Abstract
deregulert microRNAs spille en rolle i utvikling og progresjon av kreft i tykktarmen, men lite er kjent om deres vev og cellefordeling i kontinuum av normal slimhinne gjennom premaligne adenom til invasiv adenokarsinom. Hensikten med denne studien var å undersøke uttrykk mønster av MIR-17-92 cluster (MIR-17, MIR-18, MIR-19, MIR-20 og MIR-92) samt MIR-21, MIR-31 , MIR-135b, og MIR-145 i begynnelsen av klinisk diagnostisert kreft i tykktarmen. MicroRNAs ble analysert ved kromogen
in situ
hybridisering i normal-adenom-adenokarsinom sekvens av ni adenokarsinomer utviklet i slimhinnene kolon polypper. Deretter ble uttrykk for utvalgte microRNAs validert i 24 slimhinnetykktarmskreft polypper. Ekspresjon av MIR-17 ble begrenset til epitelceller, og uttrykket nivåer økte i overgangssonen fra normal til adenomatøs vev. Mir-17-92 klase medlemmer, MIR-19b, MIR-20a, og MIR-92A, fulgte samme uttrykksmønster, men MIR-17 var den mest dominerende. En økt ekspresjon av MIR-21 ble funnet i den tumor-assosiert stroma med den mest dramatiske økningen fra adenom til adenokarsinom, mens antallet positive MIR-145 fibroblast-lignende celler i normal lamina propria (stroma) ble redusert på en trinnvis måte i løpet av normal-adenom-adenokarsinom sekvens. Det konkluderes med at uttrykket av MIR-17, MIR-21, og MIR-145 endringer i tidlige stadier av normal-adenom-adenokarsinom sekvens. Dermed kan disse microRNAs spille en rolle i utviklingen av tykktarmskreft
Citation. Knudsen KN, Nielsen BS, Lindebjerg J, Hansen TF, Holst R, Sørensen FB (2015) mikroRNA-17 er den mest Up -Regulated medlem av MIR-17-92 Cluster under kreft i tykktarmen Evolution. PLoS ONE 10 (10): e0140503. doi: 10,1371 /journal.pone.0140503
Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, UNITED STATES
mottatt: 11 juni 2015; Godkjent: 24 september 2015; Publisert: 14 oktober 2015
Copyright: © 2015 Knudsen et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. studien ble finansiert av Region Syddanmark doktorgrads Fund (tilskudd nummer 12/6786, https://www.regionsyddanmark.dk/wm325002), The Syddansk universitet (www.sdu.dk), Forskningsrådet Lillebælt Hospital (https://www.sygehuslillebaelt.dk/wm223295), kong Christian X Foundation (https://kongehuset.dk/Menu/Fonde–legater/Kong-Christian-den-Tiendes-Fond/kong-christian-den-tiendesfond), Familien Spogaard Foundation (https://www.cancer.dk/forskning/stoette-til-forskning/familien-spogaards-fond/), Aase og Ejnar Danielsen Foundation (tilskudd nummer 10-000789, http: //www.danielsensfond .dk /default.aspx), og stortingsrepresentant J. Christensen og kone K. Christensen Foundation. Alle tilskudd nevnt ovenfor ble gitt til KNK. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. BSN er ansatt av et kommersielt selskap (Bioneer A /S, Danmark). Den Funder gitt støtte i form av lønn, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. BSN er ansatt i et kommersielt selskap (Bioneer A /S, Danmark). Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Tykktarmskreft er blant en av de vanligste kreftformene i verden [1]. En betydelig andel av disse kreftformer antas å utvikle seg på en trinnvis måte fra normal tykktarmsslimhinne gjennom en premalign adenom til invasiv adenokarsinom som et resultat av komplekse genetiske og epigenetiske endringer [2-4]. MicroRNAs (mirnas) er en klasse av ikke-kodende RNA medierer post-transkripsjonell regulering som har vært implisert i kolorektal karsinogenese og tumorprogresjon ved å virke som onkogener og tumor suppressorer [5-7]. De mirnas, som vanligvis inneholder ~ 22 nukleotider, rettet mot mer enn 60% av alle proteinkodende gener [8], og hver miRNA kan potensielt undertrykke hundrevis av målgener [9].
microRNAs er uttrykt som utskrifter som inneholder en enkelt miRNA som MIR-21 eller en rekke modne miRNAs (polycistrons), som Mir-143/145 og MIR-17-92 klynger. Mir-17-92 klynge inneholder seks ulike mirnas: Mir-17, MIR-18a, MIR-19a, MIR-19b, MIR-20a, og MIR-92A, med en svært lik sekvens mellom MIR-19a og MIR-19b og mellom MIR-17 og MIR-20a [10]. Alle klynge medlemmer har blitt funnet forhøyet i kolorektal kreftvevet sammenlignet med normalt vev, men med varierende ekspresjon av hver enkelt komponent [11-13]. Andre hyppig beskrevet oppregulert mirnas i tykk- og endetarmskreft er MIR-21 og MIR-31 [14-16], mens MIR-145 er blant de mest konsekvent nedregulert mirnas [15-18]. Videre har MIR-135b blitt rapportert å være involvert i tidlig tumourogenesis [19,20].
Til tross for den massive pågående forskning på miRNA i tykktarmskreft, har bare noen få studier undersøkt miRNA endringer langs hele normal- adenom-adenokarsinom (NA-AC) sekvens [20-24]. Bartley
et al
funnet totalt 230 forskjellig uttrykt mirnas i NA-AC evolusjonær modell inkludert MIR-17, MIR-19, MIR-92a, og MIR-21 [21], mens andre forskere har rapportert MIR-31 og MIR-135b å være blant de mest endret mirnas [20,22,25]. Det har også blitt vist at MIR-21 oppregulering fra adenom til adenokarsinom er et resultat av økt ekspresjon i cancerassosierte stromale fibroblaster i tumor-mikromiljøet [26]. Imidlertid er informasjon om vev og celle fordeling av mirnas i kontinuum av den N-A-AC sekvens fortsatt snaut. Kunnskap om miRNA lokalisering og uttrykk er av fundamental betydning for å forstå deres eksakte rolle i initiering, utvikling og progresjon av kreft i tykktarmen.
adenokarsinomer utviklings i slimhinne polypper (ACP) gir en unik mulighet til å studere tidlig sekvensiell utvikling av adenocarcinoma i den samme pasient. Bruke ACP av tykktarmen som en modell av NA-AC-sekvensen, er målet med denne studien var å beskrive uttrykk mønstre av Mir-17-92 klyngemedlemmer samt MIR-21, MIR-31, MIR-135b og MIR-145 i tykktarmskreft utvikling med fokus på deres utbredelse, distribusjon vev, og cellulær opprinnelse.
Materialer og metoder
vevet undersøkt i denne studien besto av to uavhengige sett med kliniske, diagnostiske prøver: en test sett med ni formalinfikserte, parafininnstøpte (FFPE) ACP-posisjoner og en validering sett av 24 FFPE ACP-posisjoner fra tykktarmen. Alle vevsblokker ble hentet fra diagnostisk patologi arkiv av Institutt for klinisk patologi, Vejle sykehus. Prøvene for testen studien ble opprinnelig diagnostisert under en tykktarmskreft screening mulighetsstudie fra 2005 gjennom 2006 i fylket Vejle, Danmark, mens valideringssettet stammer fra henviste pasienter diagnostisert ved Vejle sykehus fra 2005 gjennom 2009. Bare vanlige adenokarsinomer var inkludert, og slimhinne polypper inneholder sagtannete adenomer ble ekskludert. Bekreftelse på diagnose og ny sensur av adenomatøs komponenter i polypper ble utført av en erfaren gastrointestinal patolog. Detaljert pasientinformasjon er vist i tabell 1.
I studien utbruddet, hver histologisk seksjon inneholdt alle tre komponentene i ACP-posisjoner,
i
.
e
. normal slimhinne, adenomatøs vev, og invasiv adenokarsinom. Men som flere seksjoner ble kuttet fra vevsblokker manglet noen områder av interesse, og dermed to prøver fra testsettet og opp til seks fra valideringssettet unnlatt å gi fullstendige data fra alle tre kamrene i NA-AC sekvens.
studien ble godkjent av Regional Vitenskapelige etiske komiteer Syddansk (ID # S-20120075) og gitt en fraskrivelse av informert samtykke. Studien ble registrert i det danske Datatilsynet og Den danske Registeret menneskelig vev Utnyttelse ble konsultert før eventuelle vevsprøver ble brukt.
In situ
hybridisering analyse
In situ
hybridisering (ISH) for MIR-17, MIR-21, MIR-145, MIR-126, MIR-31, MIR-125b, MIR-135b, MIR-200b, MIR-18a, miR19b , MIR-20a, og MIR-92a ble i hovedsak utført som beskrevet tidligere [27]. De miRNA probe sekvenser og eksperimentelle detaljer presenteres i S1 tabell. I korte trekk ble utført ISH analyse på 6 mikrometer tykke seksjoner ved hjelp av en Tecan Evo instrument (Männedorf, Sveits). Analyse optimalisering for å bestemme optimal probe konsentrasjoner og hybridisering temperaturer ble utført før analysen. Snittene ble pre-fordøyd med proteinase-K (15 pg /ml) ved 37 ° C i 8 minutter, pre-hybridisert ved 57 ° C i 15 minutter, og hybridisert med dobbel-karboksyfluorescein (FAM) merket Låst Nucleic Acid (LNA) prober (Exiqon A /S, Danmark). Etter strenge vaskinger i saltvann-natriumcitrat-buffer, ble sondene påvist med alkalisk fosfatase-konjugert sau anti-FAM Fab-fragmenter, etterfulgt av inkubasjon i substratet inneholdende 4-nitro-blå tetrazolium og 5-brom-4-klor-3′-Indolylphosphate (Roche , Danmark) som resulterer i en mørk blå flekker, og til slutt kontra med atom rask rød (Vector Laboratories, CA)
Morfologisk evaluering av miRNA uttrykk og β-catenin
Alle lysbildene ble evaluert subjektivt og mottok en semi-kvantitativt ifølge miRNA intensitet (0 = negativ 1 = svak 2 = sterk), og andelen av fargede celler (0 = 50%, 1 = 50%), bortsett fra MIR-21. Den totale poengsummen ble bestemt ved å legge til intensitet og andelen score og dichotomising summen til «lav» (skår 0-1) eller «high» (skår 2-3) uttrykk. På grunn av et bredt spekter av MIR-21-positive celler i prøvene, ble andelen av mir-21 fargede celler kategoriseres som 0 = mindre enn 1%, 1 = 1% -50% og 2 = 50%, og den intensitet ble anvendt som beskrevet ovenfor. Den totale MIR-21 Poengsummen ble delt inn i tre kategorier: 0-1 = lav; 2-3 = moderat; 4 = høy uttrykk.
β-catenin uttrykk ble evaluert for membran, cytoplasma, og nukleær farging. Siden den cytoplasmiske reaksjonen ble homogent fordelt i tumor kamrene, ble bare intensiteten preges (svak, moderat og sterk). Fordi cytoplasma farging tåkela membran immunologiske reaksjon på mange adenomatøse og invasive områder, ble membran flekker ikke scoret i disse rommene. Nuclear farging ble delt inn i to grupper: negativ = ingen kjernereaksjon sett og positiv = alt fra noen få spredte positive celler, fokus reaksjon, eller diffuse reaksjon
Bildeanalyse
Den morfologiske evaluering dokumentert. en uttalt oppregulering av MIR-17 i epitelcellene, som kalles for videre analyse ved hjelp av følgende objektiv tilnærming: Digitale hele glide bilder ble oppnådd med en x20 objektiv ved hjelp av en Axio Scan Z1 lysfelt-scanner (Carl Zeiss, Tyskland). Bildeanalyse av de digitale lysbildene ble utført ved hjelp VisiomorphDP programvare (Visiopharm, Danmark). I de 16 tilfellene ble kvantitative estimater av MIR-17 ISH signal oppnådd i regioner med normal tarmslimhinnen (N), lav karakter adenom (LGA), høygradig adenom (HGA), og adenokarsinom, der slike homogene vevskomponenter var tydelig . Regionene ble identifisert av en erfaren gastrointestinal patolog og omkranset som områder av interesse (ROI) i de digitale hele lysbildene. Åtte tilfeller ble analysert i duplikat, og dataene fra de to objektglass ble slått sammen. De gjennomsnittlige områder evaluert (av Rois) var: N: 5.2 mm
2 (n = 24); LGA: 6,1 mm
2 (n = 9); HGA: 7,4 mm
2 (n = 21), og adenokarsinom: 8,2 mm
2 (n = 24), hvor n er antall representative Rois. En piksel klassifikator ble trenet til å skille det blå ISH signal fra den røde counterstain, de ufargede og svakt farget vev, og vevet frie områder, og med en intensitet terskel diskriminere mellomblå fra intens blå. De følgende parametre ble oppnådd i løpet av bildebehandlingen fra hvert ROI: område av middels blå område med intens blå, og det totale arealet av den enkelte ROIs. De relative fraksjoner område, områder med middels + intense blå delt med det totale arealet (vilkårlig enhet), ble ansett som representative for de relative MIR-17 uttrykket nivåer.
Immunohistochemistry (IHC)
IHC ble utført på 4 um vevssnitt fra de samme blokkene som benyttes for ISH analyse. EnVision FLEX +, mus, High pH (Link) (Dako, Glostrup, Danmark kode K8002) ble brukt for epitop henting og IHC flekker.
For fosfatase og tensin homolog (PTEN) analyse, lysbildene ble inkubert med PTEN-antistoff (1: 200, Dako, Danmark, kode M3627) i 30 minutter, forsterket med musen kobling-antistoff i 20 minutter etterfulgt av pepperrot peroksidase-polymer-deteksjon i 30 minutter. Antistoff farging ble utført på en Dako Autostainer Plus (Dako, Danmark) ved hjelp av 3,3′-diaminobenzidin som kromogen og Mayers hematoksylin som counterstain. Komplett negative IHC reaksjon ble ansett som tap av PTEN.
Mismatch reparasjon protein status hadde blitt utført rutinemessig ved hjelp av IHC på omtrent halvparten av prøvene under den primære Patho-anatomisk diagnostisk prosedyre. De resterende tilfellene ble farget med antistoffer mot MLH1 (1: 100, Novocastra, UK, kode NCL-L-MLH1), MSH2 (1: 100, Novocastra, UK, kode NCL-MSH2), MSH6 (BD Transduction Laboratories, USA, kode 610919) og PMS2 (1: 500, BD Pharmingen, USA, kode 556415). Ikke-neoplastiske celler i og rundt svulsten fungert som intern positiv kontroll, og for negative kontroller den primære antistoffet ble utelatt
IHC analyser for glatt muskulatur aktin (1: 1000, Dako, Danmark, M0851)., Desmin (1: 400, Dako, Danmark, M0760) og h-caldesmon (1: 200, Dako, Danmark, M3557) ble utført på prøver fra testsettet, mens analyse for β-catenin (1: 2000, BD Biosciences, USA , kode 610153) ble utført på valideringssettet.
Statistisk analyse
Kontinuerlig MIR-17 data hentet fra bildeanalyse ble log-transformert for å gi en normal fordeling av restprodukter. For å justere for innen individuell variasjon, ble en multivariat blandede effekter lineær regresjonsmodell med tilfeldige effekter for prøve ID benyttes for å undersøke sammenhenger mellom log-MIR-17 og de faste kovariater: vevet type, alder, kjønn og histologi av adenom. Etterpå ble lineære kombinasjoner av estimatorer brukes til å sammenligne MIR-17 uttrykket nivåer mellom gruppene. P-verdier som er mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle analyser ble utført i STATA versjon 13 (STATACorp, TX, USA)
Resultater
Testtilfeller:. Morfologisk evaluering
Basert på litteratur anmeldelser [5-7,21 , 22,28-30], valgte vi å undersøke uttrykket av MIR-17, MIR-21, MIR-31, MIR-125b, MIR-126, MIR-135b, MIR-145, og MIR-200b i testen gruppe på ni ACP-posisjoner.
av de åtte testede mirnas, MIR-17, MIR-21, og MIR-145 viste uttrykket i NA-AC-sekvensen (fig 1A-1F). I sju av ni tilfeller ble økt MIR-17 uttrykk i epitelceller sett i overgangssonen fra normal til adenomatøs vev. Uttrykket ble oppholdt i kreft epitelceller. I alle prøvene, ble Mir-21 uttrykk hovedsakelig funnet i fibroblast-lignende stromale celler av dysplastiske og invasive regioner i ACP-posisjoner med bare sparsom og samlings reaksjon i kreft epitelceller. Uttrykket mønster så ut til å øke på en trinnvis måte gjennom den N-A-C-sekvensen. Alle tilfeller viste sterk ekspresjon av MIR-145 sett i de glatte muskelcellene (SMC) og vaskulære glatte muskelceller (VSMC), så vel som i fibroblast-lignende stromale celler. De sistnevnte celler ble lokalisert i umiddelbar nærhet av de epiteliale krypter og så ut til å avta i adenomatøs og kreftvev i seks av syv tilgjengelige tilfeller. IHC på de samme prøvene viste en positiv reaksjon for glatt muskel α-aktin og desmin, mens h-caldesmon var negativ, hvilket tyder på at disse MIR-145-positive celler er av myofibroblastic opprinnelse
(A og. B ) MIR-17 i normal (N) og adenomatøs (A) vev og i adenokarsinom (AC); (C (E) MIR-145 er sett i glatte muskelceller (pil) og vaskulære glatte muskelceller (pilspiss); i forstørrelse (F) et redusert antall MIR-145 positive fibroblast-lignende celler er funnet i adenom (pil) sammenlignet med normalt vev (pilspiss); (G) Svak MIR-125b signal ble sett i muskularis slimhinnen (mm); (H) MIR-200b ble observert i epitelceller ved bunnen av kryptene, men i dette tilfelle også i de epiteliale kreftceller; (I) MIR-126 er kun vist i endotelceller; (J) Kappløpet probe viste bare diskret bakgrunnsfarging.
Et positivt signal for MIR-125b, MIR-126, og MIR-200b var til stede i prøvene, men ingen differensial uttrykk for noe av disse tre Mirs ble observert når man sammenligner de tre delene (fig 1G-1i). En svak MIR-125b signalet ble sett i fibroblaster i normal slimhinne og SMC i fem av ni tilfeller. Alle prøvene viste MIR-200b positive epitelceller, spesielt på basis av normale kryptene i kolon så vel som et positivt signal i adenomatøs og kreft epitel. MIR-126 uttrykk ble begrenset til endotelceller og var til stede i alle tre avdelinger.
Nei uttrykk for MIR-31 og MIR-135b ble påvist i de ni prøvestykkene.
Validering studie : Morfologisk evaluering av MIR-17, MIR-21, og Mir-145 uttrykk
Basert på resultatene fra testsettet, analyser av MIR-17, MIR-21, og MIR-145 ble videre fulgt i valideringen sett av 24 ACP-posisjoner. Mir-17 signalet ble funnet utelukkende i epitelceller. Lav ekspresjon ble observert i de normale epitelceller i bunnen av kryptene, mens høy ekspresjon ble observert i overgangssonen fra normal til adenomatøs vev i 96% (23/24) av tilfellene (tabell 2). Uttrykket ble opprettholdt i den adenokarsinom i 96% (22/23) av tilfellene, mens signalet reduseres i det ene tilfellet (4%). Kun ett eksemplar viste økt uttrykk fra adenom til adenokarsinom. Disse to sakene avvek ikke klinisk fra de andre tilfellene av valideringssettet.
Tilsvarende funn i testsettet, MIR-21 uttrykk ble hovedsakelig funnet i stromale celler som omgir dysplastic og kreft kjertler. Ett tilfelle viste imidlertid MIR-21 uttrykk i kreft epitelceller, og i tre andre prøver samlings uttrykk i epiteliale kreftceller ble også observert. Ingen histopatologiske eller kliniske forskjeller ble dokumentert blant disse fire tilfellene i forhold til de andre 20 sakene. Moderat uttrykk for MIR-21 dukket opp i overgangssonen fra normal til adenom i stromale celler i 71% (17/24) av tilfellene. De resterende tilfellene viste økt uttrykk fra adenom til adenokarsinom (tabell 2). I 41% (9/22) av tilfellene ble oppregulering intensivert gjennom NA-AC sekvens med et moderat MIR-21 uttrykk i adenom og høy uttrykk i invasive foci.
Analysen av MIR-145 viste positivt pericryptal fibroblast-lignende stromale celler i normal lamina propria i tillegg til SMC i arterier og muskellagene i tarmveggen. I halvparten av tilfellene, antall MIR-145 positive pericryptal, fibroblast-lignende celler ble redusert i overgangssonen fra normal til adenomatøs vev. Denne reduksjonen var enda tydeligere når man sammenligner normalt å kreftvev med en reduksjon sett i 86% (19/22) av tilfellene (tabell 2). Den positive signal i SMC og VSMC forble uendret gjennom alle tre avdelinger.
Analyse for MIR-135b ble gjentatt i alle 24 valideringsprøver, men ingen ISH signal ble funnet. Saken med mismatch reparasjon proteinmangel ikke vise en miRNA uttrykk profil forskjellig fra de dyktige tilfeller, heller ikke de tre tilfellene med metastaser.
Uttrykk for β-catenin i NA-AC sekvens
Tydelig dominerende membran og svak cytoplasmatisk farge for β-catenin var til stede i alle 24 tilfeller (100%) av den ikke-neoplastiske epitel, mens ingen atom akkumulering ble observert (tabell S2 og A i fig S1). I adenomatøs komponenter, ble cytoplasmatiske uttrykk økt i 95% (20/21) av tilfellene (S2 Table). 62% (13/21) av de adenomer viste også positiv nukleær farging, mens dette ble observert i 95% (20/21) av de adenokarsinomer, oftest på invasiv foran og /eller i tumor spirende celler (B + C i S1 fig). Økt cytoplasma reaksjon ble observert i alle 21 (100%) adenokarsinomer (S2 Table).
Bildeanalyse av MIR-17
En undergruppe av 16 tilfeldig valgte prøver fra valideringssettet ble videre undersøkt ved bildeanalyse for å få kvantitative MIR-17 expression estimatene i områder med normalt vev, LGA, HGA og adenokarsinom. Estimater av MIR-17 uttrykk ble oppnådd som området fraksjoner (
i
.
e
. Fargede området delt med det totale arealet) og statistiske analyser ble utført på loggtransformerte data. Resultater fra den multivariate blandede lineære regresjonen er vist i tabell 3. Log-MIR-17 økte fra normalt vev til lav og høy grad av adenomatøs vev, og også for å invasiv kreft (p = 0,03, p 0,001 og p 0,001 henholdsvis intra- klasse korrelasjonskoeffisient = 0,19). Figur 2 viser en total økning på 10% (av det vilkårlige enhet) i løpet av NA-AC-sekvens, og at oppregulering forekom på en trinnvis måte som starter med en 2,4% økning fra normal til LGA (p = 0,03) og en ytterligere 6,9% økning fra lav karakter til HGA (p 0,001). Ingen forskjell i log-MIR-17 uttrykk ble sett i progresjon fra HGA til adenokarsinom (p = 0,84). Histologisk type adenom, rørformede, villøse eller tubulointerstitiell-villøse, ikke forbundet logge MIR-17 uttrykk, men en forening med en alder av mannlige pasienter ble sett (p 0,001). (Tabell 3)
Økt uttrykk av MIR-17 i lav karakter adenom (LGA), høygradig adenom (HGA) og adenokarsinom (AC) i tykktarmen i forhold til normalt vev
uttrykk for MIR-17-92 klase medlemmer
MIR-17 er en av seks modne miRNAs kodet fra polycistronic MIR-17-92 klynge. Derfor ble seks saker fra valideringssettet med subjektivt sterkeste MIR-17 uttrykk valgt for videre ISH analyse om klase medlemmer MIR-18a, MIR-19b, MIR-20a, og MIR-92A. MIR-19b probe ble ansett felles for de to MIR-19-isoformer, som MIR-19a skiller seg fra MIR-19b av bare et enkelt nukleotid gjør 100% diskriminering neppe skje i ISH analysen. Mir-17 probe sekvens er forskjellig fra MIR-20a av tre nucleotide stillinger (S1 Table). Signalene fra Mir-19b, MIR-20a, og MIR-92a var, som MIR-17, begrenset til epitelceller, men uttrykket var svakere enn det man ser for MIR-17 (fig 3A og 3C-3E). En opp-regulering ble observert i overgangssonen fra normal til adenomatøs vev, og den opp-regulert ekspresjon ble opprettholdes i adenokarsinom. En meget svak MIR-18a signal i epitelceller ble sett i fire av seks tilfeller i overgangssonen fra normal til forstadier vev (Fig 3B), mens mer intens ISH signalet ble funnet i noen små, avrundet lymfocytt-lignende celler i stroma av lamina propria
(A) uttrykk for MIR-17.; (B) MIR-18a; (C) MIR-19b; (D) MIR-20a; (E) MIR-92a og (F) krafse sonde i normal (N) og adenomatøs (A) vev. Legg merke til økt fargeintensitet i adenomatøs krypter i forhold til normal krypten.
PTEN uttrykk er ikke relatert til Mir-17 eller MIR-21 uttrykk
Alle saker fra begge studiesett ble farget for PTEN, en validert mål for både MIR-17 og MIR-21 [31,32]. I valideringssett, 21% (5/24) av ACP-posisjoner viste et fullstendig tap av PTEN men bare fokalt innenfor i epitel adenomatøs og /eller invasive områder. Men en invers sammenslutning av PTEN og MIR-17 uttrykk og Mir-21 uttrykk ble ikke observert. Ingen PTEN tap ble sett de ni testtilfeller.
Diskusjoner
I denne studien benyttet vi kliniske, diagnostiske prøver av kolon lesjoner som inneholder NA-AC sekvens for å utforske uttrykk for en rekke mirnas er kjent fra litteraturen [5-7,28] som skal uttrykkes under utvikling av kreft i tykktarmen; MIR-17, MIR-21, MIR-31, MIR-125b, MIR-126, MIR-135b, MIR-145, og MIR-200b. Ansette kromogen ISH, fant vi at uttrykket av MIR-17, MIR-21, og MIR-145 var spesielt dynamisk i de tidlige fasene av tykktarmskreft utvikling. Bildeanalyse av Mir-17 farget lesjoner indikerte at dette miRNA er indusert i tidlig overgangen fra N til LGA og enda mer dramatisk til HGA. Mir-17 uttrykk ble funnet å være av epitelial opprinnelse som også var tilfelle for de andre mirnas i MIR-17-92 klynge. MIR-17 ble funnet å være den mest utbredte miRNA fra MIR-17-92 klynge.
Vår studie er den første som viser at Mir-17
in situ
uttrykk øker tidlig fra normal slimhinnen til LGA og når et platå av uttrykk i HGA som ikke er overdrevet i manifest adenokarsinom. Dette funnet er i samsvar med funn av Bartley
et al
, som rapporterte en lignende MIR-17 uttrykk mønster ved hjelp QRT-PCR [21]. Andre studier har funnet at Mir-17 nivåer fortsatte å stige fra adenom til adenokarsinom [11,33,34], men i motsetning til vår studie og resultatene av Bartley
et al
, gjorde disse studiene ikke sammenligne vev innhentet fra de samme personene, og kan således være assosiert med økt inter-individuell variasjon.
Basert på enkle, morfologisk sammenligning av ISH signal fargeintensitet, vi fant MIR-17 for å være den mest oppregulert klynge medlem i både adenomatøs og kreftvev, etterfulgt av MIR-92a, MIR-20a, MIR-19b, og MIR-18a. Humphreys
et al
, ved hjelp QRT-PCR teknikk, også funnet MIR-17 å være den høyeste uttrykt Mir i Mir-17-92 klyngen i Dukes A og C kolorektal kreft [13], mens QRT-PCR resultater fra andre studier funnet MIR-92a for å være den mest dypt uttrykt miRNA i adenomatøs og /eller kreft kolorektal vev [11,12,33]. Alle disse tre studier har imidlertid bekrefte våre funn at MIR-18a er den minst uttrykt cluster-medlem, og at MIR-19a /b og MIR-20a uttrykk er gjennomgående høyere enn Mir-18a [11-13,33]. Det kan ikke utelukkes at bindings affinitet (smeltetemperaturer) av LNA sonder ansatt kan ha bidratt til de ulike fargeintensitet observert.
Vi fant uttrykk for alle de studerte MIR-17-92 klase medlemmer til å være begrenset til epitelcellene. Lignende funn fra Mir-17 og MIR-92a uttrykk har blitt rapportert av andre forskere [31,33-35], selv om en gruppe også observert noen MIR-17 positive stromale celler [35]. Interessant, observerte vi en intens MIR-18a signal i noen små, avrundet lymfocytt-lignende stromale celler i lamina propria i fire av seks prøver. Men siden ingen andre klynge medlem ble uttrykt, er signalet mest sannsynlig til å representere kryss hybridisering med en annen RNA mål.
Rollen MIR-17 i kolon epitelceller i kreftutvikling er fortsatt uklart. En mulig funksjon kan være hemming av E2F transkripsjonsfaktor 1,
E2F1
, en antatt tumor suppressor genet. Økt uttrykk for E2F1 har vært knyttet til redusert spredning og økt apoptose i tykktarmskreft [36,37]. Interessant nok har en invers sammenheng mellom E2F1 og Mir-17 blitt vist i tykktarm kreft vev [35,38]. Monzo
et al
viste at transfeksjon av anti-MIR-17 resulterte i økt E2F1 uttrykk og redusert celleproliferasjon [35], og Kanaan
et al
viste at transfeksjon av MIR-17 inn HT-29 kolorektal adenokarsinomceller føre til redusert E2F1 uttrykk [39]. I en studie på neuronal avstamning differensiering av frie somatiske stamceller, har en direkte interaksjon mellom MIR-17 og E2F1 blitt dokumentert [40]. Dermed økt uttrykk av MIR-17 i kolon epitelceller kan bidra til tumourogenesis ved å fremme cellevekst. Ytterligere studier er faktisk nødvendig for å vurdere forholdet mellom MIR-17 og E2F1 i tykktarmskreft og vil kreve nøye undersøkelse av deres respektive uttrykk i tilstrekkelige morfologisk karakteristiske regioner stede i slike unike prøver. Studien sett ansatt i denne studien ikke gir mulighet for ytterligere analyse siden representative områder var ikke lenger tilgjengelig i en betydelig del av materialet.
Den antatte onko-Mir, MIR-21, ble i hovedsak funnet i stromale celler som omgir dysplastiske, adenomatøse og kreft epitelceller. Intensiteten av MIR-21 uttrykk økte gjennom N-A-AC sekvens med det høyeste uttrykk sett i kreft-assosiert stroma. Våre resultater bekrefter funnene i Yamamichi
et al product: [26]. Med unntak av ett tilfelle med MIR-21 positiv tumor epitel bare ble en overveiende stromal MIR-21 uttrykk som vises i de resterende 23 + 9 prøver. Tatt i betraktning den lille prøvestørrelsen som brukes i studien ved Yamamichi
et al
så vel som dette gjeldende, kan det ikke utelukkes at tidlig MIR-21 uttrykk kan være en epitelial fenomen. Likevel, store studier på MIR-21 i mer avanserte kolorektal kreft tydelig demonstrere MIR-21 skal lokaliseres i stromal rommet [27,41,42].
Vi har observert at antall MIR-145 positive, pericryptal fibroblast-lignende celler ble redusert gradvis i de NA-AC-sekvensen. Redusert nivå av MIR-145 i tykktarmskreft i forhold til normal kolon, målt ved qPCR, har blitt funnet i en rekke studier, og MIR-145 har lenge vært ansett som en mulig svulst suppressor. Men nylig denne teorien ble utfordret [43]. Ved hjelp av ISH, Chivukula
et al
fant at MIR-145 uttrykkes bare i mesenkymale celler og ikke epitelceller i mus kolon, mens MIR-145 var nesten umulig å oppdage ved QRT-PCR i renset mus og menneske tarmepitelet [ ,,,0],44]. Forfatterne konkluderte med at MIR-145 fungerer som en epitelial tumor suppressor var usannsynlig, og at tidligere resultater fra MIR-145 tapet ble mer sannsynlig relatert til forskjeller i cellulære sammensetning av normal og kreftvev [43,44].
