Abstract
Amygdalin, en naturlig forbindelse, har blitt brukt av mange kreftpasienter som en alternativ tilnærming til behandling av sin sykdom. Men hvorvidt dette stoffet utøver virkelig en anti-tumor effekt har aldri blitt avgjort. En in vitro-undersøkelse ble igangsatt for å undersøke innflytelsen av Amygdalin (1,25 til 10 mg /ml) på veksten av et panel av blærecancercellelinjer (UMUC-3, RT112 og TCCSUP). Tumor vekst, proliferasjon, klonal vekst og cellesyklusutvikling ble undersøkt. Cellesyklusregulerende proteiner som CDK1, CDK2, CDK4, cyklin A, cyclin B, cyklin D1, p19, p27, så vel som pattedyr-målet for rapamycin (mTOR) relatert signaler phosphoAkt, phosphoRaptor og phosphoRictor ble undersøkt. Amygdalin doseavhengig redusert vekst og spredning i alle tre blærekreft cellelinjer, gjenspeiles i en betydelig forsinkelse i cellecyklusprogresjonen og G0 /G1 arrest. Molecular vurdering viste redusert phosphoAkt, phosphoRictor og tap av CDK og cyclin komponenter. Siden de mest fremragende effekten av amygdalin ble observert på cdk2-cyclin A aksen, siRNA slå ned studiene ble utført, avslører en positiv korrelasjon mellom cdk2 /cyclin A uttrykk nivå og tumorvekst. Amygdalin, derfor kan blokkere tumorvekst ved ned moduler CDK2 og cyclin A. In vivo undersøkelser må følge for å vurdere amygdalin er praktisk verdi som et anti-tumor medikament
Citation. Makarević J, Rutz J, Juengel E , Kaulfuss S, Reiter M, Tsaur jeg, et al. (2014) amygdalin Blocks Blære kreft celle vekst
In Vitro
av Avtagende cyclin A og CDK2. PLoS ONE 9 (8): e105590. doi: 10,1371 /journal.pone.0105590
Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina
mottatt: 22 april 2014; Godkjent: 23 juli 2014; Publisert: 19 august 2014
Copyright: © 2014 Makarevic et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av «Brigitta und Norbert Muth Stiftung» (https://www.muth-stiftung.de) og «Freunde und Förderer der Goethe -Universität Frankfurt «(https://www2.uni-frankfurt.de). Bevilgningen ble mottatt av RAB. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blære kreft~~POS=HEADCOMP er den nest vanligste kreftformen av urogenitalsystem i vestlige land, med en insidens på 37,9 /100 000 per år for menn og 9,6 /100 000 per år for kvinner [1]. Omtrent 70% av opprinnelig diagnostisert svulster er overfladisk og kan behandles ved transuretral reseksjon, hvorved blæren er bevart. De resterende 30% av tumorene blir muskel invasiv og er forbundet med høy risiko for metastase [2]. For pasienter med lokalavansert eller metastatisk sykdom, er kjemoterapi et behandlingsalternativ. Men prognosen for pasienter med metastaser er fortsatt dårlig, med en median overlevelse på 14 måneder og en 5-års overlevelse på 15% [3].
Mer enn 50% av kreftpasienter i Europa bruker komplementær /alternativ medisin (CAM) i stedet for, eller i kombinasjon med konvensjonell terapi [4]. Misnøye med konvensjonell behandling og reduksjon av kjemoterapeutiske bivirkninger er de mest vanlige årsakene gitt for anvendelse av CAM [5], [6]. Men selv om CAM bruk er populær blant kreftpasienter, er evidensbasert nytte av naturlig baserte forbindelser mangler. Avviket mellom bruk av et naturlig produkt og kunnskap om sin anti-tumor egenskaper er særlig reflektert i tilfelle av amygdalin. Amygdalin (D-Mandelonitrilet-β-gentiobioside) er en cyanogenic diglucoside stede i dypet av mange frukter og i mange planter som tilhører Rosaceae familien som Prunus persica (fersken), Prunus armeniaca (aprikos) og Prunus Amygdalus Amara (bitter mandel ). Begrepet «Laetrile» brukes ofte som et synonym for amygdalin. Imidlertid er laetrile strukturelt forskjellig fra moderforbindelsen, amygdalin, og er et akronym (venstredreiende og Mandelonitrilet) for et renset, semi-syntetisk form av amygdalin. Denne undersøkelsen benytter «amygdalin».
Amygdalin var en av de mest populære, ikke-konvensjonelle, anti-kreft behandlinger i 1970. Ved 1978 hadde 70.000 amerikanske kreftpasienter brukes amygdalin å behandle sine kreft [7]. Likevel, evidensbasert forskning på amygdalin er sparsom og sin fordel kontroversielt. Talsmenn vurdere amygdalin en naturlig kreft kur, mens motstandere advarer om at amygdalin er ineffektiv og selv giftig. Selv om det har blitt hevdet at amygdalin er usikre, har oppstått noen alvorlige akutt giftighet. Det har også blitt konkludert med at amygdalin ikke har noen anti-tumor potensial, selv om fra 368 kreftpasienter som er oppført i en gjennomgang, 12,5% oppnådde en komplett eller partiell respons, 6,8% hadde stabil sykdom og 22,9% viste symptomatisk utbytte av amygdalin [8]. For å få innsikt i hvordan amygdalin kan fungere, ble en in vitro iverksatt etterforskning for å fastslå dens innflytelse på blærekreft vekst og spredning. I tillegg ble cellesyklusprogresjon og cellesyklusregulerende proteiner evaluert i amygdalin behandlede og ikke-behandlede celler. siRNA knock down-studier ble utført for å utforske proteiner endret ved amygdalin, som kan ha klinisk relevans.
in vitro-data som er presentert her vise til betydelig vekst og proliferasjon blokkerende effekter av amygdalin, sannsynligvis forårsaket av en nedgang i cellesyklus regulerende proteiner cdk2 og cyclin A.
Materialer og metoder
Cell kultur
RT112, UMUC-3 (ATCC /LGC Promochem GmbH, Wesel, Tyskland) og TCCSUP (DSMZ, Braunschweig, Tyskland) blære karsinom-celler ble dyrket og subdyrket i RPMI 1640, 10% føtalt kalveserum (FCS), 20 mM HEPES-buffer, 1% Glutamax, 1% penicillin /streptomycin (alt: Gibco /Invitrogen, Karlsruhe , Tyskland). RT112 er en invasiv (patologisk stadium T2) moderat differensiert (grad 2/3) modell av menneskelig blærekreft, mens TCCSUP er en overgangsordning celle carcinoma, klasse 4. UMUC-3 representerer en høy grad 3, invasiv blærekreft. Subkulturer fra passasjer 7-24 ble brukt.
Amygdalin behandling
Amygdalin fra aprikoskjerner (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Tyskland) ble nylig oppløst i cellekulturmedium og lagt til kreftceller i konsentrasjoner som strekker seg 1,25 til 10 mg /ml. Kontroller forble ubehandlet. I alle forsøkene ble behandlet tumorcellekulturer sammenlignet med ikke-behandlede kulturer. For å vurdere toksiske effekter av amygdalin, ble cellelevedyktigheten bestemmes ved trypanblått (Gibco /Invitrogen). For apoptose evaluering uttrykk for Annexin V /propidiumjodid (PI) ble bestemt ved hjelp av Annexin V-FITC apoptose Detection kit (BD Pharmingen, Heidelberg, Tyskland). Tumorcellene ble vasket to ganger med PBS, og deretter inkubert med 5 ul av Annexin V-FITC og 5 ul av PI i mørke i 15 min ved RT. Cellene ble analysert på en FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland). Prosentandelen av apoptotiske celler (tidlig og sent) i hver kvadrant ble beregnet ved hjelp Cellquest programvare (BD Biosciences).
Måling av tumorcellevekst og spredning
Cellevekst ble vurdert ved hjelp av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) reduksjon fargestoff analyse (Roche Diagnostics, Penzberg, Tyskland). Tumorceller (100 ul, 1 x 10
4 celler /ml) ble sådd ut på 96-brønners vevskulturplater. Etter 24, 48 og 72 timer ble MTT (0,5 mg /ml) tilsatt i ytterligere 4 timer. Deretter ble cellene lysert i en buffer inneholdende 10% SDS i 0,01 M HCl. Platene ble så inkubert over natten ved 37 ° C, 5% CO
2. Absorbans ved 570 nm ble målt for hver brønn ved anvendelse av en mikroplate ELISA-leser. Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer. Etter at bakgrunnen er trukket fra absorbansen, ble resultatene uttrykt som middel-cellenummer.
Celleproliferasjon ble målt ved anvendelse av en BrdU celleproliferasjon enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (Calbiochem /Merck Biosciences, Darmstadt, Tyskland). Tumorceller, sådd ut på 96-brønners mikrotiterplater, inkubert med 20 ul BrdU-merking løsning per brønn i 8 timer, fiksert og påvist ved å bruke anti-BrdU mAb i henhold til produsentens instruksjoner. Absorbans ble målt ved 450 nm.
klonogene assay
Tumorceller, forbehandlet med amygdalin i 2 uker, ble overført til 6-brønners plater på 300 celler per brønn. Etter 10 dagers inkubering, hvorunder cellene enten ble utsatt for amygdalin eller ikke, ble kolonier fiksert og telles. Kolonier av minst 50 celler ble regnet som en.
Cell syklus analyse
Cellesyklus analyse ble utført med subsammenflytende tumorceller. Tumorcellepopulasjoner ble farget med propidiumjodid, ved hjelp av en syklus TEST pluss DNA Reagent Kit (BD Pharmingen) og deretter underkastet flowcytometri med et FACScan strømningscytometer (Becton Dickinson). 10.000 hendelser ble samlet for hver prøve. Datainnsamlingen ble gjennomført ved hjelp av Cell-Quest programvare og cellesyklusfordeling ble beregnet ved hjelp av ModFit programvare (BD Biosciences). Antallet gated celler i G1, G2 /M eller S-fase presentert som%.
Western blotting
For å undersøke proteiner involvert i cellevekst regulering, tumorcellelysatene ble brukt til en 7% polyakrylamid-gel og underkastet elektroforese i 90 minutter ved 100 V. proteinet ble deretter overført til nitrocellulosemembraner. Etter blokkering med ikke-fettholdig tørrmelk i 1 time, ble membranene inkubert over natten med monoklonale antistoffer rettet mot cellesyklusproteiner: Cdk1 (IgG1, klone 1), cdk2 (IgG2a, klone 55), cdk4 (lgG1, klone 97), cyklin A (IgG1, klon 25), cyklin B (IgG1, klon 18), cyklin D1 (IgG1, klon G124-326), p19 (IgG1, klon 52 /p19), p27 (IgG1, klon 57, alle: BD Pharmingen ). Den mammalian target of rapamycin (mTOR) veien ble undersøkt ved hjelp av følgende monoklonale antistoffer: anti fosfor Rictor (pRictor, IgG, Thr1135, klone D30A3), anti fosfor Raptor (pRaptor, IgG, Ser792, begge: New England Biolabs, Frankfurt, Tyskland), anti fosfor Akt (Pakt; IgG1, Ser472 /Ser473, klone 104A282, BD Pharmingen). Epigenetisk module ble undersøkt av anti acetylert H3 (ZH3, IgG, Lys9, klone C5B11) og anti acetylert H4 (AH4; Lys8, polyklonale, IgG, begge: New England Biolabs).
HRP-konjugert geit-anti -mouse IgG (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA; fortynning 1:5.000) fungerte som det sekundære antistoff. Membranene ble inkubert med kort ECL deteksjonsreagensen (ECLTM, Amersham /GE Healthcare, München, Tyskland) for å visualisere proteiner og deretter analysert ved den Fusion FX7 systemet (Peqlab, Erlangen, Tyskland). β-aktin (1:1000, Sigma, Taufenkirchen, Tyskland). fungert som den interne kontrollen
Gimp 2.8 programmet ble brukt til å utføre pikseltetthet analyse av proteinbåndene. Forhold av intensiteten av hvert undersøkt protein /intensitet av β-aktin ble beregnet, og intensitetsverdier ble deretter uttrykt i prosent, er relatert til kontrollene er angitt som 100%.
Cdk2 og cyklin A slå ned
Kreftceller celler~~POS=HEADCOMP (3 × 10
5/6-brønn) ble transfektert med små interfererende RNA (siRNA) rettet mot cdk2 (genet ID: 1017, målsekvens: AGGTGGTGGCGCTTAAGAAAA) eller cyclin A (gen-ID: 890, målsekvens : GCCAGCTGTCAGGATAATAAA; Qiagen, Hilden, Tyskland), med en siRNA /transfeksjon reagens (HiPerFect transfeksjon reagens; Qiagen) forhold på 01:06. Ikke-behandlede celler og celler behandlet med 5nM kontroll siRNA (All stars negativ kontroll siRNA; Qiagen) fungerte som kontroller. Deretter ble tumorcellevekst analysert som angitt ovenfor.
statistikker
Alle forsøkene ble utført 3-6 ganger. Statistisk signifikans ble evaluert ved den ikke-parametrisk Wilcoxon-Mann-Whitney-U-test for eksperimentene gjentatt 6 ganger. Forsøk utført 3 ganger, ble statistisk vurdert ved den parametriske t-test. Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant på ap verdi mindre enn 0,05.
Resultater
Dose-responsanalyse
utsette kreftceller for å amygdalin (enkeltdose søknad) førte til en konsentrasjon -avhengig reduksjon i tumorcellen nummer, med den mest fremtredende virkning tydelig i TCCSUP cellelinje (fig. 1, 24 h søknad). Ingen tegn på toksisitet ble vist ved hjelp av trypanblått-utelukkelse test. Siden den sterkeste celle reduksjon ble observert med 10 mg /ml amygdalin, ble denne konsentrasjonen anvendt for alle etter gransking. Langtidsbehandling bestående av 10 mg /ml amygdalin tilsatt til tumorceller tre ganger i uken i løpet av en periode på 2 uker, viste at cellevekst ble redusert i en lignende grad som den som oppstår med den kortvarige behandlingsprotokoll (fig. 1, 2 uker søknad).
Controls forble ubehandlet. Ned: Tumor cellevekst etter 2 ukers behandling med 10 mg /ml amygdalin. Hvert forsøk ble utført i triplikat og gjentatt 5 ganger. Data fra en representant eksperimentet er vist. * Indikerer signifikant forskjell med kontroller (p = 0,0022).
Controls forble ubehandlet. Den øvre høyre kvadrant viser prosentandelen av celler i slutten av apoptose, den nedre høyre kvadrant prosentandelen av celler i tidlig apoptose (en representant fra 3 tester, SD
intra-assay 10%).
apoptose
Kortvarig varig~~POS=HEADCOMP bruk av amygdalin i 24 timer ikke indusere apoptose (data ikke vist). Imidlertid er prosentandelen av tumorceller som gjennomgår apoptose tidlig omtrent fordoblet etter to uker amygdalin eksponering i alle tre cellelinjer: p = 0,0026 (UMUC-3), p = 0,0145 (TCCSUP) og p = 0,0208 (RT112). I tillegg er en dobling i slutten av apoptose skjedde i UMUC-tre cellelinje (fig 2;. P = 0,0230)
Tumor celleproliferasjon og klonal cellevekst
spredning i alle tre cellelinjer. ble signifikant redusert, enten amygdalin ble påtrykt i 24 timer eller 2 uker (figur 3, venstre). Etter 2 uker amygdalin eksponering for subsammenflytende celler, ble klonal vekst så evaluert, hvorved amygdalin ble enten tilsatt i en etterfølgende periode på 10 dager ( «amygdalin B») eller ikke ( «amygdalin A»). Antallet RT112 kloner ble betydelig redusert med 10 dagers amygdalin eksponering under klonal formasjon, og ingen TCCSUP kloner var tilsynelatende (fig. 3, høyre). Når amygdalin ikke ble tilført i løpet av klonal dannelse, ble antallet RT112 og TCCSUP kloner også redusert, men ikke så sterkt som ble sett i «amygdalin B» diett (fig. 3, til høyre). Den UMUC-tre cellelinje ikke danner kolonier, og ble derfor ikke evaluert
Høyre. Klonogene vekst TCCSUP og RT112 celler (senere til to ukers Subkonfluente kultur med 10 mg /ml amygdalin) uten (kontroll ) og med amygdalin. Amygdalin A = 10 dagers amygdalin gratis inkubasjon under klonogene vekst. Amygdalin B = 10 dagers klonogene vekst med 10 mg /ml amygdalin. Forsøk ble utført i triplikat og gjentatt 5 ganger. * Indikerer signifikant forskjell med kontroller (p = 0,0022).
#indicates betydelig forskjell amygdalin A (p = 0,0022).
cellesyklusprogresjon
Amygdalin modulerte cellesyklusutvikling, avhengig av tumorcellelinjen (fig. 4 ). Korttids amygdalin anvendelse (24 h) for å UMUC-3 økte antall G0 /G1-celler (p = 0,0169) og redusert antall S-faseceller (p = 0,0138). I TCCSUP-celler kortvarig behandling økte antall G0 /G1-faseceller (p = 0,0121), men redusert antall celler i G2 /M-fase (p = 0,0406). I RT112 celler forårsaket kortvarig eksponering amygdalin G2 /M-fase reduksjon (p = 0,0039), og et S-fase økning (p = 0,0040). To uker amygdalin eksponering senket G2 /M-fase (p
UMUC-3 = 0,0036, p
TCCSUP = 0,0080; p
RT112 = 0,0015) og økte G0 /G1-fasen i alt tumorcelle linjer (p
UMUC-3 = 0,0019, p
TCCSUP = 0,0143, p
RT112 = 0,0018). Antallet av S-faseceller ble også signifikant redusert etter to ukers behandling i UMUC-3 (p = 0,0093) og RT112 celler (p = 0,0032), sammenlignet med kontroller.
cellepopulasjon er uttrykt som prosent av de totale celler analysert. Ett representativt forsøk av tre er vist.
Cell syklusregulerende protein ekspresjon
Siden amygdalin påvirket celleveksten og cellesyklusprogresjon, kan modifikasjoner av cellesyklusen kontrollerende proteiner forventes. Ekspresjonen av CDK1 og cdk2 (alle cellelinjer) og cdk4 (TCCSUP, RT112) ble redusert 24 timer etter påføring Amygdalin (fig. 5). P-verdiene var som følger for CDK1 (p
UMUC-3 = 0,0029, p
TCCSUP = 0,0052, p
RT112 = 0,0007), for cdk2 (p
UMUC-3 = 0,0001, p
TCCSUP = 0,0006, p
RT112 = 0,0001), for cdk4 (p
TCCSUP = 0,0006, p
RT112 = 0,0001), for cyclin A (p
UMUC-3 = 0,0001, p
TCCSUP = 0,0001, p
RT112 = 0,0002), for cyclin B (p
TCCSUP = 0,001, p
RT112 = 0,0001) og for cyclin D1 (p
UMUC-3 = 0,0001, p
TCCSUP = 0,0001, p
RT112 = 0,0001). p19 ble forbedret i UMUC-3 (p = 0,0013) og RT112 (p = 0,0012), men redusert i TCCSUP (p = 0,0001), mens p27 ble redusert i alle cellelinjer (p
UMUC-3 = 0,0013, p
TCCSUP = 0,0001, p
RT112 = 0,0001). pakt samt pRictor (men ikke pRaptor), fra mTOR-reaksjonsveien, ble deaktivert i alle tre cellelinjer. P-verdiene var som følger for Pakt (p
UMUC-3 = 0,0002, p
TCCSUP = 0,0004, p
RT112 = 0,0082) og for pRictor (p
UMUC-3 = 0,0015, p
TCCSUP = 0,0017, p
RT112 = 0,0001). pRaptor ble bare redusert i TCCSUP (p = 0,0024).
Kreftceller ble forbehandlet med amygdalin i 24 timer eller 2 uker (kontroller forble ubehandlet). p-aktin fungerte som den interne kontrollen. En representant fra tre separate forsøk er vist. høyre panel av figur 5 viser pikseltetthet verdier gitt i prosent er relatert til kontrollene ikke er behandlet med amygdalin. * Indikerer signifikant forskjell til kontrollen.
Små forskjeller var tydelig etter 2 uker i motsetning til 24-timers amygdalin eksponering. Cdk1 men ikke cdk2 ble nedregulert i UMUC-3 (p = 0,0001). Den 24 h avtagende påvirkning av amygdalin på p27-ekspresjon i UMUC-3 og TCCSUP-celler ble brutt etter 2 uker, og pRaptor øket etter 2 uker i TCCSUP celler (p = 0,0019), i motsetning til den 24 h minskende virkning (fig. 5 ).
Cdk2 /cyklin A knockdown
Siden amygdalin sterkt modifisert CDK2 og cyklin A i alle tumorcellelinjer, og disse proteinene regulere inntreden i den mitotiske syklus, rollen til disse proteinene i tumorvekst ble evaluert ved siRNA knock-down. Inkubasjon av UMUC-3, RT112 og TCCSUP celler med siRNA mot cdk2 og syklin A tydelig redusert proteininnhold (fig. 6, nederst til høyre) og ble fulgt av en betydelig vekst blokkade i alle tre cellelinjer (fig. 6).
UMUC-3, TCCSUP og RT112 celler ble transfektert med cdk2 eller cyclin A siRNA og slå ned ble kontrollert av western blot (nederst til høyre). En representant fra 6 forsøk er vist. * Indikerer signifikant forskjell med kontroller (p = 0,0022).
Diskusjoner
Bevis presentert her viser at amygdalin undertrykker vekst og spredning i tre blære kreft cellelinjer. Antallet tumor celler som gjennomgår apoptose tidlig økte etter langvarig eksponering amygdalin, men ikke etter kortvarig eksponering og denne hemming av proliferativ aktivitet ikke ble forårsaket av en toksisk effekt av amygdalin. Andre forskere har også vist tegn til apoptotosis indusert av amygdalin. Rask aktivering av kaspase-3 sammen med nedregulering av Bcl-2 og oppregulering av Bax i nærvær av 0,1 mg /ml amygdalin er vist i DU145 og LnCap prostatakreftceller [9]. Apoptotisk celledød har også blitt fremkalt av amygdalin i livmorhalskreft cellelinjen HeLa [10] og i human promyelocytisk leukemi (HL-60) celler [11]. Til sammen disse rapportene tyder på at amygdalin kan forklare apoptotiske hendelser i ulike kreftceller, inkludert de fra blæren, og bidra til redusert tumorvekst.
Amygdalin sterkt endret cellesyklusprogresjon i alle tre blærekreftcellelinjer. Under kortvarig behandling, UMUC-3 og TCCSUP akkumulert i G0 /G1, mens RT112 ble arrestert i S-fasen. Mitose påvirkes derfor på en annen måte i forskjellige cellelinjer ved amygdalin. En annen forskjell var at p19 økte i RT112 men redusert i TCCSUP. Rictor ble deaktivert og cdk4 ble undertrykt i RT112, men ikke i UMUC-3. Cdk4 inhibisjon og p19 økningen har nylig blitt vist å drive tumorceller inn i S-fasen [12]. Siden både Cdk4 hemning og p19, i kombinasjon, bare forekom i RT112 cellene, kan dette forklare hvorfor RT112 akkumulert i S-fase, i stedet for i G0 /G1 fase. Faktisk cdk4 ble ikke redusert etter 2 uker amygdalin søknad, og RT112 cellene ble deretter arrestert i G0 /G1. Likevel er S-fase entry ikke utelukkende styres av cdk4 og P19. Snarere er en kohort av cellesyklusproteiner involvert i å drive celledeling fremover. Amygdalin synes derfor å blande seg inn i en cellelinje avhengig måte med flere sjekkpunkt molekyler, forstyrre finjustert mitotisk maskiner. Veksten blokaden er det endelige resultatet.
Relevansen av p19 og p27 i blærekreft progresjon er ikke fullstendig klarlagt. Begge proteinene ble sterkt endret etter amygdalin program i denne undersøkelsen, p27 blir nedregulert i alle cellelinjer, p19 blir oppregulert i UMUC-3 og RT112 men redusert i TCCSUP. Semi-kvantitativ RT-PCR på en serie av 32 blærekreft prøvestykker som er forbundet med tilstøtende normale vev har ikke avslørt noen betydelige forskjeller i p19 og p27 ekspresjon [13]. På den annen side, prospektiv evaluering av høy grad av blærekreftpasienter behandlet med radikal cystektomi demonstrert mer p27 positive enn negative svulster hos pasienter med tilbakefall av sykdommen [14]. Microarray analyse har vist en positiv sammenheng mellom p27 uttrykk og avansert blærekreft [15]. I kontrast, har en annen studie rapporterte en ugunstig effekt av p27 tap forbundet med blære carcinoma [16]. In vitro forsøk har pekt på en ubestemt rolle av p27 i så mye som undertrykkelse av dette protein forhøyet vekst, men samtidig reduseres invasjon [17] – [19]. Basert på dette, er det ikke mulig å vurdere om endelig p27 reduksjon etter amygdalin søknad er knyttet til proliferasjon, for å invasjon eller til begge deler. For å få innsikt i invasjonen prosessen har en ny etterforskning er igangsatt med fokus på handlingen av amygdalin på kreftceller sprer seg.
Amygdalin redusert fosforylering av Akt og av mTOR subenheten, rictor. Akt-mTOR signal spiller en stor rolle i blæren karsinogenese, med Akt aktivering oppstår over hele spekteret av blære urothelial karsinom [20]. Kreft Genome Atlas-prosjektet har identifisert AKT /mTOR sti som en viktig terapeutisk mål i blærekreft [21]. Den spesifikke handlingen av amygdalin på mTOR kompleks rictor er av interesse, siden de godkjente mTOR-hemmere, everolimus og temsirolimus, målrette mTOR kompleks raptor, mens rictor anses ufølsom for både narkotika [22]. Rictor har vist seg å være en viktig bestemmende faktor i blærekreft, migrering og invasjon [23]. Dermed amygdalin kan ikke bare være et nyskapende verktøy for å nøytralisere metastatisk spredning, men også for å utfylle mTOR-hemmer baserte regimer.
CDK, sammen med cykliner, er viktige molekyler som er ansvarlige for cellecyklusprogresjonen og celledeling, der særlig CDK er tilknyttet bestemte sykliner. Derfor har avvikende kreftcellevekst blitt tilskrevet modulasjon i CDK-cyclin uttrykk nivå. De sterkeste protein endringer etter 24 timers inkubering amygdalin ble observert for CDK2 og cyklin A, og kan representere store mål for amygdalin. Selv om ingen etterforskere hittil har avansert denne hypotesen har amygdalin vist seg å endre gener som er involvert i cellesyklus regulering av menneskelige tykktarmskreftceller [24]. Den cdk2-cyklin A aksen fremmer G1 /S faseovergang, som kan forklare hvorfor cdk2 /cyklin A ned-modulering av amygdalin ble ledsaget av en G0 /G1 faserest i UMUC-3 og TCCSUP celler. In vitro undersøkelse av bløtvevssarkom celler har vist at cdk2 reduksjon kombinert med p27 tap påvirker celle invasjonen programmet [25]. Siden cdk2 reduksjon Parallelt med en p27 reduksjon av blærekreft modellen, er det sannsynlig at amygdalin ikke bare virker på tumorvekst, men kan også påvirke metastatisk spredning.
Faktisk, selv om cdk2-cyklin A er endret på mange solide tumorer, informasjon om cdk2-cyclin A i blærekreft er sparsom. Protein og mRNA analyser av blære carcinoma vev har indikert at cdk2 er nært forbundet med blære svulst utvikling og fremgang [26]. Cdk2 forpliktende partner, cyclin A, har blitt korrelert med tumor klasse og dårlig sykdomsspesifikk overlevelse, dokumentert av immunhistokjemi og cDNA mikromatriser [27]. I dagens eksperimenter, slå ned cdk2 eller cyclin A førte til en betydelig reduksjon av svulsten celle nummer, indikerer den kliniske relevansen av både proteiner for blærekreft. Siden CDK og sykliner er forbedret når medikamentresistens utvikles [28], [29], motvirke denne prosessen kan være en potent strategi for å hindre eller å overvinne motstanden [29]. I løpet av de siste årene har flere nye terapeutiske strategier er utformet for å målrette CDK. For tiden er de i forskjellige stadier av klinisk utvikling, som både enkle midler og i kombinasjon [30]. Amygdalin kan være en «naturlig» alternativ der det alvorlige bivirkninger forbundet med konvensjonelle CDK-hemmere [31] kan unngås.
Det ble observert små forskjeller mellom kortsiktig og langsiktig amygdalin program, spesielt i den UMUC-3 cellelinje. Cdk2 ikke lenger var redusert etter 2 uker, men CDK1 ble sterkere redusert enn etter 24 timer amygdalin søknad. Grunnen til dette bryter over etter lang tids anvendelse er ikke klart. Cdk2 akkumulerer ved G1 /S fasegrensen, mens CDK1 stasjoner celler i mitose [32]. De ulike mekanismer for CDK1 og cdk2 har blitt reflektert av cellesyklusen analysen viser ytterligere arrestasjonen av UMUC-3 i G2 /M etter 2 uker amygdalin eksponering. Siden UMUC-3-vekst og proliferasjon ble på lignende måte endret i 24 timer og 2 uker amygdalin anvendelse kan cdk2 ha blitt ufølsom for undertrykkelse amygdalin, men dette ble kompensert ved en undertrykkelse av CDK1. Faktisk har CDK1 blitt rapportert å kompensere for cdk2 ved å omdirigere CDK1 inn i cyklin A veien, noe som er normalt begrenset til cdk2 [33].
Dette er den første undersøkelsen gir informasjon om amygdalin innflytelse på blærecancercelle linjer in vitro. Slike in vitro-studier kan ikke gjøre mer enn å legge frem en prediksjon av amygdalin sin effekt hos pasienter. Kliniske studier med amygdalin er ikke godt dokumentert og randomiserte kontrollerte studier har aldri blitt gjennomført. En retrospektiv analyse av 67 kreftpasienter som hadde tatt amygdalin rapportert to komplette og 4 partielle responser [34]. En fase II studie ble utført i 1982, der pasientene fikk også vitaminer og pancreatic enzymer. Therapy ble stoppet når blodet cyanidnivået økt, og det ble konkludert med at Laetrile ikke var en effektiv kreftbehandling [35]. Andre rapporter tyder amygdalin å være klar fordel i kreftpasienter [8]. Men begrepet «nytte» var ikke tydelig spesifisert. Ambivalens har også gitt seg utslag i kasuistikker, der amygdalin var ineffektive i fem og effektiv i fire saker [8].
Det er fortsatt ikke klart om amygdalin kan også fungere på normal, fysiologisk intakte epitelceller. Siden primære ikke-immortaliserte epitelceller ikke viser mitotisk aktivitet eller taper raskt mitotisk aktivitet in vitro, kan disse cellene ikke bli utsatt for vekst MTT-analysen. Imidlertid har amygdalin nylig blitt demonstrert å blokkere veksten av endotelceller [36]. Hvorvidt dette fenomenet kan overføres til andre celler forblir åpent. Likevel, blokkering av endotelial cellevekst av amygdalin indikerer at amygdalin kan undertrykke tumorindusert angiogenese.
Risikoen for å utvikle cyanidforgiftning har heller ikke blitt løst. I dette henseende administreringsveien (oral eller intravenøs), vil mengde og kvalitet sikkert påvirker risiko-fordel-forhold. Siden kliniske rapporter om amygdalin behandling er mer enn 30 år gammel [8], og i løpet av denne tiden forståelsen av molekylære kreftmekanismer har sterkt utviklet seg, ville det være verdt å teste in vitro Hypotesene som presenteres her i en vivo modell. Godt utformet, kontrollerte kliniske studier til kritisk test amygdalin bør da vurderes.
Totalt amygdalin har vist seg å blokkere veksten av blæren kreftceller in vitro. Undertrykkelse av CDK2 og cyclin A kan være en relevant mekanisme som definerer hvordan amygdalin kan arrestere eller redusere tumor spredning.
Takk
Vi vil gjerne takke Karen Nelson for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av «Brigitta und Norbert Muth Stiftung» og «Freunde und Förderer der Goethe-Universität Frankfurt».
