cellelinjer in ortotopiske xenografter. NK- gjennomsnittsvekt på normal nyrefunksjon. C. H E farging av representative deler for svulster dyrket ved VHL (+) /krafse kontrollceller og VHL (+) celler med FLCN knockdowns. Skala Stolper = 50 um.
Fordi FLCN ble vist å inhibere aktiviteten til mTORC1 reaksjonsveien i UOK257 celler og musemodeller av BHD nyrekreft [8], [9], analyserte vi effektene av FLCN knockdown på aktiviteten av denne reaksjonsveien i cellene brukes for disse ortotopiske xenografter. Viktigere, knockdown av FLCN resulterte i redusert mTORC1 aktivitet (Fig. 4A), som målt ved fosforylering av S6K, S6 og 4EBP, i dyrkede celler. Vi har også bestemt ekspresjon av S6 og S6-P er seksjoner fra xenoimplantater tumorer dannet ved VHL (+) /krypterings transfekterte celler sammenlignet med tumorer som dannes av disse cellene med FLCN slått ned. I overensstemmelse med resultatene oppnådd fra cellekultur eksperimenter, seksjoner fra VHL (+) /FLCNKD tumorer viste nedre farging for S6-P sammenlignet med kontroll vev, mens fargingen for total S6 var lignende (fig. 4B). Dette resultatet tyder på at forsterket aktivitet av mTORC1 banen ikke bidra til økt tumorvekst i disse cellene.
A. Western blot analyse av mTOR nedstrøms mål i 786-O VHL (+) celler som stabilt uttrykker enten rykke eller to forskjellige FLCN shRNAs. GAPDH lastekontroll er vist for hver gruppe av behandlede immunoblot av samme gel. B. Representative deler av indikert svulster farget for S6 og S6P. Scale bar = 50 mikrometer.
Nylig har vi beskrevet at VHL undertrykker LC3B-mediert, pro-onkogen autofagi mens det stimulerer en roman svulst undertrykke autophagic program, formidlet av LC3C [1]. LC3s er godt etablert autophagic regulatorer er nødvendig for dannelsen av de doble membran autophagosomes og for erverv av lasten. Dermed har vi undersøkt om FLCN kan utøve sin svulst undertrykkende aktivitet nedstrøms fra VHL ved å regulere LC3C eller LC3B autofagi. LC3C induseres ved sult i VHL (+) celler, og dermed i disse forsøkene, ble VHL (+) 786-O og RCC4 cellene sultet i 0,1% serum i 48 timer og deretter behandlet i 1 time med klorokin, en lysosomal inhibitor i rekkefølge for å hemme autophagic strømning og akkumulering av den hurtigere migrerende, lipidert form (LC-II) av LC3B og LC3C ble målt ved western blotting. Vi fant at knockdown av FLCN resulterte i en betydelig reduksjon i akkumuleringen av LC3C med en økning i LC3B begge cellelinjer (Fig. 5). Endringen i LC3B i VHL (+) RCC celler var ikke assosiert med noen konsistente endringer i MIR-204 (data ikke vist). Dette resultatet indikerer at FLCN regulerer autofagi på samme måte som VHL, og dermed effekten på autofagi kan være delvis ansvarlig for bidraget av FLCN til tumoren undertrykkende aktivitet av VHL.
knockdown av FLCN (shRNA 3) i 786- O (A) eller RCC4 (B) VHL (+) celler som reduserer akkumuleringen av tumorundertrykkende LC3C-II, men induserer ekspresjon av onkogent LC3B-II. Western blot ble analysert med angitte antistoffer. C. Kvantifisering av 3 uavhengige eksperimenter som er vist i panel A og B. LC3 proteinnivåer målt ved optisk tetthet ble først normalisert til GAPDH. Da forholdet mellom LC3 ble beregnet mellom LC3 nivåene målt i klorokin behandlede prøver i celler med FLCN slått ned og kontrollcellene (sammenlign spor 6 til lane 3 i panelene A og B). D. Modell av den foreslåtte reguleringen.
Diskusjoner
Her rapporterte vi at VHL regulerer uttrykket av FLCN og som i sin tur FLCN deltar i svulsten undertrykke aktiviteten av VHL. De observerte effekter av FLCN knockdown på tumorvekst er i overensstemmelse med den negative effekten av FLCN overekspresjon på dannelsen av tumorer ved 786-O VHL (-) celler, som observert av andre [10]. Viktigere, regulerer FLCN LC3B og LC3C autophagic programmer på en måte som ligner på VHL, dvs. FLCN hemmer LC3B og stimulerer LC3C autophagic aktivitet (fig. 5D). Fordi vi demonstrert at både LC3B og LC3C utøve viktige og motsatte effekter på veksten av ccRCC tumorer [1], foreslår at bidraget fra FLCN til den tumor-undertrykkende aktivitet av VHL resultater, i det minste delvis, fra dens virkninger på autophagy (Fig . 5D). Regulering av LC3B av FLCN representerer trolig en mekanisme i tillegg til den tidligere beskrevet av oss VHL-mediert hemming av LC3B gjennom MIR-204, som vi ikke måle konsistente effekter av FLCN på MIR-204. På samme tid både tumorundertrykkere kan indusere ekspresjon av LC3C gjennom undertrykkelse av HIF, ettersom LC3C er et HIF-inhibert genet. VHL er vel anerkjent for sin evne til å hemme HIF-aS protein ekspresjon og aktivitet. Nylig FLCN har også blitt rapportert å avta HIF aktivitet, selv om det ikke påvirker opphopning av HIF-aS subenheter [11].
Den spesifikke rolle FLCN i reguleringen av autofagi er videre støttet av den nylig identifiserte nærværet av denn domene i den karboksy-terminale region av FLCN [12]. Dette motivet er til stede også i folicullin assosiert protein-1 og 2 (FNIP1 og FNIP2 [13]), og interessant i et annet protein uttrykt fra SM locus, SMCR8 [13], som vi har funnet også å bli indusert av VHL (Fig . S1). Disse proteinene er konstituert som BNP-GTP utvekslings faktorer (GEFs) for RAB GTPases, potensielt nødvendige for autofagi forbundet menneskehandel og fusion [11], [13].
SM locus har ikke vært knyttet til ccRCC. Tidligere har bare ett gen fra denne locus, TNFSF13 (tumornekrosefaktor superfamilien delen 13), har blitt studert i denne forbindelse. Den ble funnet å oppvise redusert mRNA-nivåer i ccRCC sammenlignet med normal nyre. I tillegg ble det høyere nivåer av denne reseptoren vist seg å være korrelert med bedre samlet og sykdomsfri overlevelse [14]. Men det er mulig at videre analyser vil avdekke ytterligere autofagi relaterte funksjoner av gener uttrykt fra SM locus.
FLCN bidrar til VHL-indusert tumor undertrykkelse av en mekanisme som ikke ser ut til å innebære aktivering av mTOR veien. Faktisk, i 786-O celler med rekonstituert VHL og FLCN slått ned, vi viste faktisk en sterk reduksjon i flere fosforylering hendelser som brukes som indikatorer på mTOR-aktivitet. I overensstemmelse med inhiberingen av mTOR Vi målte økt akkumulering av LC3B, en utbredt autophagic utlesning, og denne økte LC3B-mediert autofagi kan bidra til tumorvekst. De observerte effektene av FLCN på mTOR aktiviteten er i samsvar med flere publikasjoner rapporterer om en positiv sammenheng mellom nivåer av FLCN og mTOR i U251, HEK293, HK-2, ACHN, 786-O VHL (-) celler [15]. Men den nåværende kanoniske forståelsen av FLCN-mTOR-forbindelse er at FLCN regulerer negativt mTOR-reaksjonsveien [8], [9], [16]. I så måte den menneskelige UOK257 cellelinje avledet fra en BHD pasient, som ikke uttrykker VHL, viser en høy grad av mTOR-aktivitet, og mus med FLCN knockout demonstrere høye nivåer av S6 fosforylering [8], [9]. Årsaken til dette avviket er for øyeblikket ikke forstått, men kanskje dataene peker mot en compartmentalized effekt av FLCN på mTOR som er berørt av den cellulære sammenheng, for eksempel aktivitet av VHL. Likevel kan tilkobling av VHL til en tumor suppressor som regulerer en metabolismevei i nyrekreft avsløre en ny del av VHL tumor-undertrykkende aktivitet som er komplementær til sine roller i regulering av angiogenese og autofagi.
Viktigere , FLCN protein nivåer er redusert i menneskelig ccRCC med
VHL
tap, ytterligere støtte en rolle for denne tumor suppressor i veksten av ccRCC. Så langt har ingen FLCN mutasjoner eller endringer i mRNA nivåer er målt i ccRCC. Dette konvergens i funksjonene VHL og FLCN er av spesiell interesse med tanke på at klarcellet karsinom kan være en del av multihistological type nyrekreft som oppstår i BHD syndrom.
Naturen av direkte molekylære mekanismen som VHL induserer FLCN renal tumor suppressors gjenstår å fastslå, men vil sannsynligvis innebære flere mekanismer. Fordi vi målt en effekt av VHL på FLCN mRNA likevektsnivåer i RCC cellelinjer, forventer vi en viss grad av transkripsjonen induksjon eller stabilisering av FLCN mRNA. I den forbindelse har vi ikke funnet noen effekter av p53 knockdown på FLCN uttrykk. Fordi vi ikke finne endringer i FLCN mRNA nivåer mellom menneskenyrekreft parene selv om vi fant forskjell i steady-state of FLCN protein, foreslår vi at det også er en viktig translasjonsforskning komponent til denne forskriften, muligens avhengig av spesifisitet ulike nyre celle populasjoner. En forklaring er at VHL kan undertrykke uttrykket av spesifikke microRNAs, som igjen undertrykke FLCN oversettelse.
I sammendraget, med denne studien, har vi gitt første bevis for en direkte forbindelse mellom VHL og FLCN tumor-undertrykkende veier konvergerende på regulering av autofagi i nyrekreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
VHL induserer ekspresjon av flere gener uttrykt fra Smith-Magenis locus i 786-0 og A498 celler. Grafen viser endringer i ekspresjonen av individuelle mRNA basert på kvantitative QRT-PCR-målinger. Brett endring representerer forskjellen i uttrykket av mRNA i VHL (+) versus VHL (-) celler. Sekvensen av primere er gitt i
doi:. 10,1371 /journal.pone.0070030.s001 product: (PDF)
Tabell S1.
Liste over gener betydelig undertrykt eller indusert av VHL i 786-O celler. Brett endring representerer VHL (+) /VHL (-) ratio
doi:. 10,1371 /journal.pone.0070030.s002 plakater (docx)
Tabell S2.
Gener betydelig indusert av VHL og beriket for bestemte kromosom eller cytoband
doi:. 10,1371 /journal.pone.0070030.s003 plakater (XLS)
tabell S3.
Gener betydelig redusert med VHL og beriket for bestemte kromosom eller cytoband
doi:. 10,1371 /journal.pone.0070030.s004 plakater (docx)
Tabell S4.
Sekvens av primere for de angitte genene som brukes i QRT-PCR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0070030.s005 plakater (docx)
Takk
takker G. Doerman for utarbeidelse av figurene og Dr. M. Daston for å redigere manuskriptet.
