Abstract
Ultralyd teknologier gjennomsyre det medisinske feltet: som en veletablert avbildningsfunksjonalitet i klinisk diagnostikk; og, med fremveksten av målrettet høy intensitet fokusert ultralyd, som et middel for termisk ablating tumorer. Parallelt potensialet i [ikke-termisk] middels intensitet ultralyd som en minimalt invasiv terapi er også blitt grundig vurdert. Her, induksjon av apoptose i cancerceller er blitt observert, selv om endelig identifikasjon av den underliggende mekanisme har hittil vært unnvikende. En sannsynlig kandidat prosess har vært foreslått å involvere sonokjemisk aktivitet, hvor reaktive oksygenarter (ROS) mediere dannelsen av DNA-enkelttrådbrudd. Her derimot, gir vi overbevisende nye bevis som sterkt støtter en rent mekanisk mekanisme. Videre, ved en kombinasjon av spesifikke analyser (nøytral kometen halen og flekker for γH2AX foci dannelse) demonstrerer vi for første gang at amerikanske eksponering på selv moderat intensitet viser gentoksisk potensiale gjennom sin anlegget for å generere DNA-skader på tvers av flere kreft linjer. Spesielt colocalization analyser markere at ioniserende stråling og ultralyd har distinkt forskjellige signaturer til sine respektive γH2AX foci formasjonsmønster, sannsynligvis gjenspeiler de ulike spenningsfordeling som initierte formasjonsskade. Videre foreslår parallelt immunblotting at DNA-PKCS har fortrinnsrett rolle i reparasjon av ultralyd-indusert skade
Citation. Furusawa Y, Fujiwara Y, Campbell P, Zhao QL, Ogawa R, Ali Hassan M , et al. (2012) DNA Dobbelt Strand Breaks indusert av Kavitasjon Mekaniske effekter av ultralyd i Cancer cellelinjer. PLoS ONE 7 (1): e29012. doi: 10,1371 /journal.pone.0029012
Redaktør: Martin G. Marinus, University of Massachusetts Medical School, USA
mottatt: 26 september 2011; Godkjent: 18 november 2011; Publisert: 03.01.2012
Copyright: © 2012 Furusawa et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Økonomisk støtte for denne studien ble gitt av en Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (22390229), Japan Society for Promotion of Science. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Ultralyd (UL) er uunnværlig i de fleste medisinske felt: (i) USA på svært lav intensitet ( 0,1 MPa akustisk trykk) langt under grensene for poserer termiske og /eller Kavitasjon skadevirkninger brukes til medisinsk diagnose; (Ii) høy intensitet fokusert US (hifu, 10 MPa akustisk trykk) anvendes for termisk ablasjon av tumorer; og (iii) ikke-termisk lav intensitet US (0,1-1,5 MPa akustisk trykk mellom de to ovenfor) som en potensiell kandidat for cancerterapi er for tiden under forskning [1]. Vev utsatt for US energi kan frembringe et spektrum av biologisk respons, hver med distinkte terapeutiske potensialet [1] – [6], inkludert opptak av eksogene molekyler [7] – [14], nekrose og apoptose [1], [3] , [6], [15], [16]. Biofysiske moduser av USA er delt inn i tre klasser, termisk, kavitasjonsslitasje, og ikke-termiske ikke-Kavitasjon effekter. Kavitasjon fører til en rekke mekaniske påkjenninger som for eksempel skjærspenning, sjokkbølgen, høyt trykk, og kjemisk stress på grunn av frie radikaler dannelse, som begge har blitt konkludert til å virke samtidig på alle biologisk materiale [15] – [17]. Samle bevis indikerer at intense USA så vel som lav-intensitet USA unntatt termisk effekt indusere reaktive oksygenforbindelser (ROS) produksjon, membran flyt, DNA enkelttrådbrudd (SSBs) og flere tidligere studier antydet viktigheten av SSBs oppstår fra sonochemically produsert ROS som DNA skade initiere US-indusert celledreping /død [2] – [4], [6], [15]. Imidlertid er dette synet tvilsom, fordi mange SSBs indusert, for eksempel ved mmol /L spekter av H
2o
2 fører til ingen eller svært få dobbel tråd pauser (DSB sin), de cytotoksiske lesjoner av DNA [18]. Til dags dato, men det er ingen direkte bevis på DSB sin induksjon og om påfølgende aktivering av DNA skade respons (DDR) trasé kan oppstå etter eksponering for USA. I klar kontrast, data om cellulær respons for ioniserende stråling (IR), inkludert induksjon av DSB sin og nedstrøms DNA skade respons (DDR) har blitt mer omfattende rapportert [19]. Her tar vi dette punktet evaluere gentoksiske potensialet til lav intensitet USA. I vår studie vurderte vi flere definitive endepunkter assosiert med dannelse og behandling av DNA-skader, blant annet DSB sin, post eksponering til USA med et sett av eksperiment utført parallelt med IR-bestråling sering som positive kontroller.
Resultater og diskusjon
Neutral komet hale analysering (NCTA) ble anvendt for å påvise DNA DSB som forekommer i fire forskjellige leukemilinjer (U937, Molt-4, Jurkat, og HL-60), som var blitt underkastet enten til IR ( 10 Gy, med mindre annet er spesifisert), eller USA (som eksponeringer ved hjelp av intensiteter på 0,3 eller 0,4 W /cm
2 varig 1 minutt). Positive resultater, i form av utvidede komethaler sammenlignet med ikke-bestrålte kontroller, ble observert i alle cellelinjer målt i perioden rett etter eksponering (t = 0) (figur 1A). Kvantitativ sammenligning, i form av den gjennomsnittlige relative kometen hale øyeblikk (RCTM) som oppstår (figur 1B) ga følgende trend over alle cellelinjer: RCTM
0.4US RCTM
IR RCTM
0.3US, som understreker sammenlignbarhet av de respektive amerikanske og IR doser valgt for denne undersøkelsen, i form av sine anlegg for å indusere tilsvarende nivåer av DNA-skader. Interessant men vi la merke til at IR produsert gjennomsnittlig RCTMs hovedsakelig innenfor området 1,1 til 3, mens amerikanske eksponeringer gi opphav til et bredere spekter av resulterende RCTM, fordelingen som var også en funksjon av amerikanske intensitet (figur 1C og Figur S1).
(A) SYBR grønn-farget nøytrale komethaler umiddelbart etter eksponering av U937 (
U
), Jurkat (
J
), Molt-4 (
M
) og HL-60 (
H
) celler til oss (0,3 eller 0,4 W /cm
2) eller IR (10 Gy). (B) Relative hale øyeblikk (
n
= 100 celler, betyr ± SD), normalisert til de respektive ubehandlede kontroller (= 1,0). (C) heterogen fordeling til 3.0, 1.1~3.0 og en (= kontrollnivå) betyr relative hale øyeblikk etter USA, men en jevn fordeling til 1,1 til 3 relative hale øyeblikk etter 10 Gy i ~90% U937 celler (
n
= 100 celler). Se fig. S1 for andre cellelinjer. (D) Green-fluorescentγH2AX bilder i U937, Jurkat, Molt-4 og HL-60-celler 30 minutter etter 0,3 W /cm
2 amerikanske (kontrollcelle bildene ble ikke vist på grunn av ingen γH2AX + celler). (E) induksjon av γH2AX + -celler som en funksjon av US intensitet enn en terskel på 0,1-0,2 W /cm
2 (
n
= 3, middelverdi ± S.D.). (F) γH2AX + cellebilder og (G) FCM-histogrammer av γH2AX + U937-celler 30 min etter 0,3 W /cm
2 og 10 Gy IR. Svart, grønne og røde profiler er for kontroll, USA, og IR, med MFI av γH2AX + celler (5-100 γH2AX logg)). (H) Induksjon /nedgang av γH2AX + U937-celler (FCM) med tiden etter 0,3, 0,4 W /cm
2 (i) og 10 Gy IR (ii). (I) Reduksjon i halen øyeblikk i løpet av 3 timer post- 0,3 W /cm
2 USA (i) eller 10 Gy IR (ii). zVAD-FMK ved 50 umol /L ble brukt til å eliminere apoptotiske DSB sin.
Mens NCTA analyser regnes som DSB sin, tilstedeværelse av distinkte γH2AX foci kan også representere en definitiv signatur for DSB sin [20]. Vi har observert slik γH2AX farging i alle celler eksponert for 10 Gy (figur 1F), og viktigere, i alle cellelinjer som er utsatt for US (figur 1D) over en terskelintensitet på ca 0,1 til 0,2 W /cm
2 (figur 1E og Figur S2, S3), noe som indikerer, for første gang, at amerikanske eksponering kan indusere DSB sin og dermed presentere et konkret gentoksisk risiko.
Post-eksponering observasjon på celler eksponert for IR gunstig sammenlignet med tidligere rapporter [21 ] i den γH2AX + -celler oppviste adskilte brennpunkter fordelt over kjernen (figur 1F), og også den påfølgende tidsmessig profilering av γH2AX + populasjonen oppviste en topp ved 30 minutter etter eksponering, etterfulgt av gradvis forråtnelse (figur S4). Spesielt sistnevnte reduksjonen i totale γH2AX + populasjoner stemte kvalitativt med trendene også observert ved hjelp NCTA (Tall 1H (ii) og 1I (ii)), som støtter reparasjon av IR-indusert DSB sin.
På USA-eksponert ( insonated) celler, den relative andel av γH2AX + var mer uttalt, som bekreftet ved strømningscytometri, hvor γH2AX + nivåer ble omtrent tre ganger høyere sammenlignet med IR-eksponerte celler (figur 1G). Berørte celler også utstilt en pan-atom γH2AX + distribusjon, med sporadisk men tydelig foci lagret (figur 1F). Interessant, toppet den γH2AX + befolkningen på 60 minutter etter eksponering for både 0,3 og 0,4 W /cm
2 tilfeller i USA ansatt, etterfulgt av en restitusjonsperiode som plateaued etter 6 timer (figur 1 H (i) og figur S4).
De åpenbare forskjeller i typiske γH2AX + dekning som oppstår for IR og USAs synlige celler, sammen med sine karakteristiske relative komet hale øyeblikk distribusjoner (figur 1C), og signifikant forskjellige γH2AX + peaking ganger, tyder på at deres respektive DDR signalveier er forskjellige i natur. Videre, i tilfeller hvor US eksponering var påført, anvendelse av de pan-kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK å undertrykke apoptose syntes å ha neglisjerbar effekt (figur 1I (i) og fig S5), mens TRAIL-fremkalt γH2AX (kaspase-medierte γH2AX) for eksempel kan bli avskaffet (figur S5). overbevisende bevis for at den observerte induksjon og post-peak tap av γH2AX i alle tilfeller er sannsynlig assosiert med DNA skade og reparasjon
for å undersøke, foretok vi co- lokalisering flekker av γH2AX med to store kinaser ansvarlige for H2AX fosforylering, ataksi-telangiectasia-mutert (ATM) og DNA-PKCS [22]. Fig. 2A-B viser at mesteparten av fosfor-NBS1 og -ATM foci colocalized til γH2AX foci etter både amerikanske
og Selge IR eksponeringer, noe som tyder på en generell og koordinert rekruttering av NBS1 og ATM til stress-indusert DSB sin [23] , [24]. Den pan-nukleær farging av γH2AX som oppstår bare etter USA eksponering kan oppstå gjennom global ATM aktivisering, kanskje via kromatin remodellering [25] som svar til arten av den amerikanske stress.
(A) colocalization av distinkte NBS1 pS343 foci å tydelig γH2AX foci; (B) colocalization av ATM pS1981 foci å γH2AX foci; (C) DNA-PKCS pT2609 foci i stor grad uavhengig av γH2AX foci. (D) US- og IR-indusert DNA-PKCS pS2056 og γH2AX foci. US indusert peri-kjernefysiske høy fluorescerende DNA-PKCS pS2056 foci (
midt
) eller var pan-atom med diskret foci
(venstre)
, mens både foci etter IR var tydelig og colocalized. Fluorescent bildene ble anskaffet 30 minutter etter 0,3 W /cm
2 USA og 3 Gy IR i U937 celler.
Videre flekker undersøkelser av de to store fosforylering klynger (T2609 og S2056) tilgjengelig for DNA-PKCS (for sluttprosessering av DSB via non-homolog ende bli (NHEJ) [26] – [29]) viste (figur 2C), at DNA-PKCS-pT2609 foci var stort sett uavhengig av γH2AX etter USA og IR eksponeringer , støtter tidligere forslag som NHEJ skjer separat fra homolog rekombinasjon HR [30], [31]. Omvendt, alle IR-eksponerte celler vises diskret, samlokalisert DNA-PKCS-pS2056 /γH2AX + atom foci (figur 2D), også bekrefter tidligere rapporter at DNA-PKCS utfyller H2AX i respons til IR [22]. Interessant, observasjoner på amerikanske indusert γH2AX + populasjoner også utstilt overlappende områder av samlokalisering med DNA-PKCS, men i tillegg, en tydelig signatur av ikke-colocalized peri-kjerne-DNA-PKCS-pS2056 (figur 2D). Dermed kan fortrinnsrett fosforylering av DNA-PKCS-pS2056 megle både NHEJ reparasjon i bulk-atom US-indusert DSB sin, men også signalisere til γH2AX tilstedeværelse rundt atom periferien (se også figur S6). Den mekanisme ved hvilken DNA-PKCS S2056 er fordelt rundt omkretsen av kjernen forblir uklar, men dette lokaliserings mønstre av DNA-PKCS S2056 kan være en av de karakteristiske cellulære responser til US-induserte DSB.
Vi evaluerte ytterligere biokjemiske roller ATM og DNA-PK ved å bruke de respektive farmakologiske kinase hemmere KU55993 (KU) og NU7026 (NU). Immuno-blotter viste at IR utløst en større ATM fosforylering enn gjorde USA (figur 3A), noe som gjenspeiler vår tidligere NCTA observasjon (figur 1A). Spesielt men vi fant at KU, men ikke NU, selektivt reduserte fosfor-ATM nivåer etter USA og IR (figur 3A). Her fosforylering av DNA-PKCS-S2056 (pS2056) var større etter USA enn IR. Som forventet, NU hemmet S2056 fosforylering betydelig, mens KU redusert ATM-avhengige T2609 fosforylering [26], etter USA og IR. Videre KU delvis redusert US-indusert DNA-PKCS-pS2056 i både immuno-blotting og immunofarging (figur 3B, D), noe som tyder på crosstalk mellom ATM og DNA-PKCS-S2056 som svar på amerikanske eksponering.
(A) immunoblotter av U937 celle ekstrakter 30 min etter oss eller IR og effekter av KU og NU om ATM pS1981 og DNA-PKCS pS2056 /pT2609. (B) Større undertrykkelse av US-indusert γH2AX av NU enn KU opp til 6 timer etter oss i U937 celler i WB analyse. (C) Effekter av KU og /eller NU: en større undertrykkelse av US-induserte γH2AX + celler ved NU enn KU, og abrogation av KU-plus-NU i FCM analyse. (
n
= 3, gjennomsnitt ± S.D.). *,
P
0,05; **
P
0,01; ***,
P
0,001. Celler ble behandlet med KU og /eller NU (10 umol /L) i 1 time før og etter eksponering til 0,3 W /cm
2 US (i) eller 10 Gy IR (ii). (D) DNA-PK innledes ATM for γH2AX induksjon av OSS: en fortrinnsrett rolle DNA-PK i γH2AX induksjon ble bestemt ved farging. Celler ble behandlet som fig. 4C. ATM pS1981 (AT), ble DNA-PKCS pS2056 (PK), og γH2AX (H2) positive /negative celler telles minst 100 celler i hvert forsøk. Dataene viser gjennomsnitt fra 2 uavhengige forsøk.
Gitt at USA ser ut til å aktivere DNA-PK fremfor ATM, er det kanskje ikke overraskende at NU var mer effektive i å redusere US-indusert γH2AX protein nivåer enn det som var KU (som illustrert for tilfellet av U937-celler (figur 3B), og i de andre cellelinjene som ble testet (figur S7)) -en observasjon som ble ytterligere styrket av komplementær strømningscytometri målinger (figur 3C og fig S8), som også viste fullstendig inhibering ved bruk av en KU /NU kombinasjon (figur 3C (i)). Slike farmakologiske hemninger ble også bekreftet av immunofarging og gjengitt i alle celler (Figue 3D og Figurer S7, S9). Avhengigheten av DNA-PKCS på USA-indusert H2AX fosforylering ble også bekreftet ved å sammenligne den USA-responsen av DNA-PKCS defekte glioblastoma cellelinjer (M059J) med at av sine foreldrecellelinjer (M059K) (figur S10). Oppsummert disse funnene støtter sterkt en fortrinnsrett rolle for DNA-PKCS over ATM, muligens uten involvering av ATR, tidlig signale fra US-indusert DSB sin til γH2AX, men med direkte motsatt følelse av signalering fra IR-indusert DSB sin (figur 3A, C) som har blitt vist tidligere [22].
til slutt ønsket vi å utforske den fysisk-kjemiske mekanisme i oss induserte bio-effekter ved ytterligere å teste hypotesen om at sonochemistry spiller en dominerende rolle. Her vurderte vi forholdet mellom USA-indusert OH • radikaler og DSB induksjon. Vi fant ut at US-indusert OH • nivåer (DMPO-OH addukter) i aerobic DMPO løsningen økt i en Intensitetsmodulert og eksponeringstids, avhengig måte (figur 4A) hvor induksjons priser av en og to DMPO-OH-addukter per 0.3 og 0,4 W /cm
2 /min, henholdsvis, var en størrelsesorden mindre enn de 30 adduktene per 10 Gy (figur 4A) observert for tilfellet av IR-eksponering. Således, det ekstracellulære OH • nivå etter US var mindre enn 10% av den som forekommer post-IR, selv om sammenlignbare doser ble påført (med hensyn til deres potensiale til å generere DNA-skade (
nemlig
figur 1A). Videre tillegg av de radikale åtseldyr DMSO og NAC på henholdsvis høye eller lave konsentrasjoner til DMPO løsning, enten avskaffet eller delvis redusert US-indusert OH • nivåer (figur 4A, se bildetekst, og metoder for ytterligere detaljer). Deretter fant vi ut intracellulære OH • nivåer umiddelbart etter oss ved å bruke en hydroksyfenyl fluorescein (HPF) analyse [32]. Her var gjennomsnittlig fluorescens intensitet (MFI) fra en forskjøvet flowcytometri histogram var 1,57 ± 0,07 umiddelbart etter eksponering til 0,3 W /cm
2 (figur 4B), således lave nivåer av både ekstra- og intra-cellulær OH • som oppstår i respons til US kan ikke fullt ut forklare den amerikanske induksjon av DSB. Videre har ingen av de radikale scavengers var effektiv i å undertrykke US-indusert γH2AX (Figur 4C). tvert imot, N
2o gass, som er kjent for å undertrykke treghets kavitasjon av US [3], fullstendig opphevet induksjon av DMPO-OH-addukter, γH2AX + celler og celledød (figur 4D-F ). Disse observasjoner tatt i helheten tvinge oss til den konklusjon at USA-mediert mekanisk stress, snarere enn noen sonochemically generert radikal aktivitet genererer genomiske DSB sin.
(A) EPR påvisning av amerikansk eller IR-indusert ekstra- og intracellulære nivåer av OH • som DMPO-OH-addukter (se metoder); Økning av OH • nivåer i DMPO løsning (10 mmol /L) som en funksjon av insonation tid på 0,3 (
venstre
) og 0,4 (
midten
) W /cm
2 USA , eller ved IR dose på 5-20 Gy (
riktig, lukket sirkel
). Induksjon av DMPO-OH addukter med 0,3 eller 0,4 W /cm
2 ble redusert delvis med 50 mmol /L DMSO (
oppover trekant
) eller 5 mmol /L NAC (
nedover trekant
), og opphevet av en 10 ganger høyere konsentrasjoner: 50 mmol /L NAC eller 500 mmol /L DMSO (
stengt diamant
for begge). De innfellinger viser amplitudene av EPJ-signaler av DMPO-OH. (B) FCM-baserte HPF analyse for intracellulære OH • nivåer umiddelbart etter 0,3 W /cm
2 USA i U937 celler. Histogrammet skifte mot high-HPF fluorescens av OH • oksidasjon var liten, og dermed en økning i gjennomsnittlig fluorescens intensitet (MFI) var 1,57 ± 0,07 kaste kontrollen (
n
= 3, gjennomsnitt ± SD), med partiell beskyttelse ved forbehandling med 5 mmol /l NAC i 3 timer før ultralydbehandling. (C) Det beskyttende effekter av 5 mmol /l DMSO eller 5 mmol /l NAC (scavengers) tilsatt til kulturene umiddelbart før 0,3 og 0,4 W /cm
2 US, eller andre 3 h-forbehandling med 5 mmol /l NAC (NAC-pre) mot induksjon av γH2AX + U937 celler 30 min etter oss. (
n
= 3, betyr ± S.D.
ns
hjelp
ikke signifikant
). (D-F) Mettet N
2O gass forårsaket oppheving av US-induserte hendelser som følger: (D) US eksponeringstidsavhengig induksjon av OH • i 10 mmol /l DMPO løsning ved 0,3 og 0,4 W /cm
2 (
n
= 3, gjennomsnitt ± sD). : (E) Induksjon av U937-celler γH2AX + 30 min etter 0,3 og 0,4 W /cm
2 (
n
= 3, middelverdi ± S.D.). : (F) 20% ikke-levedyktige celler (trypan blå fargestoff utelukkelse test) og 30% tap i celleantall i forhold til kontroll U937-celler 6 t etter 0,3 eller 0,4 W /cm
2 US (
n
= 3, gjennomsnitt ± sD).
Her demonstrerer vi for første gang at den mekaniske virkningen av USA med middels nivå intensiteter kan indusere DSB sin, som er annonsert av tilstedeværelsen av nøytral komet hale og γH2AX foci blant et teppe pan-atom γH2AX med peri-kjerne-DNA-PKCS S2056. I tillegg har de foreliggende amerikanske intensiteter på 0,3 og 0,4 W /cm
2, noe som ga opphav til 0,132 og 0,144 MPa peak akustiske trykk, henholdsvis [16], er utenfor det diagnostiske US området ( 0,1 MPa) [1 ] og vi bekreftet at USA på 0,1 W /cm
2 (0,082 MPa) kunne ikke fremkalle DSB sin (fig. 1E). Disse resultatene understreker sikkerheten til diagnostisk USA, spesielt hvis følgende tre punkter blir tatt hensyn til: (i) svært korte pulser (et par mikrosekunder) som brukes i diagnostisering, (ii) stående bølger er lite sannsynlig i
i vivo
eksponeringer, og (iii) den demping av akustiske bølger i det menneskelige legeme. I konklusjonen, håper vi at disse nye og spennende observasjoner vil gi ikke bare en fast biofysiske og biokjemiske grunnlag for å forstå gentoksisk potensial for oss, men også veilede fremtiden oversettelse i form av sikkerhet terskler.
Materialer og metoder
Kjemi og celler
DNA-PK hemmer NU7026 og ATM inhibitor KU55933 ble kjøpt fra Calbiochem (Cambridge, UK). Humane leukemicellelinjer U937, Molt-4, og Jurkat-T ble oppnådd kommersielt (japansk samling av Forsknings Bioressurser (JCRB) Cell Bank [32]. HL-60 ble også oppnådd fra JCRB Cell Bank (IFO50022). Cellene ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum, rekombinant TRAIL /Apo2L var fra Peprotech (London, UK.), et pan-kaspaseinhibitor zVal-Ala-DL-Asp-fluormetyl keton (zVAD-FMK) var fra Peptide Institute (Osaka, Japan);
N
-acetyl-L-cystein (NAC) og propidiumjodid (PI) var fra Wako Pure Chemical (Tokyo, Japan); 4 «, 6-diamino-2-fenylindol (DAPI) og 5,5-demetyl-en-pyrroline-
N
oksid (DMPO) var fra Dojindo (Kumamoto, Japan).
Ultralyd og Bestråling
Low-Intensitetsmodulert pulset USA med 100 Hz fast pulsrepetisjonsfrekvens og 10% driftsfaktor (deretter utpekt som US) ble generert ved hjelp av en 1,0 MHz akustisk oppsett [16], [33]. i insonation eksperimenter, en 2 ml-delmengde til en fast tetthet av 1 × 10
6 celler /ml i en 35-mm polyetylen kultur tallerken (Corning, New York) ble ultralyd på 0,1-0,4 W /cm
2 (tenke-indikert intensiteter) for 1 min. Disse fire intensiteter tilsvarte 0,061, 0,105, 0,132 og 0,144 MPa peak akustiske press, henholdsvis [16]. En økning av middels temperatur under insonation var under en ° C [16]. For IR-behandling, ble cellene bestrålt med 3 Gy (for å fremstille diskrete IRIFs) eller 10 Gy (en nær-isoeffect dose for nøytrale komet haler indusert ved 0,3 og 0,4 W /cm
2) ved en dose på 5 Gy /min ved hjelp av en modell MBR-1520R-tre røntgenenhet (Hitachi Medico Technology, Kashiwa, Japan).
Nøytral kometmetoden
Nøytrale komethaler (DSB sin) ble vurdert i US-eksponerte celler ved hjelp av en komet analysesett og elektroforese enhet (Trevigen) i henhold til fremstilling instruksjon. Minst 50 celler per prøvene ble analysert ved hjelp av en Comet Assay IV programvare (Leica Microsystems). Den relative halen øyeblikk ble gitt av forholdet mellom komet hale øyeblikk (gjennomsnitt ± SD) av behandlede celler til de av kontroller (ratio = 1,0).
immundeteksjon
For Immunofluorescent bilder, paraformaldehyde- fast kontroll og behandlede celler ble permeabilisert /blokkert med 2% BSA /0,05% Triton X-100 /Tris-bufret saltvann, og immunofarget i 2 timer med primært monoklonalt antistoff (mAb): anti-fosfo-H2AX S139 (γH2AX, Milipore) , 1:400 eller anti-ATM pS1981, 1:250 (Upstate Bioteknologi) eller primær polyklonale antistoff (pAB), anti-fosfor-H2AX S139 (γH2AX, Aktiv Motif), 1:500, anti-NBS1 pS343, 1:1000 (Novus Biologicals), eller anti-DNA-PKCS pT2609 eller pS2056, 1:250 eller 1:600 (Abcam), henholdsvis. Deretter ble cellene farget i 1,5 timer med det sekundære antistoff: Alexa Fluor 488 anti-mus F (ab «) IgG eller Alexa Fluor 555 anti-kanin F (ab») IgG (Cell Signaling Technology), 1:400. Til slutt ble kjernene motfarget med 2 ug /ml DAPI, og prøvene ble montert i Antifade ™ (Molecular Probes). Fluorescent bildene ble anskaffet ved hjelp av en BX-50 fluorescens mikroskopi (Olympus optikk).
For flow-cytometri (FCM), celler ble fiksert med 70% kald metanol over natten, deretter blokkert med 2% BSA /0,05% Triton X-100 /Tris-bufret saltvann og omsatt med γH2AX mAb /Alexa Fluor 488 anti-mus IgG (1:400) for å farge γH2AX + celler, etterfulgt av inkubasjon med 1 mg /ml RNase A og 50 ug /ml PI for fordeling γH2AX + celler til hver av PI-baserte cellesyklusfaser. Prøvene ble til slutt kjørt på en Epics XL flowcytometer (Beckman Coulter).
For immunoblot analyse, ble hel-celle ekstrakter utarbeidet i RIPA lysebuffer som inneholder natrium orthovanadate og cocktail av proteasehemmere (Nacalai Tesque). Høymolekylære molekyler av ATM og DNA-PKCS ble separert i 5% ferdigstøpte SDS-PAGE-geler, mens andre lavmolekylære proteiner ble separert i 15% ferdigstøpte SDS-PAGE-geler. Etter overføringen proteiner på Immobilon-P membraner (Millipore) var western-strøket ved hjelp av primære antistoffer: γH2AX mAb, ATM PAB (Santacruz), ATM pS1981 mAb (Epitomics), DNA-PKCS Pab (Epitomics), DNA-PKCS pS2056 pAb, DNA-PKCS pT2609 mAb, caspase 3 pab (Cell signalering) eller GAPDH mAb (lasting referanse, Organon Teknika), og de sekundære HRP-konjugert anti-mus eller anti-kanin IgG (cellesignalisering). Protein uttrykk nivåer ble visualisert ved en forbedret chemiluminescence (ECL) deteksjon system (Nacalai Tesque), og bildene ble kjøpt opp av en LAS-4000 lysende bilde analysator (Fuji Film).
Påvisning av ekstra- og intracellulært ROS
nivåene av amerikansk eller IR-indusert OH • i ekstracellulære væsker ble kvantifisert ved elektronparamagnetisk resonans (EPR) spin-fangst metoden [3], [16]. For disse ble 2 ml alikvoter av 10 mM DMPO fordelt i 35-mm skåler og eksponert for 0,3 og 0,4 W /cm
2 i 1 til 5 minutter eller til graderte IR doser (5-20 Gy), etterfulgt av umiddelbar påvisning av DMPO-OH adduktpartiklene signaler ved hjelp av en RFR-30 EPR spektrometer (Radical Research). DMPO-OH-addukter (OH •) ble uttrykt som relative mengdene til en intern referanse (Mn
2 +). For å oppdage intracellulær OH •, celle-gjennomtrengelig hydroksyfenyl fluorescein (HPF) (Sekisui Medical) ble brukt, som oppdager hovedsakelig OH • og marginalt ONOO
– (~ 1/10 OH • beløp) [31]. Celler ble ladet med 5 nM HPF i 15 minutter ved 37 ° C, og eksponert til 0,3 W /cm
2, etterfulgt av umiddelbar FCM-analyse av US-indusert intracellulær OH •. Gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) av den oksyderte proben ble kvantifisert for å vurdere sin gangers økning i forhold til kontrollen.
statistikker og
Resultatene ble angitt som middelverdier ± S.D. Statistisk signifikans mellom to datasett ble analysert ved hjelp av uparet Student
t
-test med Microsoft Excel 2007.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Analyse for nøytrale komet haler i Jurkat, Molt-4 og HL-60 celler umiddelbart etter 0,4 W /cm
2 USA avslørte ujevn bredere distribusjon av 25-30, 35-50% og 10-23% celler til områder av 3, 1.1-3 og 1 relative hale øyeblikk, henholdsvis i forhold til en ganske jevn fordeling av 80-90% tilslutning celler til et mindre utvalg av 1.1-3 relative øyeblikk etter 10 Gy IR. Relativ hale øyeblikk på 1,0 representerer ingen indusert DSB som i kontrollcellene. Etter 0,3 W /cm
2, på samme måte, 10-25, 30-40% og -50% celler påløper 3, 1,1 til 3 og 1 (ingen DSB sin) relative hale øyeblikk, henholdsvis. Disse resultatene rekapitulere funnene i U937 celler (fig 1A, C.)
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0029012.s001 product: (PDF)
Figur S2.
fluorescens bilder viste pan-atom γH2AX mønster 30 minutter etter 0,4 W /cm
2 amerikanske, men ingen γH2AX + celler etter 0,1 W /cm
2 i U937 celler. Celler med 10 Gy av IR ble brukt som positiv kontroll for γH2AX farging
doi:. 10,1371 /journal.pone.0029012.s002 product: (PDF)
Figur S3.
fluorescens bilder av γH2AX i U937, Jurkat, Molt-4 og HL-60 celler uten amerikansk eller IR-eksponering. Kvantifiserte data er vist i fig. 1E
doi:. 10,1371 /journal.pone.0029012.s003 product: (PDF)
Figur S4.
Representant FCM histogrammer viste induksjon og nedgangen av γH2AX + U937 celler med tiden opp til seks timer etter 0,3 eller 0,4 W /cm
2 (1 min) USA eller 10 Gy IR. Time-kursendringer i γH2AX + celler etter USA eller IR (Fig. 1 h) kom fra middel fluorescens av histogrammene (skygget). Merk maksimale γH2AX + fraksjoner 0.5 eller 1 time, etterfulgt av deres synker senere, med noen vedvarende γH2AX + fraksjoner rundt seks timer etter stresset
doi:. 10,1371 /journal.pone.0029012.s004 product: (PDF)
Figur S5.
Ulike H2AX svar til USA og død-ligand TRAIL i U937, Jurkat, Molt-4, og HL-60-celler. (A) tidsavhengig økning i γH2AX protein ekspresjon og p17 /P19 aktive former av spaltet caspase-3, en vesentlig apoptotisk markør, etter tilsetning av 0,1 mg /ml TRAIL. (B) zVAD undertrykkende caspase-3 cleavage i U937, Jurkat, Motl-4 og HL-60 celler: hemming av caspase-3 spalting ved behandling med zVAD-FMK i 6 timer etter 0,3 W /cm
2 US ( øvre) eller tre timer etter TRAIL (nederst). Z-VAD FMK ble forbehandlet 1 time før TRAIL treate. (C) TRAIL-indusert, apoptotisk DSB-drevet γH2AX + celler, men ikke DSB-drevet γH2AX + celler tidlig 30 minutter etter 0,3 W /cm
2 USA ble opphevet ved behandling av alle cellelinjer med 100 mikromol /L zVAD-FMK . Blå DAPI fargen ble endret til rødt for enkel gul visualisering i sammenslåingen med grønn γH2AX bilde ved hjelp av Adobe Photoshop Elements 2.0. (Adobe Systems)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0029012.s005 product: (PDF)
Figur S6.
Immunofluorescensanalyse analyser av US- og IR-indusert DNA-PKCS pS2056 og γH2AX foci. Pan-atom grønn γH2AX foci og sterkt rød-fluorescerende DNA-PKCS pS2056 foci etter USA, men lav-fluorescerende tydelig γH2AX og DNA-PKCS pS2056 foci etter IR. Røde piler indikert celler med peri-nukleære DNA-PKCS pS2056 foci observert i ultralydbehandlede celler, men ikke i bestrålte celler. Forstørret bilde var i fig. 2D
doi:. 10,1371 /journal.pone.0029012.s006 product: (PDF)
Figur S7.
Western blot-analyser som viser effekten av Ku55933 (KU) og /eller Nu7026 (NU) på γH2AX 1 t etter USA i Jurkat, Molt-4, og HL-60-celler. Cellene ble forbehandlet med 10 mmol /L av KU og /eller NU en time før US
doi:. 10,1371 /journal.pone.0029012.s007 product: (PDF)
Figur S8.
Typiske FCM histogrammer som viser US-indusert γH2AX i nærvær eller fravær av Ku55933 (KU) og /eller Nu7026 (NU). Fordelinger av cellesyklus-fase ble bestemt ved farging med propidiumjodid. Legg merke til at US-indusert γH2AX ikke var begrenset i S-fasen og undertrykkende effekter av KU og /eller NU på γH2AX ble identifisert gjennom cellesyklusfaser
doi:. 10,1371 /journal.pone.0029012.s008 plakater (PDF )
Figur S9.
Typiske bilder som viser amerikanske utløst γH2AX, fosfor-ATM på S1981, fosfor-DNA-PKCS på S2056 i nærvær eller fravær av Ku55933 (KU) og /eller Nu7026 (NU). Effekten av KU eller NU på ekspresjon av disse proteiner ble kvantifisert som i fig. 4D
doi:. 10,1371 /journal.pone.0029012.s009 product: (PDF)
Figur S10.
Typiske FCM histogrammet viser oss utløst γH2AX i DNA-PKCS dyktig M059K celler, men ikke i DNA-PKCS mangel M059J celler. Disse adherente cellelinjer ble resuspendert ved trypsinisering og deretter sonikert ved 0,4 W /cm
2 i 60 sek i kulturmedium. Celler ble oppsamlet i plastrørene umiddelbart etter ultralydbehandling og deretter inkubert i 30 minutter fulgt av fiksering.
