Abstract
Bakgrunn
Selv om aldersrelatert tap av kromosom Y (LOY) i normale hematopoetiske celler er en velkjent fenomen, har de fenotypiske konsekvensene av LOY vært unnvikende. Imidlertid LOY har blitt funnet i forbindelse med røyking, kortere overlevelse og høyere risiko for kreft. Det ble foreslått at LOY i blodceller kan bli en prediktiv biomarkør av mannlige kreft
Mål, metoder og amp.; Funn
For å undersøke sammenhengen av LOY i blodceller med risiko for utvikling av tykktarms (CC) og prostata cancer (PC), har vi analysert DNA-prøver fra perifert blod av 101 CC mannlige pasienter (gjennomsnittsalder 60,5 ± 11,9 år), 70 PC-pasienter (gjennomsnittsalder 68,8 ± 8,0 år) og 93 friske kontroll menn (gjennomsnittsalder 65,8 ± 16,6 år). Metodikken inkludert co-forsterkning av homologe sekvenser på kromosom Y og andre kromosomer bruker multiplex kvantitativ fluorescerende (QF) PCR etterfulgt av automatisk registrering og analyse på ABI 3500 Genetic Analyzer. Gjennomsnittlig Y /X-forhold var betydelig lavere i hele gruppen av kreftpasienter (0,907 ± 0,12; p = 1.17×10
-9) i forhold til kontrollene (1,015 ± 0,15), så vel som i CC (0,884 ± 0,15; p = 3.76×10
-9) og PC-pasienter (0,941 ± 0,06; p = 0,00012), når analyseres separat. Multivariat logistisk regresjonsanalyse justert for LOY og alder viste at LOY er en mer signifikant prediktor for kreft nærvær enn alder, og at alder trolig ikke bidrar til økt antall pasienter med påviselig LOY i kreftpasienter kohort.
Konklusjon
i konklusjonen, våre resultater støtte de siste funnene i foreningen av LOY i blodcellene med kreftutvikling hos menn
Citation. Noveski P, Madjunkova S, Sukarova Stefanovska E, Matevska Geshkovska N, Kuzmanovska M, Dimovski A, et al. (2016) Tap av y-kromosom i perifert blod av tykktarms og prostatakreftpasienter. PLoS ONE 11 (1): e0146264. doi: 10,1371 /journal.pone.0146264
Redaktør: Ezio Laconi, Universitetet i Cagliari, Italia
mottatt: 14 september 2015; Godkjent: 15 desember 2015; Publisert: 08.01.2016
Copyright: © 2016 Noveski et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble støttet av prosjektet 13-3595 /1 fra departementet for utdanning og forskning, Makedonia (til DPK). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tap av Y-kromosom (LOY) er et velkjent fenomen som er knyttet til aldring og observert med varierende frekvenser i benmargceller [1,2] eller i perifere blodceller [3,4] fra sunt eldre menn. Foreningen av LOY med hematologiske kreftformer har vært unnvikende. Imidlertid LOY er rapportert i leukemier [5,6,7,8] og hos pasienter som antas å ha dårlig respons på kreftterapi [9]. Andre studier har funnet foreningen bare i pasienter som viste LOY i mer enn 75% [10] eller 100% av de berørte cellene [11]. Fersk studie undersøker LOY i to separate blodcellefraksjoner perifere funnet signifikant høyere frekvens av LOY i CD34 + celler hos pasienter med myelodysplastisk syndrom sammenlignet med eldre menn uten hematologiske sykdommer [12]. En studie viser ingen sammenheng mellom LOY og hematologiske kreftformer har også blitt publisert [13].
En sammenslutning av LOY har vært rapportert hos kreftceller fra urothelial blærekreft [14], bukspyttkjertelkreft [15], spiserørskreft [16], hode og nakke kreft [17], nyrecellekreft [18] og i kreftcellelinjer av leverkreft [19]. Disse studiene har fokusert på LOY i selve tumoren som en markør for kreft subtype og /eller sykdomsprogresjon og mulige utfall.
Flere studier har undersøkt mosaikk LOY i perifere blodceller i forhold til nærværet av sykdom. En forening ble funnet med primær biliær cirrhose [20], autoimmun tyreoiditt [21], men ikke med mannlig brystkreft [22]. Store kohort SNP arraybaserte studier har funnet en sammenslutning av mosaikk LOY i perifere blodceller med økt risiko for kreft, kortere overlevelse og røyking [23,24].
Vi her presentere resultatene av en sammenslutning studie av LOY i perifere blodceller hos mannlige pasienter med kolorektal og prostatakreft.
Materialer og metoder
fag
Vi har studert 101 mannlige pasienter med kolorektal kreft (gjennomsnittsalder 60,5 ± 11,9 år ), 70 mannlige pasienter med prostatakreft (gjennomsnittsalder 68,8 ± 8,0 år) og 93 friske menn fra den generelle befolkningen (gjennomsnittsalder 65,8 ± 16,6 år). Kreft fag ble rekruttert fra Institutt for Urologi, Medisinsk fakultet, Skopje, Makedonia, og ble henvist til Farmakogenetisk Laboratory, Avdeling for farmasi, mens DNA-prøver fra friske kontroller ble innhentet fra DNA banken på RCGEB «Georgi D. Efremov «. Noen clinicopathological karakteristikker av svulster i kreftpasienter er gitt i tabell 1. Studien ble godkjent av etikkomiteen av den makedonske Academy of Sciences og Arts (Godkjenning nr 2010/1) og etikkomiteen ved Fakultet for farmasi, Universitetet Ss Cyril og Methodius (Godkjenning nr 03-95), Skopje, Makedonia. Alle fag har gitt skriftlig informert samtykke til deltakelse i studien i henhold til Helsinkideklarasjonen.
DNA
DNA ble isolert fra fullblod. Etter lyse ble leukocytter pelletert og fordøyd med proteinase K og DNA ble ekstrahert følgende standard fenol-kloroform-protokollen.
Fastsettelse av mosaikk LOY i blodet
Tilstedeværelse av LOY ble bestemt med multipleks kvantitativ fluorescens-polymerase kjedereaksjon (QF-PCR) som opprinnelig er utviklet for påvisning av microdeletions i AZF regioner av Y-kromosom og kjønn kromosom aneuploidies i pasienter med mannlig infertilitet [25,26]. Relativ mengde av Y-kromosom ble vurdert gjennom chromosomeY /chromosomeX (Y /X) forholdet mellom fluorescerende signal om co-forsterket korte sekvenser fra Y-X homolog amelogenin gener (
amely Hotell og
AMELX
).
AMELX
inneholder en 6 basepar (bp) sletting i intron en som mangler i
amely
, slik at co-forsterket fragmenter er størrelse 112 bp fra kromosom Y og 106 bp fra kromosom X og er lett separert og kvantifisert ved kapillær elektroforese (~ 1: 1 forhold av 112/106 bp toppene hos normale mannlige DNA-prøver og nærvær av kun 106 bp topp i hunn DNA-prøver) [27]. Falske positive resultater i tilfelle av tap eller gevinst på kromosom X ble kontrollert av forsterkning av 152 bp fragment av
TAF9B
gen på kromosom X med primere som også co-forsterker 148 bp homolog sekvens på kromosom 3. Forholdet av topparealene til de to co-amplifiserte fragmenter (148/152 bp; kromosom 3 /kromosom X) er ~ 2: 1 i normale mannlige DNA-prøver og ~ 1: 1 i normale kvinnelige DNA-prøver
. slettinger eller duplikasjoner i
amely
region ble utelatt av to andre primer sett. Den første forsterker homologe sekvenser av
DAZL
gen på kromosom 3 (to eksemplarer av 217 bp fragment) og
Daz
gener på kromosom Y (fire eksemplarer av 214 bp fragment). Den andre primer sett forsterker
MYPT2
gen på kromosom 1 (175 bp fragment) og to homologe sekvenser (180 bp fragmenter) fra kromosom Y. Primer sekvenser og PCR-forhold for multipleks QF-PCR ble som beskrevet andre steder [ ,,,0],26]. Co-forsterket fluorescens-merkede PCR produktene ble kjørt på Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer med LIZ500 som intern standard og analysert med GeneMapper 4.1 programvare (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Representative electrophoregrams fra to fag, en med med amelogenin Y /X-forhold på ~ 1 og ett med amelogenin Y /X-forhold på 0,28 er vist i figur 1.
Electrophoregrams fra individer med a) normal amelogenin Y /X ratio (omtrent like peak områder av X-kromosom og Y kromosom sekvenser) og b) pasient med tykktarmskreft og betydelig økt andel av celler med LOY (amelogenin Y /X-forhold på 0,28).
for å validere QF-PCR-metodologi som vi har benyttet to forskjellige DNA-prøver: en normal mann prøve (46, XY), og en prøve med Turners syndrom (45, X0) (for å etterligne cellene med LOY). Begge prøver ble blandet i forskjellige forhold for å representere prøver med 2,5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 70% og 90% LOY. Før analysen begge prøver ble justert til den samme konsentrasjon. Nukleinsyre konsentrasjon og prøve renhet ble bestemt ved NanoVue ™ Plus spektrofotometer (GE Healthcare, Little Chalfont, Storbritannia), mens presis dobbelttrådet DNA-konsentrasjon ble målt med qubit
® dsDNA HS analysesett på en qubit 2,0 fluorometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA). Med begge målinger DNA-konsentrasjon og renhet for begge prøver var identiske.
Reproduserbarheten Y /X-forholdet bestemmelse ble målt ved å gjenta QF-PCR-amplifisering og analyse på 11 forsøkspersoner med amelogenin Y /X-forhold under 0,80 . I tillegg ble variasjonskoeffisienten av amelogenin Y /X-forholdet beregnes ut fra den gjentatte QF-PCR-analyser utført på 14 pasienter med Y /X-forholdet mellom 0,8-1,0 og 12 individer mellom 1,0-1,2. For å eliminere mulig skjevhet av ulike PCR satt ups, PCR reaksjoner for en tredjedel av friske kontroller og to tredeler av kreftpasienter ble gjennomført samtidig i hver av PCR går.
Statistisk analyse
forskjeller mellom hjelp av to gruppene ble analysert med Student t test etter vurdering for likestilling av avvik med Levene`s test. Korrelasjon mellom to variabler ble analysert ved hjelp av Pearsons korrelasjonskoeffisient (r). Deteksjonsgrensen ble beregnet basert på standardavviket av responsen og hellingen av en regresjonslinje [28]. Forskjeller mellom hjelp av gjentatte målinger ble analysert med parede prøver t-test. Multivariat logistisk regresjon ble brukt til å modellere sammenslutning av LOY og aldersvariabler med kreft tilstedeværelse. Signifikansnivå ble vurdert når p-verdien var mindre enn 0,05. Variasjonskoeffisient fra duplikate målinger ble beregnet med MedCalc for Windows, versjon 12.5 (MedCalc Software, Oostende, Belgia) i henhold til deres beskrevet metodikk. Dataanalyser for alle andre statistiske tester ble utført ved hjelp av statistikkprogrammet for samfunnsvitenskap, versjon 19 (SPSS, Chicago, IL, USA).
Resultater
Validering av amelogenin Y /X topp ratio som en metode for påvisning av mosaikk LOY i blodceller og testing for reproduserbarhet
Normal 46, XY DNA-prøven og ni blandet DNA-prøver med forskjellige andeler av 46, XY og 45, ble DNA-prøver X0 amplifisert in triplo og korresponderende amelogenin Y /X-forholdet ble oppnådd for hver enkelt andel. Korrelasjonsanalyse basert på gjennomsnittsverdier av tredoble målinger viste sterk negativ korrelasjon (r = -0,999, p = 8.03×10
-13) mellom andelen 45, X0 prøve og amelogenin Y /X-forhold.
deteksjonsgrense (LOD) av LOY ble beregnet til 4,6%, ved hjelp av standardavvik og helningen på regresjonslinjen av gjennomsnittsverdier av tredoble målinger (fig 2).
punktene representerer gjennomsnitt amelogenin Y /X-forhold verdier tilsvarende 0%, 2,5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 70% og 90% av 45, X0 i de blandede DNA-prøver. Regresjonslinjen ble beregnet som prosentandel av 45, X0 prøven som uavhengig og amelogenin Y /X-forhold som avhengig variabel. Slope (e) og standardavvik (σ) av regresjonslinjen ble brukt til å beregne deteksjonsgrense ved hjelp av formelen LOD = 3.3σ /s [28].
reproduserbarhet amelogenin Y /X-forhold ble vurdert i 37 fag. Den lave variasjonskoeffisient på 4,62% og ingen signifikant forskjell i de midler mellom to målinger (p = 0,1097, paret t-test) bekrefter at QF-PCR er en pålitelig metode for estimering av amelogenin Y /X-forhold.
Mosaic LOY i blodceller er signifikant assosiert med kreft nærvær
Vi har analysert Y /X-forhold ved hjelp av QF-PCR i 264 DNA-prøver isolert fra leukocytter fra perifert blod hos pasienter med tykktarmskreft (n = 101 ), prostatakreft (n = 70) og friske kontroller (n = 93), matchet for alder. Fordeling av Y /X-forhold er presentert som histogrammet i figur 3. bety Y /X-forhold var signifikant lavere hos kreftpasienter (0,907 ± 0,12; p = 1.17×10
-9) enn kontrollene (1,015 ± 0,15) . Statistisk signifikans ble beholdt også når gjennomsnitts Y /X-forhold av kolorektal pasienter (0,884 ± 0,15; p = 3.76×10
-9) og prostatakreftpasienter (0,941 ± 0,06; p = 1.15×10
-4) ble analysert separat.
gjennomsnittsverdier og standardavvik er også vist.
Ved hjelp av multivariabel logistisk regresjon vi har modellert andel av LOY (utledes fra amelogenin Y /X-forhold) og alder for å vurdere deres styrke til å forutsi kreft tilstedeværelse. Begge Predictor variabler ble brukt som avhengige variabler, mens resultatet var kreft tilstedeværelse og ingen kreft som referanse (tabell 2). LOY prosent spår kreft tilstedeværelse med en betydelig styrke (p = 2.043×10
-9), mens alder viste bare border signifikans (p = 0024). De to Predictor variablene i modellen tyder på at økningen i alder når du justerer for LOY prosentvis øker ikke risikoen for kreft tilstedeværelse i vår kohort av kreftpasienter.
Diskusjoner
En rekke forskergrupper undersøker ikke-invasiv kreft biomarkører for å forbedre tidlig diagnostisering og behandling av kreftpasienter. Nylig LOY ble foreslått som en mulig biomarkør for ulike kreftformer hos menn. Data fra store kohorter forbundet LOY i perifert blod med risiko for total dødelighet og ikke-hematologiske kreftdødelighet [23]. Bekreftende tilfelle kontroll studier knytte mosaikk LOY i perifere blodceller med økt risiko for kreft er nødvendig.
For å bidra til avklaring av rollen til LOY i perifert blod som en kreft biomarkør hos menn, har vi utført saken kontroll studie hos mannlige pasienter med to ulike typer av kreft.
metodikken vi brukt var basert på indirekte bestemmelse av Loy nærvær av QF-PCR, som måler forholdet av topparealene for fluorescerende merkede PCR-fragmenter med faste lengder representerer homologe sekvenser om Y-kromosomet og noen andre kromosom. Denne metoden å måle forholdet mellom topparealene er mye brukt i hurtig prenatal diagnostikk av vanlige kromosom aneuploidies [29]. Det er også brukt for påvisning av kjønnskromosomer aneuploidies samt for slettinger og rearrangements i AZF områder på Y-kromosomet [25]. I motsetning til cytogenetisk analyse av dyrkede blodceller (bare T-lymfocytter) som er tidkrevende og utsatt for tekniske gjenstander som kromosom tap under glide fremstillingen [3], QF-PCR-metodologi er utført på en DNA isolert fra leukocytter fra fullblod , og det er billig og mer robust. Vi klarte ikke å sammenligne resultatene av amelogenin Y /X-forhold ved hjelp av direkte telling av celler med cytogenetisk analyse, men vi har validert vår metodikk ved å simulere LOY med bruk av 45, X0 DNA-prøve. Den høye korrelasjonen mellom 45, X0 prosent og amelogenin Y /X-forhold bekrefter at QF-PCR er en pålitelig metode for estimering av Y /X-forhold. Selv om det er rapporter for
amely
allel frafall som følge av sletting i denne regionen av Y-kromosom, økt frekvens er i hovedsak rapportert i asiatiske populasjoner [30,31,32]. Vi har ikke registrert tap av
amely
blant menn i denne studien, samt mer enn 4000 mannlige prøvene analysert i vårt laboratorium for tilstedeværelsen av de vanligste kromosom aneuploidies, farskap og mannlig infertilitet (upubliserte data).
I vår studie har vi inkludert mannlige pasienter med prostatakreft og tykktarmskreft. Selv om amelogenin Y /X-forhold ikke gir en nøyaktig verdi av prosentandelen av celler med LOY, gjennomsnittsforholdet verdiene oppnådd innenfor samme eksperimentelle forhold representerer en omtrentlig refleksjon for omfanget av LOY for de studerte grupper. De gjennomsnittlige Y /X-forhold var vesentlig lavere i colorectal pasienter enn pasienter med prostatakreft. Jo høyere prosentandelen av pasienter med LOY i vår kohort av kreftpasienter er konsistent med de nylige funn som viser betydelig økt hyppighet av kjønnskromosomer monosomies i pasienter med lunge og blærekreft sammenlignet med friske kontroller [33].
Fordi LOY er rapportert å være assosiert med alder, har vi matchet våre kreftpasienter og kontrollere ikke-kreft pasienter med alder og deretter modellert alder og LOY prosent for kreft tilstedeværelse spådommer. Resultatene viste at økt antall personer med LOY i vår kohort av kreftpasienter sannsynligvis ikke påvirket av deres alder.
Den eksakte mekanismen som cellene mister Y-kromosomet er ikke kjent. Én foreslått mekanisme er påvirket av telomerer forkortes under aldring som fører til rivjern ustabilitet og degradering av Y-kromosom, som har kortere telomerer enn autosomer [34]. En annen foreslått mekanisme er relatert til egenskapen av Y-kromosom å replikere sen i S-fase [21], og dermed forkorte av cellesyklusen (og mister Y-kromosom) kunne gi en proliferativ fordel til en sykdom påvirkes organisme. Forskjellige veier kan bli aktivert, noe som fører til forskjellige spredningsfrekvenser og antall av hematopoetiske celler med LOY i ulike kreftformer som reaksjon på signaler fra kreftceller. Variasjon i genomet mellom ulike cancer kan i tillegg modulere responsen av hematopoetiske celler til kreftcellesignaler. Ytterligere bevis for denne foreslåtte mekanismen for signal som induseres LOY er relatert til det faktum at røyking har en forbigående og doseavhengig mutagen virkning på LOY-status [24]. Dessuten er denne mekanismen i overensstemmelse med den foreslåtte påvirkning av endret vev microenvironmental signale på somatisk evolusjon i en aldersavhengig måte [35]. Nylig ble klonal hematopoiesis med somatiske mutasjoner vist seg ikke bare å være mer vanlig hos eldre mennesker, men også for å øke risikoen for hematologiske maligniteter og død [36,37], med muligheten for at total dødelighet skyldes en økt risiko for kardiovaskulær sykdom [36]. Disse studiene analyserte bare single nucleotide varianter og små indels og ikke rapporterer store avvik som Y-kromosom tap. Også store kromosomavvik ( 2Mb) ble av autosomer i DNA fra blodet funnet å være hyppigere blant personer med solide svulster enn i kreftfrie individer [38]. Det ville være interessant å se om forekomsten av LOY, somatiske mutasjoner og /eller visse typer kromosomavvik er knyttet og presentere sammen i samme celler eller celletyper. Hvis helseskade fremmer samtidig forekomst av ulike typer genomiske mutasjoner, kunne lett synlig mosaikk LOY bli en verdifull biomarkør.
I konklusjonen, resultater fra våre case-control studie viste sterk sammenheng mellom kreft tilstedeværelse og mosaikk LOY i perifert blod av mennesker berørt med tykktarm og prostata kreft er de to vanligste solide svulster hos menn. De støtter også de siste resultatene av sammenslutning av LOY i blod med kreftutvikling hos menn.
