Abstract
Nivåene av proteiner som styrer cellesyklus er regulert av ubiquitin-mediert degradering via ubiquitin-proteasome system (UPS) av substrat-spesifikke E3 ubiquitin ligaser. Den cyclin-avhengig kinase inhibitor, p27kip1 (p27), som blokkerer cellesyklus i G1, er ubiquitylated av E3 ligase SCF-Skp2 /Cks1 for nedbrytning av UPS. I sin tur, er Skp2 og Cks1 ubiquitylated av E3 ligase komplekse APC /Cdh1 for destruksjon og dermed opprettholde rikelig nivåer av atom p27. Vi har tidligere vist at evigvarende proteasomal degradering av p27 er en tidlig hendelse i Type I livmorkreftutvikling (ECA), et østrogen (E2) indusert kreft. De foreliggende studier viser at E2 stimulerer veksten av ECA-cellelinjer og normale primære endometrial epitelceller (EECS) og induserer MAPK-ERK1 /2-avhengig fosforylering av p27 på Thr187, en forutsetning for p27 ubiquitylation ved kjerne SCF-Skp2 /Cks1 og påfølgende degradering. I tillegg reduseres E2 E3 ligase [APC] Cdh1 forlater Skp2 og Cks1 intakt for å forårsake p27 degradering. Videre forhindrer banket ned Skp2 E2-indusert degradering p27 og vekststimulering som tyder på at patogenesen av E2-indusert ECA er avhengig av Skp2-mediert nedbrytning av p27. Motsatt progesteron (Pg) som hemmer av endometrieproliferasjon øker atom p27 og Cdh1 i primær EECS og ECA celler. Pg, øker også Cdh1 binding til APC for å danne den aktive E3ligase. Knocking ned Cdh1 unngår Pg-indusert stabilisering av p27 og veksthemming. Spesielt, verken E2 eller Pg påvirket transkripsjon av Cdh1, Skp2, Cks1 eller p27. Disse studiene gir ny innsikt i hormon regulering av celleproliferasjon gjennom UPS. Dataene impliserer at hindre nukleær p27 degradering ved å blokkere Skp2 /Cks1-mediert nedbrytning av p27 eller øke Cdh1 å mediere nedbrytning av Skp2-Cks1 er potensielle strategier for forebygging og behandling av ECA
relasjon:. Huang KT, Pavlides SC, Lecanda J, Blank SV, Mittal KR, Gold LI (2012) østrogen og progesteron Regulering p27kip1 Levels via Ubiquitin-Proteasome System: Patogene og terapeutiske implikasjoner for livmorkreft. PLoS ONE 7 (9): e46072. doi: 10,1371 /journal.pone.0046072
Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 12. april 2012; Godkjent: 27 august 2012; Publisert: 27.09.2012
Copyright: © Huang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health, National Cancer Institute, R01 CA 89175 www.nih.gov (til LIG); og en New York University (NYU) Cancer Institute Pilotprosjekt Grant (til LIG). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Østrogen (E2) stimulerer spredning av endometriet og progesteron (Pg) undertrykker E2-drevet spredning. På linje med effektene av disse hormonene på vekst, E2 induserer skriver jeg livmorkreft (ECA, rate: 85% av alle eksport- kredittinstitusjoner) og omvendt, er Pg brukes som et terapeutisk middel for endometriehyperplasi, forløperen til ECA [1]. ECA er den vanligste gynekologiske kreft med en insidens på 136.000 globale tilfeller per år [2]. Minst 50% av kvinner med livmor atypisk hyperplasi (AEH) har samtidig ECA; ytterligere 30% vil utvikle seg til ECA [3]. Som et alternativ til hysterektomi, progestiner omvendt AEH og godt differensiert ECA fører til en høy grad av vellykkede svangerskap [4], [5]. Et molekylært nivå forståelse av normal og ondartet vekst regulering av endometriet ved E2 og Pg er viktig å fremme felt når det gjelder å definere nye forebyggende og terapeutiske molekylære mål for denne sykdommen. Vi har tidligere rapportert at cyclin-avhengig kinase (Cdk) inhibitor, p27kip1 (p27) kritisk til vekst arrest, er fraværende i kjertlene i både AEH og ECA vev på grunn av rask og varig degradering av p27 via ubiquitin proteasome system (UPS) impliserer tap av p27 forekommer tidlig i onkogenesen av ECA [6]. På linje med motstridende effekter av E2 og Pg på spredning, viste vi videre at E2 forårsaket proteasomal degradering av p27 i primær EECS mens Pg markert økt p27 i både primær endometrial epitelceller (EECS) og ECA celler. Disse data tyder på at p27 er en betydelig molekylære mål involvert i både patogenesen og behandlingen av ECA.
Som en tumor suppressor og medlem av Cip /Kip familie av Cdk inhibitorer, P27 arrestasjoner celleproliferasjon i G1 fasen av cellesyklus ved å blokkere cyclinE /Cdk2 aktivitet [7]. I motsetning til andre tumorundertrykkere og negative regulatorer av cellesyklusen, den p27-genet
CDKN1B
, er sjelden mutert i kreft hos mennesker, men i stedet p27 nivåer er sterkt regulert av posttranslasjonelle modifikasjoner [7]. Konsentrasjonen, subcellulære lokalisering, og fosforylering av spesifikke aminosyrer i p27-molekylet til slutt regulerer dens effekt på Cdk2 aktivitet og således, celleproliferasjon. p27 oversettelse og protein stabilitet er høyest i G0 og tidlig G1 når p27 bindes til og hemmer CyclinE /Cdk2 for cellesyklus arrest. Etter hvert som cellesyklusen skrider frem gjennom G1, trinnvis reduksjon i p27 øke aktiviteten av CylcinE og CyclinA bundet til Cdk2, som aktiverer gener involvert i progresjon fra G1 til S og initiering av DNA-replikasjon [8]. Ved lavere konsentrasjoner, er p27 fosforylert på T187 [p-p27 (T187)] av CyclinE /Cdk2, som beholder p-p27 (T187) i cellekjernen hvor det er ubiquitylated, som er nødvendig for degradering av Skp2 /Cks1 av SCF
Skp2 E3 ligase kompleks [7], [9]. Fosforylering av p27 på T187 krever forrige tyrosinfosforylering av p27 på tre steder i sitt Cdk2 hemmende domenet som kan oppnås ved Abl eller Src-familie kinaser [10]. Fosforylering av p27 på andre aminosyrerester ved forskjellige kinaser dikterer sin subcellulære lokalisering av [7], [11], [12], [13], [14]. Enten p27 er degradert i kjernen eller deponeres i cytoplasma, vil cellesyklus arrest ikke forekomme med mindre det finnes tilstrekkelig nivå av kjernefysisk p27 å hemme Cdk2. Viktigere, i kjernen, er p27 tumor undertrykkende men i cytoplasma, er det onkogene som det medicates migrasjon /metastase [15], [16], [17]. Som i ECA, har mangelen på atom p27 blitt funnet i en rekke epiteliale kreftformer, [6], [7], [17], [18], [19], og både en invers sammenheng mellom nivåene av kjerne p27 (lav) og Skp2 (høy) og lagring av p27 i cytoplasma er assosiert med redusert overlevelse [7], [15], [20], [21]
SCF (Skp1-Cul1-Skp2 /Fbox;. SCF -Skp2 /Cks1) og anaphase fremme kompleks (APC, APC /Cdh1, APC /Cdc20) er multi-subenhet E3 ligase komplekser av UPS som forårsaker proteasomal degradering av Cyclin /CDK og deres Cdk hemmere med presis timing for å synkronisere og regulere progresjon og arrest av cellesyklusen i en syklisk måte, [22], [23]. Polyubiquitin konjugering av proteinsubstrater på lysiner oppnås ved hjelp av tre enzymer som overfører /aktiveres (E1), konjugater (E2) og ligates (E3) ubiquitin til proteinet for selektiv gjenkjennelse og nedbrytning av 26S proteasomet [24]. F-box protein, Skp2 er substratet anerkjennelse modul av SCF-Skp2 /Cks1. Skp2 grensesnitt med tilbehøret proteinet Cks1 danner en lomme som identifiserer p-p27 (T187) og ubiquitylates molekylet på lysiner 134, 153, og 165 [22], [23], [25]; Skp2 og Cks1 er hastighetsbegrensende for p27 degradering [9]. I slutten av G1-S når nivået av SCF-Skp2 /Cks1 er høyest, Skp2 og Cks1 bli substrat gjenkjennelses mål for APC /Cdh1 E3 ligase kompleks ubiquitin-formidlet nedbrytning [26]. Denne nedbrytning av Skp2 og Cks1 resulterer i atom opphopning av p27 for G1 arrest [7], [9], [27]. Til sammen en økning i APC /Cdh1 indirekte øker atom P27 nivå ved å forårsake nedbrytning av Skp2 og Cks1 og denne nedgangen i Skp2 /Cks1 direkte øker kjernefysiske nivåer av p27. Videre er nivået av kjerne Skp2 og p27 inverst korrelert med vekststimulering og veksthemming i sammenheng med å være prooncogenic eller tumor undertrykkende, respektivt.
De foreliggende studier viser en ny mekanisme ved hvilken eggstokk steroider regulere veksten av endometriet, som er gjennom manipulering av innholdet av proteiner av UPS og ikke av transkripsjon. Spesielt rapporterer vi at E2 fører MAPK-ERK1 /2-avhengig fosforylering av atom p27 på T187 og reduserer E3 ligase APC /Cdh1 forlater Skp2 /Cks1 intakt til ubiquitylate atom p27 for nedbrytning resulterer i stimulering av spredning av EECS og ECA cellelinjer . Omvendt øker Pg Cdh1 og dens binding til APC; APC /Cdh1 E3 ligase fører proteasomal nedbrytning av Skp2 og Cks1, forlater p27 intakt for veksthemming. Vi foreslår at p27 er en betydelig molekylære mål i hormondrevet vekst kontroll av endometriet og som hindrer p27 degradering ved enten å blokkere Skp2 /Cks1 eller øke Cdh1 er rasjonelle metoder for terapeutisk intervensjon av AEH og ECA.
Resultater
Østrogen og progesteron har motsatt effekt på celleproliferasjon og nivåene av p27, Skp2, og Cks1 proteiner
i samsvar med hormonell vekst regulerende effekt på endometriet, vi tidligere viste at eggstokkene hormoner, østrogen (E2) og progesteron (Pg, i nærvær av E2 for å øke Pg-reseptorer [PR] for en fysiologisk reaksjon som etterligner menstruasjonssyklusen [6], [28], [29]) hadde motsatt effekt på nivået av p27 i primær EECS slik at E2 reduserte nivåene av p27 via ubikvitin-mediert nedbrytning og omvendt, Pg induserte en markert økning i p27 nivåer i både EECS og primær ECA-celler [6]. Siden Skp2 og Cks1, som komponenter i SCF
Skp2 E3 ligase årsaken degradering av p27 [7], [9], [23], foreslo vi at E2 og Pg ville tilsvarende omvendt påvirke nivåene av Skp2 og Cks1 for stimulering og inhibering av celleproliferasjon, respektivt. Ved hjelp av ECC-1-celler som uttrykker både ER og PR, viser vi at E2 induserte en nedgang doseavhengig og tidsavhengig i p27 med 36% og 33% og maksimale responsene til en og 10 nM, respektivt, og omvendt påvirket Skp2 og Cks1 nivåer med en 5,4-gangers og 3-dobling, henholdsvis, med en maksimal respons på 100 nM E2 (figur 1 A, B). Nedgangen i p27 skjedde så tidlig som i 2 timer og ble opprettholdt gjennom 24 timer, mens økningen i Skp2 og Cks1 skjedde senere, med en topp på 24 timer. ER negative KLE cellelinje ikke svare på E2, men i stedet, uttrykte høye nivåer av Skp2 og Cks1 forlater lite eller ingen p27. Den motsatte effekt ble vist for Pg (pluss E2), som induserte en 2,8-ganger økning i p27 ved 100 nM Pg og en samtidig 84% og 75% reduksjon i Skp2 og Cks1, henholdsvis (figur 1C). p27 gradvis økt 12-48 t med en 3-dobling på 48 timer som dalte til to ganger på 72 timer, mens Skp2 og Cks1 redusert over tid, og var nesten fraværende etter 24 timer (figur 1D). Det er viktig å merke seg at eksponeringstidene for Blottene ble mindre etter induksjon av Pg sammenlignet med E2, siden nivåene av p27 var så rikelig og kunne ikke ha blitt kvantifisert i forhold til aktin. Dermed nivåene av p27 på null tid for blotter viser E2-indusert reduksjon i p27 var gjennomgående høyere og de viser Pg-induserte økningen var gjennomgående lavere. For å estimere mer kvantitativt virkningene av E2 og hver for seg, Pg (pluss E2) på p27 og Skp2 stabilitet, ECC-1-celler ble inkubert med cykloheksimid (CHX) alene eller i nærvær av E2 eller Pg. Som vist i figur 1E, etter 6 timer i kultur, ble redusert E2 nivåene av p27 med 61% sammenlignet med 47% ved CHX alene, noe som ga en beregnet reduksjon i p27 halveringstid etter 1,5 timer (6,2 timer versus 4,7 timer; total inkubasjonstid = 18 timer). I samsvar med den raskere nedbrytning av p27 indusert av E2, ble Skp2 protein nivåer økt med 1,3 ganger på dette tidspunktet. I motsetning til dette, s stabilisert p27 som nivået av p27-protein ble økt med 1,5 ganger i 6 timer under Skp2 proteinnivåer ble redusert med 45% sammenlignet med 24% ved CHX alene ettergivende og estimert reduksjon i Skp2 halveringstid av 6,2 h (12,9 h versus 6,7 timers total inkubasjonstid = 48 h).
Detaljer er i materialer og metoder, og hver figur. A, E2 dose-respons: ECC-1 og KLE celler ble behandlet med E2 og p27, Skp2, og Cks1 protein nivåer bestemt av immunoblotting. B, E2 tid kurset: ECC-1 celler ble behandlet med E2 for tiden angitt og protein nivåer fastsatt som ovenfor. C, Pg dose-respons: ECC-1 celler ble behandlet med Pg /E2 og p27, Skp2 og Cks1 proteinnivåer bestemt som ovenfor. D, Pg tid kurset: ECC-1 celler ble behandlet med Pg /E2 for klokkeslettene og protein nivåer som ovenfor. Densitometriske skanninger av alle protein band er vist av grafene til høyre for hver blot. Hvert bånd ble normalisert til aktin og deretter sammenlignet med 0-tid eller ubehandlet kontroll. Dataene er uttrykt som relativ intensitet for hvert bånd ± standardavvik. E, E2 /Pg cykloheksimid (CHX) behandling: ECC-1-cellene ble behandlet med E2 i 18 timer eller med E2 og Pg i 48 timer. CHX ble lagt inn 6 timer før siste innhøsting. Cellene ble høstet ved 0,1,2 og 6 timer tidspunkter. CHX alene var grunnlinjen kontroll. Lysater ble fremstilt og immunoblottet for p27 og Skp2 og nivåene av hver enkelt proteinbånd bestemt ved densitometri (bånd intensitet). Den prosentvise endring i hver behandlingsparameter ble beregnet basert på nulltidspunktet for hver gruppe. Protein turn-over ble bestemt ved sammenligning av celler behandlet med CHX alene sammenlignet med CHX, i nærvær av hvert hormon ved hvert tidspunkt. Linje grafene representerer den relative intensitet av hvert bånd normalisert til aktin for hver gruppe. F, G: E2 stimulerer og Pg hemmer proliferasjon: ECC-1-cellene ble behandlet med E2 eller Pg /E2 og celleproliferasjon bestemt ved MTS-analyse (Materialer og metoder) * p 0,05. H, Cellesyklus distribusjon: ECC-1 celler ble behandlet med E2 eller E2 /Pg og cellesyklusanalyse utført som beskrevet Materialer og metoder
I samsvar med de høyeste konsentrasjonene av E2 og Pg effekter på p27. , Skp2, og Cks1, E2 indusert celleproliferasjon med peak reaksjoner fra 26-20% i løpet av ubehandlede kontroller på henholdsvis 0,1 nM og 1 nM (figur 1F), mens Pg hemmet spredning med en topp respons på 27% med 100 nM (Figur 1G). Etter cellesyklusanalyse bekreftet vi at hormoner påvirker celleproliferasjon som reflekteres av deres virkninger på cellesyklusfordeling (Figur 1 H). Etter 18 timers behandling med E2, det antallet ECC-1-celler i G1 ble redusert fra 58% til 49% og økte i G2 og S fra 14% til 15% og 29% til 36%, respektivt. Etter Pg behandling etter 48 timer, den fraksjon av cellene i G1 øket fra 58% til 67% og redusert i G2 og S fra 13% til 10% og 27% til 23%, henholdsvis.
Østrogen indusert ERK -avhengig fosforylering av p27 på Thr187
fosforylering av p27 på T187 kreerer molekylær konformasjon for sin ubiquitylation av SCF-Skp2 /Cks1 [22]. Figur 2A illustrerer at E2 induserte en 2,5-ganger og 2,3-ganger økning i fosforylering av p27 ved T187 (p-p27 [T187]) ved 1 nM og 10 nM E2 henholdsvis i ECC-1-celler (og i HEC-1B celler; fig S1A), med en 11-ganger maksimal respons p-p27 (T187) ved 18 timer etter behandlingen (figur 2B) som var MAPK avhengig (figur S1B). Som vist her, er dette den samme peak dose og tidsresponsen i hvilken p27 forringes av E2 (i samsvar med figurene 1A og 1C) i ECC-1-celler. I innledende forsøk, hverken proteasominhibitor, laktacystin og serin /treonin-fosfatase-inhibitor, var nødvendige okadainsyre for å opprettholde p27 i den sterkt p-p27 (T187) tilstand som antyder at frekvensen av proteasomal nedbrytning av p-p27 (T187) er tregere enn fosforylering av T187. Vi viser videre at ERK aktiveres av E2 nedstrøms fra MEK1 (blokkert av U0126) (figur 2C). Fra disse dataene, konkluderer vi med at E2-indusert fosforylering av p27 på T187 er MAPK /ERK-avhengige og ER-spesifikke responser. Til slutt, siRNA knock-down av ERK1 og separat, ERK2 (82%, 70% effektivitet, henholdsvis) reduserte p-p27 (T187) i de ubehandlede knockdown-celler sammenlignet med kontroll siRNA (figur 2D). Som vist i både de ikke-transfekterte og styrer siRNA transfekterte celler, synes det som ERK2 er mer enn høyt uttrykt ERK1 (N.B. dette kan skyldes en høyere spesifisitet til antistoffet for ERK2 enn ERK1). Blottet viser at banket ned ERK2 redusert fosforylering av p27 i større grad enn banket ned ERK1 (sammenligne nivåene av p-p27 (T187) i ERK1 og ERK2 knock-down for å styre siRNA). På grunn av den knock-down effektivitet og høyere ekspresjon av ERK av disse cellene med og uten E2-induksjon, er det vanskelig å kvantifisere bidrag av ERK1 og ERK2 i E2-indusert MAPK-drevet fosforylering av p27 ved T187. Likevel ser det ut til at E2 aktiverer både ERK1 og ERK2 for fosforylering av p27 på T187 for anerkjennelse av SCF-Skp2 /Cks1 (figur 2D og figur S1B)
A, E2 dose-respons. EEC-en ble behandlet med E2 og immunoblot analyse utført ved anvendelse av kanin anti-humant fosfo-p27 (p-p27 [T187]), som beskrevet i Materialer og Metoder. B, E2 tidsforløpet: ECC-1-celler ble behandlet med E2 og proteinnivåer bestemt ved immunoblotting som i A. C, E2, fosfo-ERK: ECC-1-cellene ble behandlet med E2 i nærvær av U0126 eller ICI og cellelysater immunoblottet for p-p27 (T187), fosfo ERK (p-ERK), og total ERK, som beskrevet i Materialer og Metoder. D, E2, Analyse av ERK1 og ERK2 aktivering følge deres knock-down med siRNA: ECC-1-celler ble transfektert med ERK1, ERK2, eller kontrollere siRNA, behandlet med E2 i nærvær eller fravær av ICI, etterfulgt av cellefraksjonering, og immunoblotting for total og fosfor-ERK-1 (p-ERK1) og ERK2 (p-ERK2), som beskrevet i materialer og metoder.
Knocking ned Skp2 økt kjernekraft og cytoplasma p27 og blokkert østrogen- indusert nedbrytning av p27 [av SCF-Skp2 /Cks1] innen både mobil avdelinger
Vi viser klart at så Skp2 og Cks1 verdiene øker, p27 nivåer reduseres med vekst stimulering som svar på E2 (figur 1A, B, E). Som vist i figur 3A, slå ned Skp2 (SKP2 siRNA; 80% effektivitet) forårsaket en 8,2 ganger økning i p27. Degradering av p27 ved Skp2 er rapportert å forekomme i kjernen [9], [30]. Men vi fant ut at E2 induserte en 2,5 ganger og 1,9 ganger økning i Skp2 i kjernen og cytoplasmatiske fraksjoner, henholdsvis, og en 50% reduksjon i p27 i begge fraksjoner (figur 3B, venstre panel). Viktigere, viser vi at følgende knockdown av Skp2, ble E2-indusert p27 nedbrytning blokkert i cytoplasma og cellekjernen (figur 3B, høyre panel og fig S2), at stimulering av celleproliferasjon av E2 var fullstendig unngås (figur 3C), og at E2-indusert reduksjon i p27 var ER- og proteasome avhengig i begge subcellulære fraksjoner (figur 3B, venstre panel). Sannsynlig, reduksjon i vekst etter Skp2 knockdown er på grunn av økningen i nivåene av p27 (som vist i figur 3B, høyre panel). Disse eksperimentene implisere Skp2 av SCF-Skp2 /Cks1 som en direkte formidler av E2-indusert degradering av p27
A, B, E2, Skp2 knockdown. ECC-1 celler ble transient transfektert med Skp2 eller tak siRNA , behandlet med E2 alene eller i nærvær av 1 uM laktacystin (Lac) eller 10 nM ICI, underkastet cellefraksjonering, p27 og Skp2 nivåer bestemt ved immunoblotting, som beskrevet i Materialer og Metoder. I Panel A, ble knock-down effektivitet bestemmes ved å sammenligne cellelysater fra Skp2 siRNA og kontroll siRNA behandlede celler ved immunoblotting. Relative P27 nivåer er representert ved densitometrisk skanning under blot. E2, celleproliferasjon i Skp2 knockdown-celler: ECC-1-celler, transfektert med Skp2 eller tak siRNA, ble behandlet med E2 eller ikke behandlet, og proliferasjon bestemt ved MTS-analyse, som beskrevet i Materialer og Metoder. Data er presentert som et gjennomsnitt av to uavhengige eksperimenter. * P≤0.05
Østrogen og progesteron har motsatt effekt på Cdh1 protein nivåer til slutt regulerer nivået av atom p27 protein.; Pg og E2 ikke påvirker mRNA nivåer av Cdh1, Skp2, Cks1 eller p27
ubiquitylation og nedbrytning av Skp2 og Cks1 av E3 ligase APC /Cdh1 ville hindre nedbrytningen av p27. Derfor hypotese vi at [APC] Cdh1 nivåer vil variere direkte med p27 og derfor reguleres på en motsatt måte av E2 og Pg. I overensstemmelse med denne hypotesen, mens E2 behandling av ECC-1-celler tidsavhengig redusert Cdh1 med en maksimal effekt på 56% ved 18 timer (figur 4A), Pg-behandlingen økte Cdh1 over tid med en maksimal respons av 1,7 ganger ved 48 h (figur 4B). I motsetning verken E2 eller Pg påvirket transkripsjon av Cdh1, p27, Skp2, eller Cks1 på tidlige tidspunkter gjennom henholdsvis 24 timer (Figur 4C), og 12 timer (figur 4D),, mens mRNA respons av felles gener som inneholder transkripsjons responsive elementer for eR og PR, nemlig PR og glycodelin henholdsvis er høy (Figur 4D).
A, B, Tid løpet av E2 og Pg [plus E2] behandling av EEC-1 celler. ECC-1-cellene ble behandlet med E2 og Pg pluss E2, forsøkene ble avsluttet ved tidspunktene angitt, lysater fremstilt, og Cdh1 proteinnivåer bestemt ved immunoblotting, som beskrevet i Materialer og Metoder. C, D, E2, Pg, mRNA-nivåer av p27, Skp2, Cks1 og Cdh1: ECC-1-cellene ble behandlet med E2 eller Pg /E2, total RNA ekstrahert ved de tider er vist, og kvantitativ sanntids RT-PCR utført, alt i materialer og metoder. PR og glycodelin primere ble brukt som kontroller for ER og PR målgener, henholdsvis. Data er presentert som et gjennomsnitt av to uavhengige eksperimenter.
Ved å følge E2- behandling av ECC-1-celler og subcellulære påfølgende fraksjonering, en 21% reduksjon i Cdh1 ble vist i atomfraksjonen. Denne reduksjonen i nivået av Cdh1 ble reversert ved laktacystin (figur 5A) som tyder på at E2 regulerer nivåene av Cdh1 av proteasomal degradering. Interessant nok var nivået av Skp2 redusert med 18% med E2 behandling i nærvær av laktacystin i både kjernen og cytoplasmaet og også, ved laktacystin alene, her vist i totale cellelysater (med 37%, innfelt på figur 5A). Dette resultatet er vanskelig å forklare, og selv om laktacystin er mye brukt til å hemme proteasome nedbrytning, kan det være off-target effekter, slik proteolyse av Skp2 av ulike nedbrytningsveier
A, E2.; B, s, Cell, fraksjonering og analyse av Cdh1, Skp2, Cks1, P27 proteiner og p-p27 (T187): Celler var enten ubehandlet, behandlet med E2, E2 pluss Lac eller behandlet med Pg /E2 med eller uten 1 mM laktacystin ( Lac) eller RU486. Cellene ble fraksjonert og proteinene analysert ved immunoblotting, som alle er beskrevet i Materialer og Metoder.
innfelt i A
viser at laktacystin reduserer Skp2 protein nivåer. C., Pg, Cdh1 binding til APC: Cellene ble behandlet med Pg /E2, cellelysater immunoutfelt med anti-Cdh1 etterfulgt av immunblotting med anti-Cdc27, som beskrevet i Materialer og Metoder. D, Figuren viser APC /Cdh1 som oppstrøms E3 ligase som ubiquitylates Skp2 /Cks1 (av SCF kompleks), som er nedstrøms E3 ligase som ubiquitylates p27 for å regulere p27 protein nivåer.
Det er bemerkelsesverdig at i motsetning Skp2, Cks1, og p27, er Cdh1 ikke til stede i cytoplasma. En samtidig reduksjon i p27 ble observert i begge de nukleære og cytoplasmiske fraksjoner med 30% og 61%, respektivt, sammenlignet med ubehandlede kontroller (basal p27 var høyere i kjernen enn cytoplasmaet til ubehandlede celler). I samsvar med den kjernefysiske reduksjon i p27, ble p-p27 (T187) økte for identifisering og ubiquitylation av p27 ved Skp2 /Cks1 for sin nedbrytning. Videre laktacystin hemmet p27 degradering i både kjernen og cytoplasmaet og økt p-p27 (T187) med 2,4-ganger bare i den nukleære fraksjonen som bekrefter at p27 er fosforylert på T187 i kjernen og dessuten forblir og akkumuleres i kjernen når sin nedbrytning inhiberes ved laktacystin (samme som i figur 3B, venstre panel). En forventet invers sammenheng mellom p27 og Skp2 nivåer ble vist etter E2-behandling i både kjernekraft og cytoplasmatiske fraksjoner. Omvendt, Pg behandling av ECC-1-celler indusert en 1,65 gangers økning i både Cdh1 og p27 i kjernen mens dette hormonet reduseres Skp2 med 66% i cytoplasma og både Skp2 og Cks1 med 62% på atomfraksjonen; disse svarene var PR-spesifikke (figur 5B). I motsetning til E2 behandling der p27 degradering skjedde i både mobil avdelinger, ble p27 stor grad stabilisert i kjernen av Pg (1,7 mot 1,1 ganger). Det er mulig at Skp2 og Cks1 ble degradert via UPS siden laktacystin økt Skp2 og Cks1 i kjernen og Cks1 i cytoplasma også. Mens vi viser Cdh1 nivåer økes ved Pg, må dette proteinet skal bindes til APC-komplekset [i en hypofosforylerte tilstand] for å utøve dets spesifikke E3 ligase aktivitet [31], [32], [33]. Som vist i figur 5C, Pg faktisk økte binding av Cdh1 til APC tilsynelatende øke dens E3 ligase aktivitet for Skp2 og Cks1 og dermed deres proteasomal degradering. Tatt sammen, som vist i figur 5D, våre resultater impliserer Cdh1 som oppstrøms regulator av nivåene av p27 gjennom UPS (det vil si SCF-Skp2 /Cks1) og det kritiske leddet for å effektuere hormonelle regulering av vekst.
knocking ned Cdh1 blokker Pg-mediert akkumulering av kjernekraft p27 og veksthemming
Figur 6A illustrerer at banket ned Cdh1 (
FZR
genet; 87% effektivitet) fullstendig blokkert Pg-indusert 1,6- fold økning i kjernefysiske p27 (figur 6B, høyre panel) og 30% vekst hemmende effekt (figur 6C). Videre spredning ble delvis blokkert i ubehandlede og Pg-behandlet Cdh1 siRNA transfekterte celler. Mens Pg forårsaket en reduksjon i kjernefysisk Skp2 og Cks1 (Tall 5B, 6B), mangel på Cdh1 E3 ligase aktivitet i knock-down celler, expectedly øker basalnivåer atom Skp2 og Cks1 (figur 6B, høyre panel). I tillegg vil redusert Pg-behandling cytoplasmisk Skp2 i både kontroll- siRNA og Cdh1 siRNA med 51% og 45%, respektivt (figur 6B, venstre panel). Disse dataene gir sterk støtte for en mekanisme som PR-mediert Pg handling øker atom p27 for inhibering av proliferasjon ved å heve Cdh1 i kjernen, som i sin tur forringer Cks1 og Skp2, som gjenspeiles av deres vekst i nærvær av laktacystin og Pg [ ,,,0],pluss E2] (figur 5B)
A, Pg, Cdh1 knockdown. ECC-1 celler ble transient transfektert med Cdh1 siRNA fulgt av cytoplasma /atom separasjon, og knockdown effektivitet bestemmes i hver fraksjon ved å sammenligne kontroll siRNA og Cdh1 siRNA transfekterte cellelysatene. B, Pg, Cdh1 knock-down og subcellulære fraksjonering: transfekterte celler ble behandlet med Pg /E2 med eller uten RU486, utsatt for cellulær fraksjonering, og immunoblot analyse utført på knock-down og kontroll siRNA celler for proteiner vist; alt som er beskrevet i Materialer og Metoder. Densitometriske skanner (relativ intensitet) av hver proteinbånd som representerer responsnivå i forhold til aktin og sammenlignet med ubehandlede kontroller, er vist i diagrammet nedenfor. C, Pg, celleformering i Cdh1 knockdown-celler: Celler transfektert med Cdh1 eller kontroll siRNA ble behandlet Pg /E2 eller ikke behandlet, og proliferasjon analysert ved MTS-analyse som beskrevet i Materialer og Metoder; * P. 0,05
Østrogen og progesteron har motsatt effekt på p27 og proteiner av ubiquitin-proteasome system i grunnskolen endometrial epitelceller
EECS fra endometrievev overgitt identiske svar for p27 , Cdh1, Skp2 og Cks1 som vist for ECC-en cellelinje etter behandling med E2 og Pg. Spesielt E2 via ER redusert p27 med 88% (Figur 6A) og Cdh1 med 71% og økt Skp2 og Cks1 med 1,2 og 2,3 ganger, henholdsvis. I kontrast, Pg-behandling av primære EECS økt p27 og Cdh1 med 2,7 ganger og 1,8 ganger i henholdsvis, mens Skp2 og Cks1 ble begge redusert med 69% (figur 7B). Behandling av primære celler med E2 stimulert vekst med 18% og 15%, mens Pg (pluss E2) hemmet vekst med 33% og 29%, noe som var nesten helt blokkert av RU486 (figur 7C og 7D) i både pasienter. Nuclear-cytoplasmisk fraksjonering av EECS fra en normal endometrialt vev viste at Cdh1 var bare til stede i kjernen, og at E2 ble redusert Cdh1 med 41%, redusert p27 hovedsakelig i kjernen (med 50%), økt Skp2 i begge fraksjoner, men for det meste i kjerne (1,3 ganger), og økt Cks1 i begge fraksjoner, men med flere i cytoplasma (1,5-fold, figur 7E). I direkte kontrast, Pg hovedsakelig økt kjernekraft p27 med 2,6 ganger og kjernekraft Cdh1 med 1,3 ganger, mens Skp2 ble redusert i kjernen og cytoplasma med 41%, og 89%, henholdsvis. Pg redusert Cks1 med 50% i cellekjernen og mindre i cytoplasma. Interessant, mens Cdh1 ble ikke funnet i cytoplasma i ECC-en cellelinje og primær normal EECS (n = 3), ble Cdh1 oppdaget i cytoplasma i grunnskolen ECA celler (n = 3, karakterer II, III, figur 7F) , som ble redusert med 44% i den subcellulære fraksjonen mens den ble øket i kjernen med 44%, etter Pg behandling. Det samme mønster ble vist for p27, som var til stede i cytoplasma og økt i kjernen ved 1,4 ganger i respons til Pg. Den konsekvente reaksjoner på E2 og Pg observert blant de fire normale primære EECS ikke bare implisere at konsistensen kan oppnås til tross for pasienten heterogenitet, men foreslår at hormon svarene vi observert i udødeliggjort cellelinjene er sannsynlig fysiologiske
A., E2; B, Pg behandling av primære EECS: ble normale EECS fra proliferativ fase behandlet med enten E2 uten eller med ICI eller behandlet med Pg /E2 med eller uten RU486, cellelysater fremstilt og immunoblottet for proteinnivåer er vist som beskrevet i Materialer og Metoder. A og B er forskjellige pasienter viser forskjellige basale nivåer av p27 og Cdh1. C, D: E2, E2 pluss Pg behandling, celleproliferasjon (ved MTS-analyse): parallellforsøk for pasient # 2, som beskrevet i Materialer og Metoder; * P 0,05. E, E2, s behandling, subcellulære fraksjonering: Primære EECS fra proliferativ fase ble behandlet med E2 eller Pg /E2, utsatt for subcellulære fraksjonering, og immunoblotanalyse for protein- nivåer, som vist, og som utføres som beskrevet i Materialer og Metoder.
