Abstract
Bakgrunn
Radon og arsen er etablert lunge kreftfremkallende. Vi undersøkte sammenslutning av kumulativ eksponering for disse kreftfremkallende med NOTCH1, HIF1A og andre kreftspesifikke proteiner i lungevev fra uran gruvearbeidere.
Metodikk /hovedfunnene
Parafin-embedded vev av 147 gruvearbeidere ble tilfeldig valgt fra en obduksjon depot etter type lungevevet, bestående adenokarsinom (ADCA), plateepitelkarsinom (SqCC), småcellet lungekreft (SCLC) og kreft-fri vev. Innenfor hvert stratum, vi i tillegg stratifisert ved lav eller høy grad av eksponering for radon eller arsen. Levetid eksponering for radon og arsen ble beregnet ved hjelp av en kvantitativ jobb-eksponering matrise utviklet for uran gruvedrift. For 22 kreftrelaterte proteiner, ble immunhistokjemiske score beregnet ut fra intensiteten og prosentandel av fargede celler. Vi utforsket sammenslutninger av disse score med kumulativ eksponering for radon og arsenikk med Spearman rang korrelasjonskoeffisienter (r
s). Begrensning av eksponering ble assosiert med en oppregulering av NOTCH1 (radon r
s = 0,18, 95% KI 0,02 til 0,33, arsen: r
s = 0,23, 95% KI 0,07 til 0,38). Videre undersøkte vi om disse kreftrelaterte proteiner kan klassifisere lungekreft ved hjelp av overvåket og styrt klassifikasjon. MUC1 klassifisert lungekreft fra kreft-fri vev med en strykprosent på 2,1%. En to-protein signatur diskriminert SCLC (HIF1A lav), ADCA (NKX2-1 høy), og SqCC (NKX2-1 lav) med en strykprosent på 8,4%.
Konklusjon /Betydning
Disse resultatene tyder på at stråling-sensitive protein NOTCH1 kan være oppregulert i lungevev fra uran gruvearbeidere etter nivå av eksponering for lungekreftfremkallende. Vi evaluerte en tre-protein signatur som består av et fysiologisk protein (MUC1), en cancer-spesifikk protein (HIF1A), og en avstamning-spesifikk protein (NKX2-1) som kan diskriminere lungekreft og dens store subtyper med en lav feilrate .
Citation: Pesch B, Casjens S, Stricker jeg, Westerwick D, Taeger D, Rabstein S, et al. (2012) NOTCH1, HIF1A og andre kreft-relaterte proteiner i lungevev fra uran Miners-Variasjon av eksponerings og Undergruppe av lungekreft. PLoS ONE 7 (9): e45305. doi: 10,1371 /journal.pone.0045305
Redaktør: Ramon Andrade de Mello, Universitetet i Porto, Portugal
mottatt: 20 april 2012; Akseptert: 21. august 2012; Publisert: 17.09.2012
Copyright: © Pesch et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av den føderale kontoret for strålevern, Neuherberg, Tyskland, gi StSch 4528. de bevilgende myndighet hadde ingen regel i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Konkurrerende interesser : forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i Øst-Tyskland, ble omfattende uran gruvedrift foretatt for den sovjetiske atomindustrien fra 1946 til 1990 [1].. Dårlige arbeidsforhold i den såkalte Wismut gruveselskapet har ført til svært høye nivåer av eksponering for ioniserende stråling [2]. Eksponering for arsen forekom i noen gruver avhengig av metallinnholdet i malmen.
A omfattende jobb-eksponering matrise (JEM) ble utviklet for kvantitativ vurdering av eksponering for radon, arsen, og kvartsstøv basert på omfattende målingene [3]. Den største enkelt kohort av uran gruvearbeidere ble etablert som viser en doseavhengig økt risiko for lungekreft ved radoneksponering [4], [5].
Biologisk forskning på stråling-indusert kreftutvikling har vært fokusert på skade av genomet. Så langt har tilgjengelige resultatene ikke konsekvent foreslå en radon-spesifikk mutasjon av
TP53 product: [6]. Men lite er kjent om andre gener og om eksponering for stråling kan være relatert til kreftspesifikke proteiner: Thyroid kreftformer fra Tsjernobyl vev depotet er kontrollert for å detektere stråling spesifikke protein signaturer [7], [8], og stråling har vært assosiert med
NOTCH1
mutasjoner i utvikling av lymfomer [9].
det kan bli antatt at strålings virker på gener som er utsatt for ustabilitet og aktivert i kreft-assosiert trasé som
NOTCH1
. Vi tok fordel av en unik vev oppbevaringssted for Wismut gruvearbeidere som hadde blitt åpnet for forskning etter den tyske gjenforeningen [10] for å utforske proteinmønster i lungevevet. Den statistiske analysen av disse dataene viste en dreining mot småcellet lungekreft (SCLC) og plateepitelkarsinom (SqCC) på bekostning av adenokarsinom (ADCA) med økende eksponering for radon eller arsen [11], [12]. En enda sterkere forskyvning av eksponeringsnivået ble observert for røyking i en stor samleanalyse av lungekreft studier [13]. Her fortsetter vi vår forskning på de observerte eksponeringsrelaterte endringer i fordelingen av undertyper av lungekreft ved å utforske proteinmønster. SCLC og SqCC synes å oppvise en høyere «stemness» enn AC følge en større skade på lungen arkitektur. Vi hypotese derfor at kandidat proteiner assosiert med stemness oftere uttrykt i SCLC og SqCC enn i ADCA eller kreft-fri lungevevet. Spesielt vi undersøke 1) om vi kan oppdage en sammenslutning av yrkesmessig eksponering for radon eller arsen med uttrykk for kandidat proteiner, 2) hvis vi kan diskriminere de undertyper av lungekreft med disse proteinene, og 3) hvis påvirkninger av eksponering legge til diskriminering av de store undergrupper av lungekreft.
Materialer og Metoder
Studiedesign
En kvantitativ jobb-eksponering matrise ble brukt til yrkes data av uran gruvearbeidere med lungevev i Wismut obduksjon depotet. Kumulativ radon eksponering ble gitt i arbeidsnivå måneder (WLM), som tidligere beskrevet [12]. Vi stratifisert 1000 WLM for høy og ved 500 WLM for lav radoneksponering. Kumulativ luften arsen eksponering ble vurdert som tidligere beskrevet [11] og klassifisert som høy ved 100 ug /m
3 år, og som ved lav 50 ug /m
3 år. Cut-offs var basert på fordelingen av eksponeringsvariablene i gruvearbeidere med arkivert lunge vevsprøver og på tilgjengeligheten av vevsprøver for sjeldne kombinasjoner, som lav radon og høy arsen eksponering.
Vi søkte på Wismut obduksjon depotet etter tilgjengelige lunge vevsprøver av uran gruvearbeidere med en markert kontrast i eksponering for radon og arsenikk. Ti mannlige gruvearbeidere hvert ble tilfeldig valgt fra databasen til depotet innen 16 lag av en ortogonal studiedesign. Stratifisering ble utført ved kombinasjoner av lav eller høy eksponering for radon og arsenikk i fire grupper med 40 gruvearbeidere hver, enten kreft-fri eller med ADCA, SqCC, eller SCLC. Informasjon om silikose, lungekreft, og yrkesmessig eksponering ble hentet fra databasen av arkivet [14]. Røyking status kunne klassifiseres som alltid eller aldri for 119 gruvearbeidere fra sysselsetting poster og medisinske dokumenter av Wismut arkiver. Denne forskningen, inkludert etiske problemstillinger, med historiske vevsprøver fra døde uran gruvearbeidere ble godkjent av den tyske regjeringen i en direkte avtale med våre institutter signert 29. juli ble 2003. studie basert på anonyme vevsprøver og gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen.
Tre tyske patologer omklassifisert lungekreft av arkiv vev ifølge WHO klassifisering [15], [16]. Vi hentet prøver der minst to av patologer var i avtalen og ekskludert blandingsformer for forbedring av klassifiseringen. Prøver som var tilgjengelig for 146 av 160 pasienter tilfeldig fastslås fra databasen. Et ekstra sett med 15 prøver ble valgt for validering. En blind lesing av de nylig genererte lysbilder (ved IS og DW) bekreftet tidligere histologiske klassifikasjoner.
Immunhistokjemisk analyse
På grunn av utbredelsen av tuberkulose i gruvearbeidere vevsprøver gikk langsiktig fiksering i formalin. Degradering av RNA ved formalin hindret et søk etter RNA uttrykk signaturer ved screening teknikker som DNA-mikromatriser. Imidlertid innledende forsøk indikerte at immunhistokjemi var fremdeles anvendelig for mange prøver [17]. Av den grunn har vi valgt 30 proteiner fra litteraturen som eventuelt i forbindelse med lungekreft (for eksempel EGFR, NKX2-1), lunge utvikling og avstamning bestemmelse (f.eks NOTCH1), lunge fysiologi (f.eks SFTPC, MUC1), vev-omforming etter eksponering for radon (f.eks MMP2), eller preferanse for arsen for cytokeratins (KRT5, KRT14). Immunhistokjemiske analyser kan bli etablert for 22 proteiner (supplerende Tabell S1). For akt1, ATM, CDKN2A, ERCC2, ILK, NFKB1, PTEN, og WIF flekker kunne ikke opprettes med den arkiverte materialet. Microarray (TMA) kan ikke anvendes på grunn av de uvanlige mekaniske egenskaper av Wismut parafin materiale, som var meget sprø og egner seg ikke i punching rørene som brukes sammen med TMA maskinen. Derfor ble snittene på 4 um kuttet fra individuelle formalinfikserte parafininnstøpte prøver og montert på aminopropyltrietoksysilan lysbilder. Alle snittene ble deparaffinized og rehydrert i graderte alkoholer (100%, 96% og 70%). Antigen gjenfinning for immunfarging ble utført ved å varme opp prøvene i citrat-buffer (pH 6,0). Endogen peroksidaseaktivitet ble hemmet, ikke-spesifikk binding ble blokkert. Snittene ble inkubert med primære antistoffer i 10 minutter til 12 timer over natten ved romtemperatur. Inkubasjonstid og fortynning var antistoff-spesifikke. Fortynninger er oppført i tabell S1. For eksempel, fortynnet vi 1:50 for monoklonale antistoffer HIF1A (Thermo Scientific, Frankfurt, Tyskland) og MUC1 (Zytomed, Berlin, Tyskland), og 1:1000 for NOTCH1 (Zytomed). Snittene ble deretter inkubert med biotinylert sekundært antistoff i 10-60 minutter. En endelig inkubering med streptavidin-peroksydase ble utført ved romtemperatur i 5-10 minutter. Visualisering av antistoffene ble oppnådd med 3,3′-diaminobenzidin eller 3-amino-9-etylkarbazol i 5-10 minutter. Kontra ble gjort med Mayers hematoksylin (DAKO, Glostrup, Danmark). Negative kontroller ble utført ved å utelate det primære antistoff. Beising intensitet og andelen av farget epitelceller i fibrose-frie regioner ble blindt og uavhengig evaluert av to patologer (I.S., D.W.). Prosentandelen av celler i intensitet grupper (ingen, svake, moderate eller sterke) ble vektet med faktorer 0, 1, 2 eller 3, henholdsvis, og kumulert i en poengsum for hvert lysbilde, separat for membranen, cytoplasma eller kjerne . Supplemental Figur S1 viser farging av HIF1A og MUC1 av subtype av lungekreft og Figur S2 viser farging av NOTCH1 i kreftvev (SqCC) fra en gruvearbeider med høy eksponering for radon og arsenikk.
Statistical Analysis
Utvalgsstørrelsen størrelsen~~POS=HEADCOMP var begrenset av tilgjengeligheten av vevsblokker med tilstrekkelig kontrast i eksponering for radon og arsenikk. Spearman rank korrelasjonskoeffisienter (r
s) ble beregnet med 95% konfidensintervall (KI) for å utforske assosiasjoner mellom flekker score og med eksponering eller alder. Klassifisering metoder ble brukt på resultatet satt til å evaluere subtype av lungekreft eller eksponeringsnivået ved hjelp av R [URL: www.R-project.org], SAS /STAT og SAS /IML programvare, versjon 9.2 (SAS Institute Inc., Cary NC), og Utforsker, versjon 1.60 [18]. På grunn av skjevhet, ble parametriske metoder brukt til logg-transformerte data som ln (poengsum + 1). Deres korrelasjon struktur ble videre undersøkt med SAS prosedyren FACTOR. Hierarkisk clustering ble utført ved hjelp av Pearson korrelasjon og gjennomsnittlig kobling i Utforsker, og med SAS prosedyren CLUSTER hjelp euklidske avstand tiltak og gjennomsnittlig kobling. Protein profiler ble utforsket med klassifisering og regresjon Tre Algorithm (CART) som implementert i rpart bibliotek av R (i henhold til Therneau og Atkinson) ved hjelp av en leave-one-out kryssvalidering.
Resultater
kjennetegn på studiegruppene
Tabell 1 viser egenskapene til de 146 uran gruvearbeidere konstatert for de 16 studiegrupper. Alder varierte fra 48 til 87 år. Flertallet av gruvearbeidere var røykere (95% i lunge krefttilfeller, 88% i kreftfrie gruvearbeidere). Silikose var utbredt i 37% av gruvearbeiderne med og i 64% av gruvearbeiderne uten lungekreft og forbundet med en høyere kvartsstøv eksponering (median 20,9
vs
. 13,4 mg /m
3 år, p 0,0001). Kumulativ eksponering for kvartsstøv korrelert sterkere med eksponering for radon (Spearman korrelasjonskoeffisient r
s = 0,78, 95% KI 0,71 til 0,84) enn med eksponering for arsen (r
s = 0,31, 95% KI 0.16- 0,45).
foreninger mellom Marker Poeng
uttrykk mønster av kreftrelaterte proteiner viste sterke assosiasjoner mellom 22 markører. Disse foreningene holdt seg relativt stabil når ytterligere stratifiseringsinnretnings av eksponering (supplerende tabell S2). Tre faktorer ble ekstrahert fra korrelasjonsmatrise som kunne tilskrives HIF1A, MUC1, og NKX2-1, henholdsvis (data ikke vist). Tabell 2 viser de Spearman korrelasjonskoeffisienter av resultatet av HIF1A, MUC1, og NKX2-1 med de andre markører i alle vevsprøver. I tillegg presenterer vi korrelasjonene med NOTCH1 som kandidat for eksponeringsrelaterte effekter. Lignende foreninger ble funnet hvis begrenset til kreft vev (data ikke vist). HIF1A uttrykket var forbundet med NOTCH1 (r
s 0,73, 95% KI 0,65 til 0,80), erbB2 (r
s 0,58, 95% KI 0,46 til 0,68) og andre proteiner unntatt MUC1 og NKX2-1. MUC1 og NKX2-1 var negativt korrelert med kreftmarkører som TP53, VEGFA, eller KIT. NOTCH1 og ErbB2 korrelert omvendt proporsjonalt med NKX2-1 (r
s-0,31, 95% CI-0.45 – -0,15 og -0,30, 95% CI-0,44 – -0,14). Men viste ingen sammenheng med MUC1
Protein Expression ved eksponering for radon og arsenikk
Opplysning Tabell S3 viser fordelingen av positivt farget prøver etter nivå av eksponering for radon og arsenikk. I lungevev fra uran gruvearbeidere med høy eksponering for både kreftfremkallende, oppregulering av kreftrelaterte proteiner var mer vanlig enn i gruvearbeidere med lav eksponering. Sju av 18 cytoplasmatiske proteiner ble oftere farget (≥15%) i de høye utsatte vevsprøver, blant disse ErbB2 og NOTCH1. Ingen av prøvene fra lavt utsatt gruvearbeidere hadde en lignende fraksjon (≥15%) av farget prøvene i overkant av høy eksponering gruppe.
Tabell 3 (valgt proteiner) og supplerende tabell S4 (alle proteiner) viser korrelasjonen av flekker score med kumulativ eksponering for radon (vurdert som WLM) og arsen i alle prøvene og stratifisert ved lungekreft. Oppregulering av kreft-relaterte proteiner ble hyppig observert med økende eksponering til radon i lunge-kreft-vev, men vi har oppdaget noen betydelig nedregulering. Radoneksponering korrelert videre med TP53 i kreft-fri vev (r
s 0,40, 95% KI 0,09 til 0,63). Effekten av eksponering for arsen på farging score var mindre klar. ErbB2 og NOTCH1 viste en oppregulering i lunge-kreft vev med økt eksponering for både kreftfremkallende, men ingen flekker eller en manglende tilknytning til eksponering i kreftfrie prøver.
Farging Resultater av undertype av Lung kreft
Tabell 4 viser fordelingen av positivt farget prøver av store subtype av lungekreft og kreft-fri vev. De fleste lysbilder fra kreft-fri vev manglet uttrykk for CCND1, CD44, CDH1, EGFR, erbB2, KIT, keratin, NOTCH1, PAK1, PTGS2, SNAI1, og VIM men viste farging av MUC1, HIF1A, NKX2-1, SFTPC, og STAT3 , som også ble funnet i ADCA. Membran farging av MUC1, SFTPC i cytoplasma, og mange andre markører ble ofte mangler i SCLC. ADCA og SqCC delt signaturer, inkludert ErbB2, KIT, MMP2, PTGS2, EGFR, og VEGFA. KRT5 og KRT14 oftere uttrykt i SqCC enn i ADCA, mens NKX2-1 manglet.
Classification of Protein Patterns ved Undergruppe av Lung Cancer
Figur 1 viser CART klassifisering av lungekreft i alle vevsprøver og Figur 2 viser gruppering av kreft vevsprøver av store histologisk subtype. Farging av MUC1 (membran), HIF1A (cytoplasma), og NKX2-1 (nucleus) klassifisert kreft av subtype og kreft-fri lungevev med en strykprosent på 11,0%. Høyere MUC1 uttrykk i membranen diskriminert normalt vev fra kreft (strykprosent 2,1%). HIF1A ble uttrykt i NSCLC men mindre i SCLC, mens NKX2-1 manglet i SqCC. HIF1A og NKX2-1 klassifiseres de store undergrupper av lungekreft med en strykprosent på 8,4%. EGFR og VEGFA klassifisert NSCLC
vs
. SCLC med en strykprosent på 10,3% og ADCA
vs
. SqCC med 19,1%. Vi bekreftet to-protein signatur for diskriminering av de store undertyper av lungekreft med 15 ekstra prøver hentet fra arkivet. Alle fem SCLC tilfeller viste en meget svak eller mangler farging av HIF1A, og alle fem ADCA tilfeller ble presentert med høy NKX2-1 score som var null i SqCC eller lav i SCLC.
ved hjelp av immunhistokjemiske score av 22 kandidat proteiner i 146 vevsprøver fra uran gruvearbeidere. Farging av mucin 1 (MUC1) i membranen, hypoksi-induserbar faktor 1 α (HIF1A) i cytoplasma, og NK2 homeobox 1 (NKX2-1) i kjernen resulterte i en tre-protein klassifikator med en feilrate på 11,0% .
eksponering for radon eller arsen kunne ikke klart påvist i 22-protein signaturer, med en strykprosent på 62,6% i kreftvev og 57,5% i alle prøvene (data ikke vist ). Feilrater mellom 37% og 39% ble funnet for røyking og silikose, henholdsvis. Det er viktig å merke seg at de fleste gruvearbeiderne var røykere, og farging ble undersøkt i fibrose-fri deler av vevsprøver.
Diskusjoner
Lungekreft var en vanlig yrkessykdom i tyske uran gruvearbeidere med en økt risiko for radoneksponering [4]. Økende eksponering for radon eller arsen var assosiert med en dreining mot SCLC eller SqCC på bekostning av ADCA [11], [12]. Dette reiste spørsmål om eksponeringsrelaterte endringer kan påvises i uttrykk mønstre i lungene til gruvearbeiderne. Vi observerte en oppregulering av kreft-relaterte proteiner, inkludert NOTCH1, med økende kumulativ eksponering for radon eller arsen, men kunne ikke oppdage et ekstra effekten av eksponering på svært forskjellige mønstre av proteiner av de store undertyper av lungekreft. Et stramt korrelasjon struktur mellom flekker score avdekket tre proteiner som fungerte som gode diagnostiske classifiers. MUC1 diskriminert kreft-fri vev fra lungekreft. HIF1A og NKX2-1 diskriminert de store undergrupper med lav strykprosent.
Korrelasjonen av NOTCH1 uttrykk med eksponering for radon er i tråd med eksperimentelle resultater.
NOTCH1
, et stort gen som omfatter 37 exoner, er utsatt for strålingsinduserte mutasjoner som kan bidra til T-celle-lymphomagenesis [9], [19]. Oppregulering av HAKK ble også observert etter bestråling av embryoniske nyreceller [20], og ned-regulering gjengitt glioma stamceller mer følsomme for stråling [21]. Mindre er kjent om NOTCH1 i lunge krefttilfeller med stråling. I vår studie, NOTCH1 var konstitutivt aktiv i de fleste NSCLC prøvene, men mindre i SCLC og mangler i kreft-fri vev.
NOTCH1 ble også oppregulert i lungekreftprøver fra uran gruvearbeidere med høy eksponering for arsen. Dette kan delvis skyldes en moderat korrelasjon mellom arsen og radon. Keratins har dukket opp som et aktuelt mål av arsen [22]. Mens cytokeratins bidratt til spesifikk farging av SqCC de ikke viser en ytterligere preferanse for arsen eksponering.
NOTCH1 korrelert med uttrykket av ulike andre kreftrelaterte proteiner som HIF1A men ikke med MUC1 som en markør for normal lunge fysiologi. Slimproduksjon er en primær partikkel-forsvarsmekanisme i luftveiene [23]. Nedregulering av membranbundne MUC1 diskriminert kreft-fri vev fra kreftvevet. Dette støtter synet at endringer i mucin biosyntese kan tjene som en svulst markør [24].
Behandling avgjørelse av lungekreft hviler vanligvis på kategoriseringen i NSCLC og SCLC. I vår studie, de vanlige benyttede markører VEGFA og EGFR separert begge linjene, men var av begrenset verdi for ytterligere å diskriminere mellom ADCA og SqCC. Begge enhetene har vist ulike reaksjoner på behandlingen [25]. Våre resultater viste HIF1A sammen med NKX2-1 som en to-protein panel som diskriminert alle viktige undergrupper med lav strykprosent. HIF1A uttrykk var lavere i SCLC, og NKX2-1 farging manglet i SqCC. Vi kunne bekrefte at protein mønstre av SqCC og SCLC indikerer større «stemness» mens de molekylære signaturer av ADCA representerer mer differensierte stadier [26], [27]. ADCA er en perifer svulst og fortsetter ekspresjon av proteiner som er typiske for lunge fysiologi, som slimstoffer, overflateaktive proteiner, eller NKX2-1.
Hypoksi er et grunnleggende trekk ved kreft hvor HIF1A har blitt identifisert som et viktig regulator av energi metabolisme og andre onkogene trasé [28], [29]. Mange mål gener er identifisert, inkludert
VEGF
,
VIM
, og
KRT14 product: [30]. I vår studie, HIF1A, på samme måte som NOTCH1, korrelert med de fleste av de andre tumormarkører, men mindre med MUC1 eller NKX2-1 som markører for lungefysiologi. En høyere score på cytoplasma farging klassifisert NSCLC fra SCLC prøver.
HIF1A
mRNA har blitt observert å være oppregulert i NSCLC [31] og foreslått som en prognostisk klassifikator [32], [33]. HIF1A kan også utgjøre en terapeutisk mål [34], [35].
NKX2-1
er funnet ofte forsterket og overuttrykt i ADCA [36] og er en etablert markør for lunge- kreft avstamning brukes til å skille ADCA fra mer sentralt SqCC. Vi har bekreftet sitt uttrykk i ADCA mens farging manglet i SqCC.
NKX2-1
er viktig for dannelsen av alveolære type 2 (AT2) pneumocytes [37]. Både celler og AT2-ADCA er lokalisert i fjerne deler av lungen, hvor slimstoffer holde epitellaget hydratiserte og virker sammen med overflateaktive midler som et filtreringsbarriere [38].
Ulike metodiske mangler må tas i betraktning når studere lungekreft. Klassifiseringen av subtyper er utsatt for observatør skjevhet [39]. Her lungevev var tilgjengelig fra obduksjoner og underlagt referanse patologi. En annen problemstilling gjelder feilklassifisering av eksponering [40]. Enorme innsats har blitt gjennomført for å vurdere yrkesmessig eksponering for radon og arsen i uran mining [2], [3]. Eksponering for radon og arsen kan resultere i en synergistisk virkning. Følgelig flere prøver ble positivt farget i gruppen med høy eksponering mot både kreftfremkallende enn i lav-utsatte gruppen.
I denne sammenheng tunge yrkesmessig eksponering, konfunderende av røyking ble anslått til å være av mindre bekymring [ ,,,0],5]. Det var ingen sterk variant av røykeprevalens av eksponeringsnivået. Ingen åpenbare effekten av røyking ble funnet i miRNA mønstre i et stort sett av ADCA prøver, hvor også en god molekylær klassifisering av ADCA og SqCC kunne oppnås [41].
Tilsvarende våre markører var også gode classifiers av subtypene, men vi kunne ikke identifisere en ekstra effekt av eksponering på subtype spesifikke mønstre. Selv om vi var i stand til å oppdage en moderat sammenheng mellom eksponering og NOTCH1 og andre proteiner, kan de sterke forskjeller i uttrykket av subtype hindre påvisning av svakere påvirkninger. Dette reiste spørsmål om vår studie var kraftig nok til å oppdage en slik endring i uttrykket nivåer. En første undersøkelse med cDNA mikromatriser i skjoldbruskkjertelen svulster, inkludert prøver fra Tsjernobyl Tissue Bank, viste ingen stråling spesifikk signatur [42]. En påfølgende analyse tillot identifikasjon av en subtil genuttrykk signatur i en undergruppe av Tsjernobyl tilfeller, som var utsatt for stråling-indusert kreft [8]. Vi hadde valgt en ortogonal studiedesign med kontrast i eksponering. Selv vevet banken er ganske omfattende, ble vevsblokker begrenset for sjeldne kombinasjoner som lav radon og høy arsen. Videre medfører en omfattende lagdeling i mindre undergrupper som er utsatt for variasjon ved en tilfeldighet. Vi har derfor vektlagt konsistente trender i resultatene.
En annen bekymring er spørsmålet om metoden som er benyttet var egnet og den resulterende protein sett var tilstrekkelig fullstendig og følsom. Moderne massespektrometri-baserte proteomikk har gjort store fremskritt i sin søknad til arkivmateriale [43], [44]. I stedet for å bruke en metode for global protein analyse, har vi imidlertid valgt en hypotese-drevet tilnærming som var basert på immunhistokjemi. Antigen henting med arkivmateriale er godt etablert og, til tross for lange feste ganger i bufret formalin, kunne 22 av 30 antistoffer med hell brukes. I utgangspunktet vi søkte litteraturen for kandidat proteiner blir ansatt i lungekreft, utvikling, eller fysiologi. De observerte sterke assosiasjoner mellom resultatet av de 22 proteiner støtte kandidaten protein tilnærming. Den stramme korrelasjon struktur kan være representert ved HIF1A, MUC1, og NKX2-1. Dette dimensionality reduksjonen kan skyldes bidraget fra ulike viktige proteiner til grunnleggende veier. Selv om vi ikke kan utelukke mangler viktige proteiner i settet valgt for denne undersøkelse, for eksempel fra DNA-reparasjonsbaner, korrelasjonen struktur av kandidaten proteinet støtter det syn at en slik analyse kan på lignende måte utføres med proxy-proteiner. Hvis eksponering påvirket en kandidat protein, kan en slik virkning transporteres langs trasé eller på tvers av nettverk av viktige proteiner.
Bortsett fra metodiske begrensninger, bør biologiske forklaringer også bli diskutert på hvorfor eksponering kan føre til et skifte mellom subtyper. Mange av markørene er ansatt i utviklingsveier av lunge morphogenesis som rekapitulert i vev regenerering og kreft [45] – [47]. Disse programmene fører til avstamning spesifikke uttrykk mønstre som kan være godt klassifisert av disse proteinene. Det er nåværende oppfatning at minst to store linjene gi opphav til SCLC og NSCLC [48], [49]. SCLC er en mer aggressiv tumor med nevroendokrine egenskaper [50]. ADCA er vanlig subtype hos ikke-røykere og mer differensiert enn SqCC innenfor NSCLC avstamning [26], [27]. Reparasjon av tung vevsskade trenger vanligvis rekonstruksjon av en mer kompleks vev arkitektur og innebærer rekruttering av celler med høyere stemness [51]. Dette kan forklare den observerte endring i fordelingen av undertyper av lungekreft med graden av eksponering for kreftfremkallende. Eksponering for radon eller arsen kan føre til at transformasjonen av en stamcelle til en kreft stamcelle. Det kan imidlertid strengt kontrollerte programmer aktivert i prosessen med karsinogenese tilsløre overføring av eksponeringen-relaterte skader på en forløper celle langs linjen til en spesifikk fenotype kreft.
Som konklusjon, NOTCH1, en fremstående kandidat for radiation- relaterte effekter og andre kreftrelaterte proteiner var assosiert svakt til moderat med eksponering til radon og arsen. MUC1, en fysiologisk markør, HIF1A, en regulator av metabolsk omprogrammering, og NKX2-1, en avstamning-spesifikk markør utført samt classifiers av lungekreft og dens store undergrupper.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Farging av mucin 1 (MUC1) (høyre kolonne) i membranen og hypoksi-induserbar faktor en α (HIF1A) (venstre kolonne) i cytoplasma av arkiv lungevev fra uran gruvearbeidere, viser kreft-fri lungevev, adenokarsinom (ADCA), plateepitelkarsinom (SqCC), og småcellet kreft i lunge (SCLC) (synkende).
doi: 10,1371 /journal.pone.0045305.s001 plakater (JPG)
Figur S2.
Farging av NOTCH1 i en prøve av plateepitelkarsinom fra en gruvearbeider med høy eksponering for radon og arsenikk.
doi: 10,1371 /journal.pone.0045305.s002 plakater (TIF)
Tabell S1.
Kandidat proteiner valgt for farging av arkiv lungevev.
doi: 10,1371 /journal.pone.0045305.s003 plakater (DOC)
Tabell S2.
Spearman korrelasjon koeffisienter mellom markør score i lungevev fra uran gruvearbeidere etter nivå av eksponering for radon og arsenikk.
doi: 10,1371 /journal.pone.0045305.s004 plakater (DOC)
tabell S3.
Andel prøver med positiv farging av kandidat proteiner i lungekreft og kreft-fri vev fra uran gruvearbeidere etter nivå av eksponering for radon og arsenikk.
doi: 10,1371 /journal.pone.0045305.s005 plakater (DOC)
Tabell S4.
Spearman korrelasjonskoeffisienter markører score med kumulativ eksponering for radon [WLM] og arsen [mg /m
3 år] i lungevev fra uran gruvearbeidere.
doi: 10,1371 /journal.pone.0045305.s006 plakater (DOC)
Takk
Forfatterne takker Johannes Gellissen, Federal Institute for Occupational Safety and Health, og teamet av Health data Archive av Wismut aksjeselskap for å hente røyking data fra medisinske og andre poster.
