Abstract
En roman chemocentric tilnærming til å identifisere kreftrelevante mål er innført. Fra og med en stor kjemisk samling, strategien anvender en liste over små molekyl hardt som følge av en differensial cytotoksisitet screening på tumor HCT116 og normale MRC-5-cellelinjene for å identifisere proteiner assosiert med cancer som kommer ut fra en differensial virtuell mål profilering av de mest selektive forbindelser påvist i begge cellelinjer. Det er vist at denne smarte kombinasjonen av differensial
in vitro Hotell og
i silico
screenings (DIVISS) er i stand til å oppdage en liste over proteiner som allerede er godt akseptert kreft narkotika mål, mens utfyller det med flere proteiner som, målrettet selektivt eller i kombinasjon med andre, kan føre til synergistiske fordeler for kreftbehandling. Den fullstendige listen over 115 proteiner identifisert som å bli truffet unikt ved forbindelser som viser selektive antiproliferative effekter for tumorcellelinjer er gitt
Citation. Flachner B, Lőrincz Z, Carotti A, Nicolotti O, Kuchipudi P, Remez N, et al. (2012) En Chemocentric tilnærming til identifisering av kreft mål. PLoS ONE 7 (4): e35582. doi: 10,1371 /journal.pone.0035582
Redaktør: Steve Horvath, University of California Los Angeles, USA
mottatt: 15 juli 2011; Godkjent: 19 mars 2012; Publisert: 25 april 2012
Copyright: © 2012 Flachner et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra European Comission (CancerGrid, FP-6 LCHC-CT-2006-037559), https://ec.europa.eu/research/fp6/index_en.cfm. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter: Beata Flachner, Zsolt Lőrincz, Sándor Cseh, og György Dorman er heltids betalte ansatte i TargetEx, Dunakeszi, Ungarn, og Miklós J. Szabó og Béla Bertok er heltidsansatte i Amri Ungarn Zrt., Budapest, Ungarn. Jordi Mestres er president i Chemotargets SL. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Kreft er en sykdom av cellen [1]. Denne ganske enkle utsagnet innebærer en enorm kompleksitet når du forsøker å identifisere effektive legemidler mot kreft. En av de store problemene forbundet med kreft forskning er at tradisjonelle mål-rettet strategier blir konfrontert med essentiality av funksjonen til målet i friske celler. Uunngåelig, rettet mot proteiner som har viktige funksjoner vil sannsynligvis føre til kjemiske enheter med smalt terapeutisk vindu og vesentlige toksiske effekter [2]. En ekstra utfordring er ustabil epigenetisk og genetisk status av kreftceller, gjennomgår flere mutasjoner, genet kopi endringer og kromosomavvik som har en direkte innvirkning på effekten av cytostatika på ulike stadier av sykdommen [3]. Alle disse aspektene gjør kreft medisiner ekstremt vanskelig og har ført til dårlige kliniske godkjennings suksess priser sammenlignet med andre terapeutiske områder [2].
Ankomsten av high-throughput cellebaserte cytotoksisitetsassayer åpnet nye perspektiver for kreft oppdagelse [4]. Gjennomføringen av differensial cytotoksisitetstester skjermer markerte avvik fra små molekyl skjermer på forutinntatte individuell protein mål og tillot identifisering av små molekyler potensielt virker gjennom en rikdom av virkningsmekanismer [5], mens viser samtidig selektive antiproliferative effekter i kreftceller sammenlignet med friske celler [6]. Men, som nylig påpekt [1], for de cellebaserte strategier for å ha en sann innvirkning på kreft medisiner, betyr å avdekke målet profilen av bioaktive små molekyler i antiproliferative eller toksisitet analyser er helt nødvendig. I dette henseende, er omfattende proteomikk profilering ofte brukt senere for å identifisere differensielt uttrykte proteiner i kreftcellelinjer som kan forklare den biologiske effekten av lavmolekylære treff [7], [8]. Men profilering av cellulære aktiviteter molekylære bibliotek er både teknisk og logistisk en strevsom oppgave [9] og dermed alternative tilnærminger for rask og effektiv profilering av hundrevis av forbindelser på tusenvis av proteiner er nødvendig.
I de senere årene tilgjengeligheten av en økende mengde protein-ligand interaksjonsdata i det offentlige rom har fremmet utviklingen av ligand-baserte beregningsmetoder som tar sikte på å forutsi affinitet profilen til små molekyler på tvers av flere mål [10]. En tidlig anvendelse av disse tiltakene var prediksjon av den biologiske aktiviteten spekteret av alle små molekyler som finnes i National Cancer Institute database [11]. I det siste virtuelle target profilering ble med hell anvendt for å identifisere nye mål for kjente legemidler [12], for å forutsi den virkningsmekanismen av antimalariamidler oppdaget i en high-throughput-celle-basert skjerm [13], og å foreslå de mål mot hvilke utvalgte forbindelser fra et kjemisk bibliotek bør testes, som fører til identifisering av nye antagonister for alle fire medlemmer av adenosin reseptor-familien [14]. Gitt dagens nivåer av ytelse oppnådd, i form av sensitivitet og spesifisitet, mot eksperimentelt bestemt komplett ligand-protein interaksjons matriser [15], disse metodene er fremstår som en ekte rask og effektivt alternativ til de mer arbeidskrevende proteomikk profilering.
integrering av differensial cytotoksisitet screening og virtuelle mål profilering for identifisering av kreftrelevante mål ble satt ut i praksis innenfor rammen av CancerGrid, et EU-prosjekt under rammeprogram 6 [16]. Detaljer om tilnærming følges og oppnådde resultater er omtalt i de neste avsnittene.
Resultater
For ordens skyld, en oppsummering ordning av den samlede differensial
in vitro
og
i silico
screening (DIVISS) prosess som følges i dette arbeidet er vist i figur 1. Starte med en kjemisk samling på 30.000 forbindelser, differensial cytotoksisitet screening resulterte i identifisering av to sett med lite molekyl treff viser selektiv antiproliferative effekter for tumor og friske celler, henholdsvis, som ved virtuell target profilering førte til slutt til identifisering av en liste over 115 proteiner av potensiell betydning for kreft. Detaljer om resultatene som er oppnådd på hvert trinn i denne romanen chemocentric tilnærming til kreft målet identifikasjon er gitt ved.
High-throughput cytotoksisitet screening
En cellebasert cytotoksisitet screening kampanjen ble utført på en kjemisk samling består av 30.000 ulike molekyler valgt hovedsakelig fra hele Amri katalogen [17]. Single point screening av disse forbindelser ved 50 uM konsentrasjon ble gjennomført i duplikat på en tykktarmskreft HCT116-cellelinjen. Korrelasjonen av de to uavhengige levedyktighet verdier bestemt for hver forbindelse er vist i figur 2a. En gjennomsnittlig Z «faktor på 0,58 ble utledet fra analyse av disse dupliserte data, noe som er en indikasjon på kvaliteten av analysen, og de oppnådde data. Fordelingen av det antall forbindelser som resulterer i forskjellige midlere prosentandeler av cellelevedyktighet er gitt i Figur 2b. Som det kan observeres, nesten 50% av forbindelsene i utgangspunktet hadde ingen effekt på levedyktigheten av de HCT116-celler. Men mest interessant, over 13% av forbindelsene viste bemerkelsesverdig toksiske effekter på HCT116-celler, med levedyktighet verdier på 20% eller lavere. Den cytotoksiske sett av 4,158 forbindelser ble valgt for en oppfølgings dose-respons-screening.
a) Korrelasjon av to uavhengige levedyktighet verdier bestemt for den samme forbindelse og b) fordeling av levedyktighet verdier for den kjemiske bibliotek av 30000 forbindelser.
Differensial cytotoksisitet dose-respons-screening
For å optimalisere vår kapasitet på dose-respons-screening, et mangfoldig sett av 2000 molekyler ble først valgt fra 4,158 cytotoksiske forbindelser identifisert i forrige høy -throughput screening kampanje [18]. Dose-responskurver for både tumor HCT116 og normale MRC-5-celler ble bestemt i duplikat for disse forbindelser 2.000. For å identifisere de små molekyler som har nivåer av giftige på tumorceller betydelig høyere enn de som ble observert på friske celler, forholdet mellom IC
50 verdier oppnådd i MRC-5 celler, IC
50 (MRC-5), og de som er oppnådd i HCT116-celler, IC
50 (HCT116) ble utledet for hver forbindelse. En totalt 230 forbindelser ble identifisert til å være 5 ganger eller mer cytotoksiske i tumorceller enn i friske celler (IC
50 MRC-5 /IC
50 HCT116≥5). En chemotype clustering analyse [19] ble deretter utført på dette første sett av 2,000 forbindelser hvor dose-responsdata ble produsert. En cytotoksisitet anrikning stillingen ble deretter tildelt hver chemotype klynge basert på dets relative tilstedeværelse i settet av 230 forbindelser som viser de selektive antiproliferative effekter på tumorceller. Disse chemotypes som har større enn 20% slaghastighet ble valgt og anvendt for å gjenvinne forbindelsene fra de gjenværende 2158 hvor det bare enkeltpunktmålinger var tilgjengelig. Denne forskyvning mot selektive tumor-cytotoksiske chemotypes førte til identifisering av 150 forbindelser som ble supplert med et ekstra sett av 330 forbindelser tilsettes på basis av diversity kriterier [18]. Dose-respons kurver for begge cellelinjer ble oppnådd i duplikat for disse forbindelser 480, hvorfra et ekstra sett av 35 forbindelsene ble identifisert til å ha cytotoksisk selektivitet for tumorceller i forhold til friske celler. Fullstendig, 2,480 forbindelser gikk gjennom differensial cytotoksisitet dose-respons
in vitro
screening, som fører til identifisering av 265 forbindelser med selektiv cytotoksisitet i svulstceller (figur 1). Overall, 119,520 cytotoksisitetstester datapunkter ble generert, 60 000 fra de primære cytotoksiske screenings på HCT116-celler (30.000 forbindelser i to eksemplarer) og 59,520 fra dose-respons screenings (2,480 forbindelser ved 6 konsentrasjoner i duplikat på to cellelinjer), som representerer en betydelig screening innsats.
distribusjoner av den resulterende gjennomsnittlig IC
50 verdier for alle 2,480 forbindelser på tumor HCT116 og normale MRC-5 celler er illustrert i figur 3a. Det faktum at de fleste forbindelser har vist fast IC
50-verdier under 25 pM er en god indikasjon på gyldigheten av den første screening. I dette henseende, i overkant av 12% av forbindelsene for tumorceller sammenlignet med nesten 26% for normale celler, ga en IC
50 verdi på over 25 pM, mens 25% og 22% av forbindelsene som vist på tumor og normale celler, henholdsvis, returneres en IC
50 verdi under 5 um. Den endelige fordeling av de cytotoksiske forholdstall forbindelsen er gitt i figur 3b, hvor store verdier er knyttet til lovende forbindelser som har en viss grad av selektiv cytotoksisitet i tumorceller sammenlignet med friske celler. Som det kan observeres, de aller fleste av forbindelsene (over 60%) tilbake cytotoksisitets-forhold mellom 0,5 og 2 vil si at de var i utgangspunktet uselektiv mellom tumor og friske celler. Men mest interessant, 711 Forbindelsene (29%) ble funnet å være 2 ganger eller mer cytotoksisk i tumorceller enn i friske celler, med 265 av dem viser cytotoksisitet forhold over 5. I motsetning til dette ble 277 Forbindelsene (11%) funnet å være 2 ganger eller mer cytotoksiske i friske celler enn i tumorceller, med 251 av dem ha cytotoksisitetstester forholdstall under 0,2. Disse to sett med 265 og 251 forbindelser (figur S1 og S2) som viser selektive antiproliferative effekter for kreft og normale celler, henholdsvis, vil bli overført til neste fase av virtuelle mål profilering (figur 1). En likhet analyse (Figur S3) fremhevet mangfoldet av kjemiske strukturer innenfor hvert sett, men også mellom de to settene, et punkt verdt å understreke støtte for fenotypisk screening tilnærminger enn target-rettet strategier for komplekse sykdommer.
a) fordeling av cytotoksisitet (IC50-verdier) av utvalgte forbindelser på HCT116 og MRC5-celler og b) fordeling av den selektive cytotoksisitet mot HCT116. NT betyr «ikke giftig».
Virtual mål profilering
Hver av de to cellelinje selektive sammensatte sett ble behandlet
i silico
mot 4,643 ligand-baserte protein modeller hentet fra offentlig tilgjengelige ressurser [20] – [28] med en validert likhet basert tilnærming beskrevet tidligere [14], [15]. Med hensyn til de 265 selektive tumor cytotoksiske forbindelser, ble minst ett mål samhandling spådd for 173 av dem (65%), noe som reflekterer at den kjemiske plassen definert ved settet av tumor selektive forbindelsene ble skikkelig dekket av små molekyler som finnes i offentlige chemogenomic databaser . For disse forbindelsene, ble til sammen 2.356 molekyl-protein interaksjoner spådd. Av disse ble 818 interaksjoner mellom 139 og 229 molekyler proteiner forutsagt å ha aktiviteter på 1 uM eller bedre (pAct≥6), som betyr at i gjennomsnitt hver tumor selektiv forbindelse ble forventet å potensielt interagere med 6 mål. Til sammenligning ble det i det minste ett mål interaksjon forutsagt 117 av de 251 selektive cytotoksiske forbindelser på normale celler (47%), noe som betyr at 53% av de forbindelser som ble funnet å være utenfor anvendbar domenet definert av små molekyler i offentlig chemogenomic databaser [ ,,,0],15]. For disse forbindelsene, ble totalt 1023 molekyl-protein interaksjoner spådd. Av disse ble 463 interaksjoner mellom 84 molekyler og 160 proteiner spådd å ha aktiviteter 1fiM eller bedre (pAct≥6), noe som resulterer i et gjennomsnittlig antall 5 samspill proteiner per sammensatte.
En komparativ analyse av antatte interaksjoner fra de to celle linjer selektive sammensatte sett tillater å få en bedre innsikt i de proteinene som sannsynligvis er forskjellig relevant for tumorcellelinjer. Resultatene er illustrert i Venn-diagrammet vist i figur 4a, som skjematisk viser den grad av overlapping og særpreg mellom de to mål-lister. I dette henseende ble det funnet at opp til 114 proteiner ble spådd å bli truffet minst en gang av noen forbindelse i hvert sett, med en liste av proteiner som hovedsakelig er sammensatt av G-protein-koblede reseptorer (45%) og enzymer (37% ). I kontrast, ble bare 46 proteiner funnet å være utelukkende rammet av forbindelser med selektiv cytotoksisitet for friske celler, med en fordeling mellom protein familier svært lik den som ble oppnådd tidligere for listen over delte proteiner (41% av G protein-koblede reseptorer og 37% av enzymer). Men mest interessant, en liste over 115 proteiner rammet unikt ved forbindelser med selektiv cytotoksisitet for tumorceller ble identifisert (tabell S1). Analyse av dets sammensetning blant de viktigste protein familier av terapeutisk relevans viser en tydelig differensiert signatur fra de to andre lister av proteiner. Som vist på figur 4b, blir listen i hovedsak består av enzymer (58%) og nærvær av G-protein-koblede reseptorer er redusert i betydelig grad (16%). For å komplettere dette bildet, gir figur 4c klassen fordelingen av de 67 enzymer som finnes i denne listen. En klar bias mot transferaser (43%) er observert, veldig mye i tråd med betydningen dratt til kinaser som terapeutisk mål for kreft [29], [30].
a) Venn-diagram av protein mål spådd for de selektive cytotoksiske forbindelser til HCT116 og MRC-5 cellelinjer; b) fordeling mellom protein familiene til de 115 målene spådd til å samhandle unikt med selektive cytotoksiske forbindelser til kreftceller; og c) fordeling på enzymklasser av de 67 enzymer som er til stede i listen over 115 antatte kreft mål.
Proof of concept
Det kan ikke unnslippe scrutinous øyet av kreftforsker som i listen over 115 potensielle kreft selektive proteiner (Tabell S1) er det to anerkjente kreft mål , nemlig histon deacetylases (HDACs) og varmesjokkprotein 90-alfa (HSP90), som begge er kjent for å bli uttrykt i tykktarmskreft HCT116-cellelinjer [7], [8], og til å meddele tumor selektivitet ved lite molekyl inhibering [31 ], [32]. Følgelig, i et forsøk på å slutte kretsløpet av den DIVISS tilnærming presentert ovenfor, inhibitorer av disse to målene ble anvendt for å eksemplifisere på dette stadium at faktisk selektive antiproliferative effekter kan oppnås på tumor HCT116 og normale MRC-5-cellelinjer benyttet i denne arbeid.
For å oppnå dette, suberoylanilide hydroxaminsyren (Saha) og 17- (allylamino) -17-demethoxygeldanamycin (17AAG) ble valgt som representative pan-HDAC og HSP90-hemmere, henholdsvis. Dose-responskurver for både HCT116 og MRC-5-cellelinjer ble bestemt for de to inhibitorene (fig S4). Resultatene bekreftet at begge forbindelser inhiberte proliferasjonen av HCT116-celler på en doseavhengig måte, samtidig som de har liten eller ingen effekt på MRC-5-celler. Spesielt IC
50 verdier av Saha og 17AAG på HCT116-celler var 0,64 uM og 0,2 uM, henholdsvis, noe som resulterte i 781 og 93 ganger høyere selektivitet, henholdsvis, i forhold til den antiproliferative effekt på MRC-5-celler. Disse observasjoner gir bekreftelse på evnen av den DIVISS tilnærming for å identifisere kreft relevant mål.
Vi sjekket hvorvidt også innenfor settet av 265 forbindelser som viser selektiv antiproliferative effekter på tumorcellelinjer der var enhver forbindelse som kunne ha vært testet på et utvalg av tykktarmskreft cellelinjer og som screening data var også tilgjengelig i den offentlige sfæren. Mye til vår overraskelse fant vi eksperimentelle data i pubchem [23] for åtte forbindelser som også var til stede i vår tumor selektiv sett (tabell S2). Blant disse er fem forbindelser som rapporteres å ha affinitet for det aminoksidase flavin-inneholdende B-enzym (MAO-B), et mål til stede i listen over 115 mulige kreftfrem relavant proteiner (Tabell S1). Men mest interessant, en av dem, NSC680350 (CID 387 030), ble rapportert å ha en IC
50 av 80 nM for MAO-B, i god overensstemmelse med våre spådommer. I tillegg ble det også testet ved flere humane tumorcellelinjer, inkludert seks koloncancercellelinjer. Blant dem, pGI50 verdi som er rapportert i pubchem for colon HCT116-cellelinjer (4,64) er, innenfor de variasjonsgrenser for denne type av eksperimenter, i god overensstemmelse med den pGI50 verdien oppnådd i dette arbeidet for den samme type cellelinjer (5,19) . Dose-respons kurven av cytotoksisitet av NSC680350 på HCT116 cellelinjer i dette arbeidet, og en oppsummering av alle tykktarmskreft data som finnes i pubchem for denne forbindelsen er gitt i Figur S5.
Diskusjoner
Bekreftelse av den potensielle betydning for kreft i listen over 115 proteinene identifisert som å være rettet utelukkende av tumor selektive forbindelser ble utført ved to uavhengige perspektiver. På den ene side ble alle 115-proteiner scoret på basis av nylig utledet onkogen sannsynligheter (OncoScores) og sjekket for tiden tilgjengelige eksperimentelle data på den opp- og ned-regulering i colon cancerprøver [33], [34]. På den annen side har vi brukt alle narkotika-target interaksjonsdata fra offentlige ressurser [20] – [28] for å rangere for alle legemidler basert på antall kjente mål i listen over 115 proteiner og se etter om kreft var den primære indikasjon blant de beste rangerte. Resultatene gir god støtte for bruk av DIVISS tilnærming for å identifisere kreftrelevante mål.
OncoScores for alle 115 proteiner målrettet av tumor selektive forbindelser ble hentet fra nettstedet CGPrio [34]. For å vurdere om denne listen av proteiner er beriket med sannsynlige onkogener med hensyn til andre lister av proteiner, ble OncoScores også beregnet for alle de 46 proteinene målrettet ved vanlige selektive forbindelser og de 114 proteinene som deles av de to sett av celle-linje selektive forbindelser. Trender av den kumulative prosentandelen av proteiner med OncoScores over en viss sannsynlighetsverdi innenfor hver av listene, er vist i figur 5. Som det kan observeres, er det funnet at 36,5% av de 115 proteinene målrettet av tumor-selektive forbindelser har en onkogen sannsynlighet oven 0,7 og at under den samme OncoScore cutoff, er denne prosentandelen vesentlig høyere enn 8,7% og 19,3% av de 46 proteinene målrettet ved vanlige selektive forbindelser og de 114 proteinene som deles av de to sett av forbindelser, henholdsvis. Etter å ha gitt bevis for at dette valget av 115 tumor selektive proteiner som er beriket med antatte onkogener, den IntOGen plattformen [33] ble deretter brukt til å kontrollere hvorvidt en hvilken som helst protein fra listen er i tillegg kjent for å være betydelig endret (korrigert p-verdi 0,05 ) i form av opp- eller nedregulering i tykktarm kreft. Totalt 29 av disse proteiner (25%) kan faktisk bli bekreftet å være vesentlig endret i tykktarmskreft, hvorav 10 har en OncoScore over 0,7. De OncoScores og reguleringskarakter for hele listen over 115 kreft selektive proteiner er gitt tabell S1.
NA samler alle proteiner som onkogene sannsynlighetene ikke var tilgjengelig fra CGPrio [34].
Den undergruppe av 42 tumor selektive proteiner med OncoScore høyere enn 0,7 er gitt i tabell 1. Ikke overraskende, er dens sammensetning sterkt forspent av proteinkinaser (52%), men det er også et viktig representasjon (21%) av transkripsjonsfaktorer. Nevne er imidlertid det faktum at et par G protein-koblede reseptorer (GPCR) finnes i dette overveiende sannsynlig onkogen undergruppe, nemlig D (1A) dopamin reseptor (DRD1) og sfingosin 1-fosfat-reseptor 1 (S1PR1) . GPCRs har tradisjonelt vært ansett som de viktigste målene for sykdommer i sentralnervesystemet. Men mest interessant, relevansen av GPCRs i kreft narkotika funnet ble revisited nylig og potensielle rolle S1PR1 spesielt fremhevet [35].
En nærmere titt på topp-20 rangert proteiner tilstede i tabell 1 viser at listen inneholder proteiner som kan være noe uventet fra synspunktet sitt forhold til tykktarmskreft. For eksempel til androgen (AR) og østrogen (både ESR1 og ESR2) nukleære hormonreseptorer er kjent være relevant i prostata og brystkreft, og alfa-type plate avledet (PDGFRA) og epidermal (EGFR) vekstfaktorreseptorer er anerkjente angiogenese faktorer. Men nyere studier tyder på en rolle i intestinal kreftutvikling for kjernereseptorer i generelle [36] og vekstfaktor-reseptorer [37], inkludert nøyaktig AR [38], ESR1 [39], ESR2 [40], PDGFRA [41] og EGFR [ ,,,0],42]. PDGFRA spesielt er også kjent for å være betydelig nedregulert i colon cancer [33]. I tillegg er ytterligere bevis eksisterer i litteraturen av legemidler som målretter primært noen av de mål og som har en virkning på proliferasjonen av humane kolorektale tumorcellelinjer, inkludert HCT116 [40], [43]. Blant dem er raloksifen en høy affinitet binder til både ESR1 og ESR2 og har blitt rapportert å hemme HCT116 cellevekst på en doseavhengig måte [40] og afatinib er en potent EGFR-inhibitor som nylig ble vist å hemme veksten av HCT116 celle linjer med en IC
50 verdi av 1,62 mikrometer [43]. Disse eksemplene gir rikelig bibliografisk støtte til relevans i tykktarmskreft for noen av de proteinene som ville vært ellers helt oversett.
Det kan også overraskelse at tiden anerkjente kreft mål, for eksempel HSP90, er ikke til stede i tabell 1. i dette spesielle tilfellet er målet faktisk inneholdes i en fullstendig liste over 115 proteiner er gitt i tabell S1, men med en lav OncoScore = 0,023. Det er derfor verdt å understreke her at CGPrio [34] er en maskinlæringsmetode basert på differensial egenskapene til kjente kreftgener og under forutsetning av at gener med tilsvarende egenskaper (inkludert sekvens bevaring, proteindomener og interaksjoner, og regulatoriske data) til kjente kreftgener er mer sannsynlig å bli involvert i kreft. Den brukes her som en prioritering metode, som det har vist seg at en stor andel av nye kreftgener har høye CGPrio sannsynlig [33], [34], men det betyr ikke at absolutt alle kreftgener dele disse egenskapene, og dermed kan det vel være noen
bona fide
kreft mål, for eksempel HSP90, med en lav CGPrio sannsynlighet. I denne forbindelse, den lave OncoScore innhentet for HSP90 betyr bare det, på bakgrunn av dagens kunnskap om kreftgener, betyr HSP90 ikke dele eiendommer med resten av kreftgener for hvilken informasjon som er tilgjengelig. Samlet utgjør disse resultatene understreker potensialet anvendelsen av DIVISS tilnærming som en komplementær strategi til identifisering av kreftrelevante mål.
BioCarta ressursen [44] ble så brukt til å utføre en analyse av hovedveiene i som disse 42 svært sannsynlige onkogener er involvert. Totalt 131 banene ble hentet frem, med 68 av dem (52%) som har to eller flere proteiner og bare 9 (7%) inneholdende fem eller flere proteiner. Sistnevnte gruppe består hovedsakelig av signalveier. Blant dem, inneholder MAPKinase signalveien sju av de sannsynlige onkogener, nemlig BRAF, MAP2K1, MAP3K8, MAPK10, RAF1, STAT1, og TGFBR1, og ERK1 /Erk2 MAPK signalveien involverer seks av dem, nemlig EGFR, MAP2K1, PDGFRA, RAF1, SRC, og STAT3 (se tabell 1). De gjenværende 7 trasé er det bioaktive peptid induserte, EGF og PDGF signalveier, signaleringen av hepatocytt-vekstfaktor-reseptor, og de definerer rolle i ErbB2 i signaltransduksjon og onkologi, den CARM1 og regulering av østrogenreseptoren, og sumoylation av RANBP2 regulerer transkripsjonen undertrykkelse, alle involverer fem av de sannsynlige onkogener (tabell 1). Koblingen mellom noen av disse banene og kreft er allerede anerkjent i tidligere studier [45], [46].
I de siste årene, hvor mye offentlig tilgjengelige
in vitro
data på interaksjon av medikamenter med flere proteiner har økt dramatisk [20] – [28]. Analyse av disse dataene har avdekket at de fleste kreftlegemidler er multitarget agenter snarere enn selektive molekyler [47]. Følgelig tok vi en liste over 115 mål rammet av selektive forbindelser på HCT116 og utført et søk etter disse stoffene som, basert på tilgjengelige affinitet data bestemmes eksperimentelt [20] – [28], vil vise minst mikromol affinitet på flest av disse målene. Figur 6 samler resultatene oppnådd for de 20 medikamenter som har minst mikromolar affinitet til mer enn 5 tumor selektive proteiner. Bemerkelsesverdig, 18 av disse stoffene har kreft som sitt primære indikasjon, 4 av hvilke mål hovedsakelig HDACs, mens den andre 14 har ulik affinitet profiler på et bredt spekter av kinaser. Tilstedeværelsen av klorpromazin og amitriptylin i denne listen, angitt for psykose og depresjon, henholdsvis, og målretting hovedsakelig GPCR stedet for HDACs eller kinaser, kan komme som en overraskelse på dette stadiet. Men i tråd med det som tidligere ble nevnt om den nye oppfatningen av GPCR i kreft [35], siste rapportene tyder på at klorpromazin, potensielt gjennom sin handling på flere kreft selektive GPCRs kan endre tilstrømningen egenskaper av membraner og at denne egenskapen gjør det en lovende kjemosensibiliserende forbindelse for å øke den cytotoksiske effekt av tamoksifen, en antagonist av østrogenreseptoren, tilstede også i listen av 115 tumor selektive proteiner [48]. Fra et stoff perspektiv, disse resultatene gir ytterligere støtte til relevansen for kreft i 115 proteiner identifisert.
Bare slektskap over 1 mikrometer blir vurdert. Fargekoding reflekterer pAffinity områder: hvit 6-7; lysegrå 7-8; mørk grå 8-9; black 9. Fargekoder for målene refererer til HDACs (gul), kinaser (oransje), og andre (grønn).
Det er to gjenkjennelige utvidelser til den versjonen av DIVISS tilnærmingen presenteres her. Den første åpenbare forlengelse er i bruk av andre cellelinjer. I denne studien, har HCT116 og MRC-5-cellelinjer blitt tatt som modeller av tumorer og friske cellelinjer, henholdsvis. Det finnes imidlertid tallrike alternative humane tumorcellelinjer som kan brukes i stedet, og disse kan i sin tur bli differensielt sammenlignet med flere friske cellelinjer, så vel [49]. Følgelig forskjells kreft skjermer på hver spesiell kombinasjon av svulsten og sunne cellelinjer vil i prinsippet føre til ulike, men komplementære, lister over kreftrelevante mål. Den andre potensielle utvidelsen er innenfor dekningsområdet til større kjemiske områder, et aspekt som er iboende til noen screening kampanje. Denne studien fokuserer på et variert utvalg av 30.000 molekyler fra Amri katalogen, i dag inneholder over 240.000 forbindelser. Størrelsen og arten av den kjemiske biblioteket brukes i differensial cytotoksisitetstester skjermene bestemmer i vesentlig antall og mangfold av små molekyl treff identifisert og de til slutt definere hva slags mål som, ved hjelp av
i silico
rettet mot profilering, vil selektivt knyttet til hver cellelinje.
Konklusjoner
Cell systemer er implisitt robust og selektivt handle på en bestemt mål er kanskje ikke den mest effektive måten for å modulere eller forstyrrer dem som systemet kan alltid finne måter å kompensere for den selektive forstyrrelse innarbeidet. I stedet sikte på flere viktige mål på tumorceller kan være en mer effektiv strategi for å lage mer vanskelig for cellesystemet for å kompensere for alle perturbasjoner innført. Faktisk, de siste bevisene indikerer at de fleste kreftlegemidler oppnå deres
in vivo
effekt gjennom modulering av flere mål i stedet for selektiv interaksjon på et enkelt mål. Det store spørsmålet blir da å definere viktig protein signaturen til hver krefttype, så det kan bli grundig behandlet av nye kreft terapeutiske midler [50]. Den DIVISS strategien presenteres her representerer en ny chemocentric tilnærming til identifisering av kreftrelevante narkotika mål som utfyller effektivt andre etablerte bioinformatikk og funksjonelle tilnærminger [51], [52] og dermed kan bidra til å øke vår tillit på potensielle narkotika mål [53] .
Materialer og metoder
Screening Bibliotek
CancerGrid konsortiet hadde privilegert tilgang til hele kjemisk katalogen på Amri [17], som for tiden inneholder 241.000 forbindelser og fant spesielt relevant for drug discovery formål i en komparativ analyse av 23 leverandørdatabaser [54].
