Abstract
Bakgrunn
De globale genuttrykk profiler av voksne og føtale murine prostata stamceller var fast bestemt på å definere felles og unike regulatorer som misexpression kan spille en rolle i utviklingen av prostatakreft.
metodikk /hovedfunnene
et karakteristisk kjerne av transkripsjons regulatorer felles for både foster og voksen primitive prostata cellene ble identifisert, så vel som molekyler som er eksklusivt for hver populasjon. Elementer som er felles for føtale og voksne prostata stamceller inkluderer ekspresjons-profiler av Wnt, Shh og andre reaksjonsveier er identifisert i stamceller i andre organer, signaturer av den aryl-hydrokarbon-reseptoren, og oppregulering av komponenter av aldehyd-dehydrogenase /retinsyrereseptor akse . Det er også et vesentlig lipid metabolisme signatur, markert ved overekspresjon av lipid enzymer og tilstedeværelsen av bindingsmotivet for Srebp1. Den føtale stilk cellepopulasjon, karakterisert ved hurtigere spredning og selvfornyelse, uttrykker regulatorer av cellesyklusen, slik som E2F, Nfy, Tead2 og Ap2, ved høye nivåer, mens voksne stamceller viser en signatur, hvor TGF-β har en fremtredende rolle. Endelig sammenligning av underskrifter fra primitive prostata celler med tidligere beskrevet profiler på menneske prostatakreft identifisert stamcelle molekyler og stier med deregulert uttrykk i prostatakreft inkludert kromatin modifikatorer og onkogen, Erg.
Konklusjon /Betydning
Våre data indikerer at voksne prostata stilk eller progenitorceller kan anskaffe karakteristika for selvfornyende primitive føtale prostataceller under onkogenese og antyder at avvikende aktivering av komponenter i prostata stamcelle baner kan bidra til utvikling av prostatatumorer.
Citation: Blum R, Gupta R, Burger PE, Ontiveros CS, Salm SN, Xiong X, et al. (2009) Molekylær Signaturer av prostata stamceller Avslør Nye signalveier og gi innsikt i prostatakreft. PLoS ONE 4 (5): e5722. doi: 10,1371 /journal.pone.0005722
Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 13 februar 2009; Godkjent: 03.04.2009; Publisert: 29. mai 2009
Copyright: © 2009 Blum et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health, CA132641 (ELW), CA 90593 (DM), National Research service Award (NRSA) fra National Institutes of Health, National Institute of Diabetes og Digestive og nyre sykdommer, 5F32DK071468 (CSO), Amgen Inc. og Helen L og Martin S Kimmel senter for stamcellebiologi ved NYU School of Medicine. Amgen forskere har hatt en rolle i denne studien ved å delta i analysen av data, og i fremstillingen av RNA anvendt i mircroarray eksperimenter. Ingen andre organer hadde en rolle i denne studien
Konkurrerende interesser:. Blant annet støtte dette arbeidet ble også støttet av en forskningsstipend fra Amgen Inc. (Det er ingen tall for dette stipendet). En rekke av våre Amgen kolleger var også samarbeidspartnere i dette prosjektet. Disse samarbeidspartnere deltok i analysen av microarray data og ved fremstillingen av RNA anvendt i microarray eksperimenter. Den spesifikke rolle hver forfatter er detaljert i den aktuelle delen viet til rollene til forfatterne.
Innledning
Det er sannsynlig at avvikende spredning av prostata stamceller (PSC) og /eller deres forfedre bidrar til prostata patologi. Vi er fast bestemt på genekspresjonssignaturer av fosterets og voksen PSC (FPSC og APSC) for å få innsikt i signalveier som kjennetegner disse to normal stamcelle (SC) populasjoner og sammenlignet disse profilene med de av prostata kreftceller. Opptegning disse reguleringsveier kan gi innsikt i de mekanismene som konverterer hvilende voksen prostataceller i en voksende kammer som gir opphav til benign prostatahyperplasi og carcinoma dermed tillater målretting av spesifikke veier for å behandle disse sykdommene.
Vi har vist at epitelceller med SC egenskaper er konsentrert i den proksimale duktal-regionen, ved siden av urinrør [1] – [3]. Disse funksjoner inkluderer quiescence, høy proliferative potensial og evnen til enkeltceller for å gi opphav til ductal strukturer som inneholder både basal og luminale celler [2] – [4]. Vi har tidligere isolert, basert på ekspresjon av Sca-1 [2], to populasjoner av celler som er i stand til å regenerere prostatavev i en
in vivo
prostata rekonstituering assay. Den første populasjon, stamceller, har et betydelig vekstpotensial, ikke krever androgen for overlevelse, uttrykker høye nivåer av Sca-1 og befinner seg i den proksimale delen av kanaler. Nesten alle Sca-en
Hi-celler uttrykker også α6 grin uttrykt et antigen på primitive prostata celler [2] – [4]. Den andre befolkningen, transitt forsterkende celler, har mer begrenset vekstpotensial, uttrykker lavere nivåer av Sca-en krever androgen for overlevelse og finnes i alle duktale regioner [2], [3]. En tredje populasjon, føtale prostata stamceller, eksisterer i det urogenitale sinus hvorfra prostata utvikler [5]. Det innerste laget av epitelceller i murine urogenitale sinus begynner å invadere det ytterste laget av mesenchyme å danne kanalene i prostatakjertelen etter E16. Før denne hendelsen, kan det urogenitale sinus epitel (UGE) som inneholder primitive føtale prostata celler isoleres lett fra urogenitale sinus.
For å identifisere molekyler og veier som er aktive i primitive prostata bestander vi bestemt transkripsjons profiler av fire populasjoner av celler: (i) UGE, anriket på FPSC, (ii) Sca-1
Hi, celler som uttrykker høye nivåer av Sca-1, anriket på APSC [2], [6], (iii ) Sca-en
Lo, celler som uttrykker medium for lave nivåer av Sca-en og er beriket i transitt forsterkende celler [2], og (iv) Sca-1
neg, celler uten Sca-en uttrykk, som representerer den mest modne befolkningen og har nesten ingen regenererende potensial [2]. For å få innsikt i de regulatoriske lag av transkripsjons nettverk aktive i primitive prostata celler, utførte vi en beregnings skjermen av cis-regulatoriske promoter motivene [7] for å avsløre de som er betydelig beriket blant PSC gener. Vi identifiserte også funksjonelle genet kategorier som er beriket i de primitive celler.
De føtale og voksne SC populasjoner uttrykte mange kjente SC-relaterte gener. Vår analyse avdekket betydelig berikelse av flere transkripsjonsfaktor (TF) -binding språk motiver i arrangører av uttrykte gener. Dataene indikerer at FPSC og APSC har unike og felles transkripsjonsprogrammer og identifisere en rekke av de viktigste funksjonene som gjør vedlikehold og selvfornyelse av udifferensiert tilstand. En rekke av de stamcelle-relaterte gener vi identifisere kan også delta i utviklingen av prostatakreft, som indikerer at disse molekylene kan avgrense en undergruppe av tumorer med en mer primitiv og muligens en mer aggressiv fenotype.
Materialer og metoder
Cell forberedelse, antistoffer og FACS analyse
Etikk uttalelse.
Alle dyr omsorg og prosedyrer ble utført i samsvar med New York University Institutional Review board krav.
den proksimale området av prostatakanaler (dvs. den del av kanalene nærmeste urinrør) av 6 uker gamle C57BL /6 mus ble spaltet og cellene ble kontrollert for antigen ekspresjon (tabell S1) [1], [2]. SCA-en-merkede celler ble sortert ved FACS ved anvendelse av en DakoCyomation MoFlo sorter i 3 populasjoner i samsvar med den midlere fluorescensintensitet (MFI) av Sca-1 uttrykk [2]. Celler (10,000-50,000) med høyest MFI (25%; Sca-en
Hei), middels /lav MFI (40%, Sca-en
Lo) og de som mangler Sca-1 uttrykk (25%; SCA-1
Neg) ble samlet i TRIzol (Invitrogen). UGE ble isolert fra den urogenitale sinus av 16 dager gamle C57BL /6 muse-embryoer [8] og tilsatt til TRIzol. Uttrykket nivåer av Aldh ble bestemt ved FACS-analyse etter farging med Aldefluor reagenssett (StemCell Technologies).
Real-Time PCR
En mikrogram total RNA ble revers-transkribert ved 52 ° C i 1 time ved bruk av Thermoscript RT-PCR-systemet (Invitrogen). 20 ng av resulterende cDNA ble brukt i en Q-PCR-reaksjon ved hjelp av en iCycler (Biorad) og pre-designede TaqMan Gene Expression Analyser (Applied Biosystems). Syklus terskelverdier fra tre separate RNA prøver ble gjennomsnitt; mengder av målet ble interpolert fra standardkurver og normalisert til hypoxantin guanin fosforibosyl transferase.
RNA isolering og microarray hybridisering
Vi etablerte transkripsjons profiler for UGE, Sca-en
Hei, Sca- 1
Lo, og for Sca-en
Neg differensierte celler. Tre replikater av UGE (FPSC) og Sca-en
Hei (APSC) prøver og fire gjentak av Sca-en
Lo og Sca-en
Neg Prøvene ble analysert. RNA ble isolert ved standardprosedyrer og dens kvalitet ble vurdert ved hjelp av en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Prøver med en RNA Integrity Number (RIN) 7.0 ble ansett egnet for merking og 20 ng ble merket med Genechip to-syklus target merking kit (Affymetrix). Ti mikrogram merket og fragmentert cRNA ble deretter hybridisert til musegenomet MOE430 2,0 array (Affymetrix) som interrogates ~45,000 transkripsjoner. Raw uttrykk data (CEL filer) ble generert ved hjelp GCOS 1.4 (Affymetrix). Dataene som er omtalt i denne publikasjonen er deponert i NCBI Gene Expression Omnibus og er tilgjengelig gjennom GEO-serien sjonsnummer GSE15580 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE15580) .
analyse av genuttrykk data
Utnytte ArrayAssist (Stratagene), ble rå Affymetrix CEL filer behandlet ved å påføre MAS5 algoritme, for å tildele gjenkjenning samtaler (Present /Marginal /Fraværende) for hver sonde sett som senere ble brukt i nedstrøms data filtrering. For å generere normaliserte ekspresjonsnivåene brukte vi PLIER (probe logaritmisk intensitet feil) algoritme, en modellbasert, multi-matrise signal estimator som frembringer mer nøyaktige probe-sett signalverdier [9]. Kombinasjonen av disse ovennevnte beregninger ble brukt for data filtrering for å få 33 967 «
gyldige gener
«, som representerer transkripsjoner (gener) med signaler 20 og oppdaget som Tilstede i minst én prøve. For å oppnå en undergruppe av variable gener, beregnet vi variasjonskoeffisienten (CV) for hver transkripsjon og genereres et sett av 5095 «
aktive gener
» inneholdende de transkriptene med høyest (15% av det totale) CV skårer. Å fokusere på de genene som ble endret i en statistisk signifikant måte ble prøvene gruppert etter celletype (UGE, Sca-en
Hei, Sca-en
Lo, Sca-en
Neg), intensiteter av
aktiv genet
transkripsjoner var log2-transformert og utsatt for ytterligere statistiske analyser som benytter to ulike tester: (a) en-veis ANOVA bruker en Benjamini-Hochberg korreksjon (
p
0.05) og (b) betydningen analyse av mikromatriser (SAM) metode med en falsk funnrate på 5%. Dette ga en liste over 3137 «
betydelige gener
«, som representerer transkripsjoner som passet kriteriene for begge disse statistiske tester. Et prinsipp komponentanalyse (PCA) (gjennomsnittlig sentrert) beregnes ved å ArrayAssist, viste en passende reproduserbarhet og separasjon i de forskjellige typer av celler (figur S1). For å definere de karakteristiske kjennetegn ved UGE, Sca-en
Hei og Sca-1
Lo populasjoner, sammenlignet vi genuttrykk intensitet leser (gruppert prøver) for hver av disse populasjonene med at av de mest differensierte voksne celler (Sca-en
Neg) ved hjelp av en uparet t-test (Benjamini-Hochberg korrigert
p
0,05). Tre genet undergrupper (UGE, Sca-en
Hei og Sca-en
Lo) som inneholder transkripsjoner hvis uttrykk økt ( 1,75 ganger) i forhold til deres uttrykk i Sca-en
Neg celler ble generert .
Analyse av funksjonelle kategorier
Vi benyttet funksjonelle merknader av murine gener levert av murine Genome informatikk, som bruker standard vokabular innført av Gene ontologi (GO) konsortiet. Beriket funksjonelle kategorier (
p
≤0.01, etter korreksjon for multippel testing) ble identifisert i hvert av de tre klyngene (
UGE-bare
,
UGE + Sca-en
Hei
,
Sca-en
Hi-bare
) ved hjelp EXPANDER, der hypergeometrisk beregningen brukes til å bestemme over-representert GO menyer i et mål satt i forhold til en bakgrunn sett (hele samling av antatte murine gener) [7]. For å unngå skjevheter, ble genene representert ved flere probe sett telles bare en gang.
Computational analyse av promoter cis-regulatoriske elementer
For arrangøren analyse vi brukt EXPANDER [7] for å oppdage cis-regulatoriske promoter elementer som styrer de observerte transkripsjons endringer i genuttrykk klynger. Gitt målet og bakgrunns sett med arrangører, utfører EXPANDER statistiske tester for å identifisere TFS som bindende stedet signaturer er betydelig overrepresentert i målet satt i forhold til bakgrunnen (TF berikelse er markert med
p
-verdi) [7 ]. Begge tilnærmingene av hver arrangøren ble skannet for mulige bindingsseter (som spenner transkripsjons startwebstedet fra 1000 bp oppstrøms til 200 bp nedstrøms). De enrichments identifisert i denne studien var robust, da de holdt seg stabil over et stort spekter av terskelverdier.
Sammenligning av data til kjente SC-profiler
Entrez Gene IDer og UniGene unike identifikatorer ble brukt å matche gener er representert i ulike microarray plattformer. Vi scoret antall gener som var vanlig oppregulert i genuttrykk profiler og i minst ett annet SC profil.
Diskusjon
Resultater og
Profilering av genuttrykk i tre prostata stammen /stamcelle beriket populasjoner
RNA ble isolert fra de fire cellepopulasjoner som er beskrevet ovenfor (UGE, Sca-en
Hei, Sca-en
Lo og Sca-en
Neg), utarbeidet for hybridisering til mikromatriser og analysert som beskrevet i Materialer og Metoder. Tre genet undergrupper (UGE, Sca-en
Hei, Sca-en
Lo) ble generert bestående av vitnemål som uttrykk ble statistisk forhøyet i hver av bestandene i forhold til sitt uttrykk i den mest differensierte Sca-en
Neg cellepopulasjon (figur 1, tabell S2). Den FPSC undergruppe har det høyeste antallet vesentlig endrede transkripsjoner (1286 gener), som kan forventes når man sammenligner en foster SC med en differensiert voksen cellepopulasjon. Den APSC undergruppe (Sca-en
Hi) har 641 og transitt forsterkende undergruppe (Sca-en
Lo, mer differensiert enn APSC undergruppe) har bare 144 transkripsjoner som er forskjellig uttrykt. Vi så bestemt om vi kunne skjelne vanlige uttrykk mønstre blant disse tre progenitor undergrupper og mønstre som var unike for hver undergruppe. Skjæringspunktet mellom oppregulert transkripsjoner innenfor de tre undergrupper resulterte i dannelsen av fire klynger (
UGE-bare
,
UGE + Sca-en
Hei
,
Sca- 1
Hi-bare
,
Sca-en
Hei
+
Sca-en
Lo
) av gjensidig eller utelukkende uttrykte gener (figur 1; Table S3). Det mest karakteristiske genuttrykksmønstrene ble avledet fra UGE cellepopulasjonen, manifestert ved 1050 transkripsjoner som utelukkende ble overuttrykt i
UGE-bare
klynge (FPSC cluster). Et annet karakteristisk mønster var tydelig i Sca-en
Hei undergruppe, representert ved den eksklusive oppregulering av 296 transkripsjoner i
Sca-en
Hi-bare
klynge (APSC cluster). Interessant, innenfor klyngen som overlapper mellom fosterets og de voksne undergrupper,
UGE + Sca-en
Hei
klynge, fant vi et betydelig antall av vitnemål (209) som var vanlig oppregulert, mens mindre alminnelighet (112 transkripsjoner) ble observert i klyngen som overlapper (
Sca-en
Hei
+
Sca-en
Lo
cluster) mellom APSC undergruppe (Sca- 1
Hi) og TA undergruppe (Sca-en
Lo) (Figur 1, Tabell S2). Svært få transkripsjoner (5) ble utpreget uttrykt i mer differensiert befolkningen (
Sca-en
Lo-bare
cluster). Disse resultatene viser fremtredende scene-spesifikke genet transkripsjoner uttrykk under modning av prostata celler, fra den mest primitive foster befolkningen (UGE), og utvikler seg gjennom APSC befolkningen (Sca-en
Hei), og dens avkom, transitt -amplifying celler (Sca-en
Lo), og kulminerte med den mest differensierte undergruppe (Sca-en
Neg).
En Venn-diagram detaljering antall utskrifter (gener) av overexpressed gener felles og tydelig blant UGE, Sca-en
Hei og Sca-en
Lo undergrupper. Antallet av vitnemål innenfor hver undergruppe er gitt i parentes utenfor Venn diagram. Antallet av vitnemål innenfor hver gruppe er gitt i kursiv inne i skiver Venn diagram. Antall kommenterte gener som vises i hver av de fire klyngene er gitt i innfelte bord. Den tilsvarende dendogram av hver klynge blir presentert.
A. Uttrykk av SC markører i prostata stammen /progenitor klynger
Vår profilering analyse indikerer at alle tre stilk /progenitor beriket undergrupper inneholder et betydelig antall kjente markører for murine PSC, nemlig
Trp63
,
CD200
,
Ctnnb1
,
Smo
,
Krt5
,
Krt14
,
Itga6 Twitter /
Cd49f
,
CD44
,
Kit
,
BCL2
, og
CD34 product: [10] (figur 2A, B, tabell S4). En sammenligning av 11 kjente PSC markører som var oppregulert i våre undergrupper med et panel av 15 vanlige murine housekeeping gener, hvis uttrykk ble ikke endret, bekrefter at våre profiler gjenspeile en bestemt transcriptional underskrift av primitive FPSC og APSC (figur 2A; Table S4). I tillegg transkripsjoner for en Efrin reseptor,
Ephb3
, og to Efrin ligander,
Efna5 Hotell og
Efnb2
, som fungerer som koordinatorer av migrasjon og spredning i tarm SC nisje [11] er oppregulert i både FPSC og APSC populasjoner (figur 2B). FACS analyse av Sca-en
Hei og Sca-en
Lo celler validert økt uttrykk av flere stamcelle antigener spådd av microarray (figur 3A) inkludert stamcellemarkører α6 og p 4 -integrins [12], keratin 5, Bcl-2, β-catenin [10], Sox2 [13] og CD34 [14] (figur 3B). Dette tyder på at endringer i mRNA nivåer av mange SC-markører reflekteres av endringer i sine protein nivåer.
A. Expression profiler av molekyler som er beskrevet som blir uttrykt i primitive prostata populasjoner som ble oppregulert minst to ganger (øvre panel) i UGE, Sca-en
Hei og Sca-en
Lo celler blir presentert. Hver kolonne representerer en enkelt prøve, og hver rad representerer et bestemt gen. Rød (høy), grønn (lav) i forhold uttrykk; svart indikerer lik uttrykk i forhold til Sca-en
Neg celler. Det nedre panel viser en kassett 15 felles murine husholdningsgener som manifesterer stabil ekspresjon i alle prøver. Log-forholdet (LR) verdier er presentert i Tabell S3. B. Expression profiler av kjente SC markører (
Egon Hotell og
FatiGO
undersøkelse), som ble oppregulert med minst to ganger i prostata stammen /progenitor beriket prøver. Fem uttrykk mønstre kan skilles. LR verdier er presentert i tabell S5.
A. Transkripsjon nivå av SC markører i primitive og progenitorceller prostata celler. Microarray data fra SC markører fra disse primitive cellepopulasjoner er uttrykt som LR-verdier [gjennomsnittlig ± SD] i forhold til modne Sca-en
Neg prøver. B. Antigen uttrykk for SC markører på Sca-en
Hei og Sca-en
Lo celler. FACS analyse av Sca-en
Hei og Sca-en
Lo celler bestemt uttrykk for SC markører (angitt i A) på disse populasjonene. Berikelse verdier [gjennomsnittlig ± SD] er uttrykt som ganger endring i antigen uttrykk i forhold til antigenet uttrykk for den modne Sca-en
Neg cellepopulasjon.
For å finne ut om ytterligere SC relaterte gener ble uttrykt i prostata stammen /progenitor undergrupper, brukte vi to tilnærminger. Først utnyttet vi to bioinformatikk (
Egon Hotell og
FatiGO product: [15]) for å identifisere gener kommenterte som stamcelle-gener basert på tidligere publikasjoner. Denne undersøkelsen viser at alle våre stilk /progenitor relaterte undergrupper (UGE, Sca-en
Hei, Sca-en
Lo) uttrykker en rekke stamcellemarkører (totalt 67 gener) (figur 2B; Tabell S5 ). Vår andre tilnærming for fastsettelse av primitive natur profilene involvert en systematisk sammenligning av vår profil med fem andre genuttrykk profiler fra embryonale (ESC), blodkreft (HSC), neuronal (NSC) [16], [17], hud [18 ] og lever [19] stamceller. Vi har funnet at et betydelig antall mRNA uttrykt i prostata stammen /progenitor klaser ble også oppregulert i minst ett av de fem publiserte SC profiler (som varierer fra 40% av
uge-bare
mRNA til 20% av
Sca-en
Hi + Sca-en
Lo
mRNA) (figur 2B, Bord 1, S6). Derfor, til tross begrensningene sammenligne data innhentet ved hjelp av ulike eksperimentelle forhold og mindre omfattende mikromatriser enn brukt i vår studie, vi har oppdaget en høy grad av overlapping mellom gener overuttrykt i prostata stammen /progenitor profiler og de som er overuttrykt i andre SC profiler. Dette innebærer at prostata stilk /stamceller dele en rekke funksjoner med SC isolert fra andre kilder. Imidlertid prostata stilk /progenitor-celler uttrykker også gener som ikke er identifisert i noen av disse fem SC populasjoner indikerer at noen av disse gener kan være unikt for prostata eller kan deles med andre ubeskrevne SC profiler. Spesielt de to tilnærmingene som benyttes for beregning av SC-markør berikelse viser at mens det er betydelig overrepresentasjon av SC relaterte gener hos voksne Sca-1
Hi-celler, er det en enda høyere representasjon av SC-markører i uge celler. Interessant, en sammenligning med to signatur stemness «studier [16], [17] indikerer at PSC profilen har større overlapping med ESC eller NSC profiler, enn med HSC. For eksempel, sammenlignet med dataene på Ramalho-Santos et al [17] indikerer at 14,4% og 16,1% av PSC-beriket mRNA overlapper med ESC- og NSC-beriket mRNA henholdsvis, mens færre mRNA (6,8%) overlapper HSC-beriket transkripsjoner (tabell 1). Flere nyere studier har vist at genekspresjonsprofiler av ESCs og NSCs overlapper med hverandre i større grad enn med HSC [17], [20]. Følgelig våre resultater tyder på at prostata stamfar avstamning kan ligne nevrale eller embryonale stamceller i større grad enn for blodkreft stamceller.
Tilstedeværelsen av betydelige mengder SC gener i vår APSC og FPSC tyder på at disse populasjonene har karakteristikkene av udifferensierte stamceller. Vi neste fastsatte de molekylære profiler av de isolerte PSC bestander å tyde potensielle signalveier som er uttrykt av disse cellene.
B. Identifisering av overrepresentert funksjonelle kategorier og TF-bindende promoter motiver innenfor klynger av gener som er overuttrykt i stammen /stamceller
For å identifisere de viktigste biologiske prosesser og transkripsjons nettverk innen de tre SC-holdige klynger (
UGE-bare
,
UGE + Sca-en
Hei
,
Sca-en
Hi-bare
Figur 1) vi brukt ekspansjonspakke for funksjonell og formidler analyse. En rekke funksjonelle kategorier og TF-bindende promoter motivene er betydelig anriket i disse klyngene (tabell 2, S7).
a) selvfornyelse signatur i FPSC
UGE-bare
klyngen er sterkt anriket i celle spredning gener, som ville være forventet for et voksende foster befolkningen (tabell 3, S7,8). Oppregulering av
Mki67 plakater (12 ganger) utelukkende i UGE undergruppe attesterer at disse cellene formerer. Spredning og cellesyklusrelaterte trasé er forhøyet i selvfornyelse av normal SC [21]. PTEN sletting, som forstørrer pool av selvfornyende NSC [21], avslører en SC-selvfornyelse signatur (231 gener) for disse cellene. Spesielt, ca 64% av disse genene er også oppregulert i
UGE-bare
klyngen, noe som indikerer betydelig likhet i genuttrykk mellom disse to selvfornyende populasjoner (Tabell S9). Komponenter, samt målgener, av Wnt /β-catenin sti som fremmer selvfornyelse i mange typer SC [22] er sterkt representert i FPSC og APSC (tabell 3, S10). Den avvikende aktivering av denne reaksjonsvei i prostata-tumorer [23] og dens anrikning i PSC er i overensstemmelse med ideen om at prostatakreft kan oppstå i den primitive rommet. qPCR analyse validert genuttrykket profiler, noe som indikerer at uttrykk for
Wnt4
er forhøyet i FPSC (5 ganger) og APSC (8 ganger) i forhold til modne celler (Sca-en
Neg). I tillegg
Wnt6
er forhøyet i FPSC (22 ganger), og Fzd6 er forhøyet i FPSC (5 ganger) og APSC (3 ganger) i forhold til modne celler (tabell S11). Komponenter av den soniske pinnsvin (Shh) sti, som også er involvert i selvfornyelse av primitive celler [24] og undertrykkelse av differensiering, er manifest i FPSC og APSC (tabell 3, S12). Overflod av Hysj-regulatorer og målgener som er oppregulert i FPSC og APSC indikerer at autokrint pinnsvin signale kan spille en viktig rolle i prostata stamfar /stamcellebiologi. qPCR analyse validerer genuttrykk data og indikerer at
Shh Hotell og
Gli3
uttrykk er økt i foster (35 ganger og fire ganger henholdsvis) og voksne (6 ganger og tre ganger henholdsvis) SC forhold til modne celler (tabell S11). Hedgehog signalering er viktig for normal prostata vekst og øker i prostata tumorigenesis på konsert med en økning i stamcellemarkører [25], noe som tyder på gang at primitive celler kan bli utvidet i løpet av tumorigenesis.
TF-bindingssetet analyse av arrangører for gener som var oppregulert i FPSC (
UGE-bare
cluster) identifiserer to transkripsjons regulatorer av cellesyklusen, nemlig E2F og Nfy (tabell 2, S13), i samsvar med over representasjon av selvfornyelse gener (Bord 3, S7) [20]. Viktigere er økning i nivåene av mRNA som koder fire medlemmer av E2F familien observert sammen med en rekke gener som er spesifikke mål av E2f3 (tabell 3). Analyse av qPCR bekrefter at
E2f3 plakater (3 ganger) og en representant målet genet,
Cdc2a plakater (12 ganger), er oppregulert i Uge celler sammenlignet med modne celler (tabell S11). Interessant er E2f3 uttrykk knyttet til selvfornyelse av muse trophoblast SC [26], utvidelse av SC i columella og lateral rot caps av Arabidopsis [27], og en dårlig prognose i prostata kreft [28]. Bindingen-motiv signatur for Nfy er også godt representert i arrangører av FPSC gener og er i samsvar med økt transkripsjon av Nfya og Nfyb subenheter og funn som Nfya er en potent induser av HSC selvfornyelse [29].
Andre promoter signaturer som er beriket i
UGE-bare
klyngen er de av Ap2 og av embryonale TEA domene som inneholder faktor (ETF), også kjent som Tead2 (tabell 2, S13). I FPSC uttrykk for
ETF Twitter /
Tead2 Hotell og dens coactivator,
Yap1
, ble økt med 4- og 2-fold hhv. Den økte uttrykk for
Tead2 plakater (4 ganger) i FPSC forhold til modne celler ble verifisert ved qPCR (tabell S11). Tead2 induserer gener som fremmer selvfornyelse av stamceller i lukteepitelet [30] og er viktig i murine embryo utvikling [31]. AP2 transkripsjoner er forhøyet tre ganger og en rekke av sine mål gener er økt (tabell 3). AP2 fremmer spredning i løpet av differensiering og er en markør for SC og pluripotency [32]. Dermed E2F, Nfy, Tead2 og Ap2 er sannsynlig å bli involvert i den selvfornyelse og utvidelse av primitive prostata befolkningen.
b) TGF-ß signale signatur i APSC
I kontrast overflod av spredning gener som finnes i den voksende UGE befolkningen, i APSC (Sca-en
Hei undergruppe) finner vi at TGF-β målgener er oppregulert indikerer at TGF-β signalering er et fremtredende trekk ved APSC. Vi har tidligere dokumentert at opprettholdelsen av uvirksom av APSC er avhengig av TGF-β /Smad2 /3-signalveien [33]. Betydelig, identifiserer vår cis-element promoter analyse beriket bindende-sider for Smad og Smad3 i
Sca-en
Hi-bare
klynge, mens lignende nettsteder var fraværende fra
UGE beskyttet
klyngen (tabell 2), noe som indikerer at TGF-β /Smad signalering kan ha en dominerende rolle i APSC.
ekspresjonsnivået av
Itgb6
, et integrin som binder og aktiverer TGF β [34] er oppregulert tre ganger i APSC (tabell 3). I tillegg en økning i uttrykket nivåer av
IGFBP3 plakater (14 ganger), som fosforylerer Smad3 [35], er observert utelukkende i Sca-en
Hei undergruppe. Validering av qPCR (3-fold; Tabell S11) og FACS-analyse (3-fold, figur 3B) bekrefter at TGF-β målgenet clusterin (Clu) er oppregulert i APSC. Vår promoter analyse identifiserer også overrepresentasjon av SMAD3 motiv i arrangører av genene fra UGE + Sca-en
Hei klynge (tabell 2), noe som indikerer at TGF-β kan også megle signalering i FPSC. Som en annen metode for bestemmelse av mulig involvering av TGF-β signalering i primitive prostataceller, sammenlignet vi genene fra de tre SC-anriket klynger (
UGE-bare
,
UGE + Sca-1
Hei Hotell og
Sca-en
Hi-bare
) med TGF-β-drevet signatur fra keratinocytter [36]. Disse sammenligningene viser at ca 14% av genene i hvert av disse tre testede klynger kan være TGF-β mål (
UGE-bare
112/823;
UGE + Sca-en
Hei
19/130;
Sca-en
Hi-bare
23/172 gener) (tabell S14), som støtter bidraget fra TGF-β signalering i FPSC i tillegg til sin fremtredende rolle i APSC (Tabell 3). I denne sammenheng er det viktig å merke seg at
Smad2 Hotell og
Smad3
, de to viktigste transkripsjons formidlere av TGF-β, er utelukkende oppregulert i UGE (tabell 3). Den fremtredende representasjon av Smad bindende stedet motiv i arrangører av gener som er oppregulert i APSC (Sca-en
Hi-bare cluster) indikerer at TGF-β signalveien er svært relevant for transkripsjonsprogrammet av disse cellene og støtter det funn at TGF-β opprettholder quiescence av APSC [33].
