Abstract
Denne studien adressert om kombinasjonen av metformin og ioniserende stråling (IR) ville vise forbedrede antitumor effekter i radioresistant p53-mangel kolorektal kreft celler, med fokus på reparasjon trasé for IR-indusert DNA skade. Metformin forårsaket en høyere reduksjon i klonogene overlevelses samt større bestrålingssensibilisering og inhibering av tumorvekst av p53
– /- enn av p53
+ /+ kolorektal kreftceller og xenotransplantater. Metformin kombinert med IR-induserte akkumulering av tumorceller i G2 /M fase og forsinket reparasjon av IR-indusert DNA-skade. I tillegg har denne kombinasjonen signifikant redusert nivå av p53-relaterte homolog rekombinasjon (HR) reparere sammenlignet med IR alene, spesielt i p53
– /- kolorektal kreft celler og tumorer. I konklusjonen, metformin forbedret Radiosensitivity ved å fremkalle G2 /M arrest og redusere uttrykket av DNA reparasjons proteiner selv i radioresistant HCT116 p53
– /- tykktarmskreftceller og svulster. Vår studie gir en vitenskapelig begrunnelse for klinisk bruk av metformin som radiosensitizer hos pasienter med p53-mangel kolorektale tumorer, som ofte er resistente mot strålebehandling
Citation. Jeong YK, Kim MS, Lee JY, Kim EH , Ha H (2015) Metformin Radiosensitizes p53-Mangel kolorektal kreft cellene gjennom Induksjon av G2 /M arrest og Hemming av DNA Repair Proteiner. PLoS ONE 10 (11): e0143596. doi: 10,1371 /journal.pone.0143596
Redaktør: Kerstin Borgmann, Universitetssykehuset Hamburg-Eppendorf, TYSKLAND
mottatt: 03.04.2015; Godkjent: 06.11.2015; Publisert: 23.11.2015
Copyright: © 2015 Jeong et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. arbeidet ble støttet av følgende: 1. MSK: grant (50541-2014) fra departementet for vitenskap, IKT og fremtidig planlegging, republikken Korea (http: //www.msip.go.kr); og 2. HH: National Research Foundation tilskudd (2012R1A2A1A0300692) finansiert av koreanske departementet for utdanning, vitenskap og teknologi. (https://www.nrf.re.kr)
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Strålebehandling er mye brukt for den endelige og adjuvant behandling av en rekke kreftformer [1]. Men motstand mot strålebehandling er fortsatt en viktig bekymring [2]. Forskjellige faktorer, inkludert p53-mutasjonen [3], overekspresjon av DNA-reparasjons proteiner [4-6], og tumor-mikromiljøet [7, 8] er blitt foreslått å spille roller i radioresistance. Blant de radioresistant faktorer, er p53 mutasjon ansett som god kandidat for radioresistance markører [9].
tumor suppressor faktor p53, som spiller en sentral rolle i cellulære responser til DNA-skader, fremmer celle overlevelse (celle- syklus arrest, DNA-reparasjon, og autofagi) ved lave nivåer av DNA-skader, mens det induserer celledød på høye nivåer. Mutasjon av p53 forekommer i mer enn 50% av humane kreftformer, noe som i betydelig grad øker cellulær motstand mot y-stråling [10]. I tillegg korrelerer p53 mutasjon med høye nivåer av DNA-reparasjonsproteiner inkludert Rad51, som spiller en sentral rolle i DNA homolog rekombinasjon (HR) reparere veien. I tillegg er Rad51 oppregulert i en rekke kreftformer, særlig høy grad av radioresistant tumorer [11]. HR reparere veien er modulert av p53-indusert transkripsjonen undertrykkelse av
Rad51
genet og oppheving av Rad51 polymerisering på DNA [12]. Av denne grunn, korrelerer radioresistance med overekspresjon av Rad51 [13], mens dens nedregulering omvendt øker Radiosensitivity [14]. Derfor er en lovende tilnærming til å øke effektiviteten av strålebehandling hos pasienter med p53 muterte kreftformer er oppdagelsen og bruken av DNA-reparasjons hemmere som radiosensibiliserende.
Metformin, en muntlig biguanide anti-hyperglykemiske agent, velig forbedrer svar på stråling ved å aktivere ataxia telangiectasia mutated (ATM) adenosin monofosfat kinase (AMPK) -p53 /p21
cip1, noe som fører til apoptose og inhibisjon av klonogene overlevelses [15, 16] i visse kreftformer. I tillegg vil kombinasjonen av metformin og ioniserende stråling (IR) forsterket den cytotoksiske effekten av IR i humane hepatom-cellelinjer, som blokkerte G2 /M fase og redusert DNA-reparasjon ved reduksjon av adenosin trifosfat (ATP) [17]. Interessant, Buzzai
et al
. [18] rapporterte at metformin selektivt svekket cellevekst i p53-manglende tumorceller ved å hemme autophagy, men aktivert autophagy i p53 villtype tumorceller. Videre har flere studier vist at metformin øker Radiosensitivity i p53-mutant eller p53 villtype kreftceller. Studier har også rapportert at metformin forbedret radiosensitiviteten av p53-mutant [19] og p53 villtype kreftceller. Videre, en annen studie viste at metformin induserte en moderat RADIO [20]. Men det er ingen klar forståelse av de ulike effekter av metformin kombinert med strålebehandling i p53-mangelfulle og p53 villtype kreftceller.
Derfor denne studien undersøkte om metformin kombinert med IR ville styrke antitumoreffekter i radioresistant p53-mangel kolorektal kreftceller. Videre har vi fokusert på mulig involvering av reparasjons trasé for IR-indusert DNA skade. Vi mener at våre data kan bidra til å gi en vitenskapelig begrunnelse for klinisk bruk av metformin som radiosensitizer i radioresistant kreft.
Materialer og metoder
Material
Metformin (1- (diaminomethylidene) -3, 3-dimetylguanidin), krystallfiolett, og propidiumjodid ble oppnådd fra Sigma-Aldrich Chemical Corp., (St. Louis, MO, USA). Anti-Rad51, anti-Rad52, anti-excision reparasjon cross-komplemente gruppe 1 (ERCC1), anti-brystkreft 2, tidlig debut (BRCA2), og anti-fosforylert-histon H3 (Ser10) antistoffer ble kjøpt fra Abcam (Cambridge , MA, USA). Anti-meiotisk rekombinasjon 11 (MRE11), anti-Rad50, anti-P95 /Nijmegen brudd syndrom protein 1 (NBS1), anti-BRCA1, anti-cyclinB1, anti-fosfo celledeling syklus protein 2 homolog (cdc2, Tyr15), og anti-fosfo sjekkpunkt kinase 2 (Chk2, Thr68) ble hentet fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Anti-p53, anti-Chk2, anti-
β
p-aktin, og pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert geite-anti-kanin og anti-mus IgG-antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Anti H2A histone familie, medlem X (H2AX, Ser139) ble gitt av Millipore (Rica, MA, USA). Alexa Fluor 488 geit-anti-mus IgG (H + L) og Alexa Fluor 594 geit-anti-kanin IgG (H + L) sekundære antistoffer ble innkjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Fluorescens monteringsmedium ble oppnådd fra Dako (Glostrup, Danmark). Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium, føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika (penicillin og streptomycin) ble oppnådd fra Lonza (Walkersville, MD, USA).
Cellelinjer og cellekultur
HCT116 p53
+ /+ menneskelige kolorektal kreft celler ble hentet fra den koreanske cellelinje Bank (Seoul, Sør-Korea) og HCT116 p53
– /- menneskelige kolorektal kreft celler ble vennlig levert av Dr. B. Vogel av Johns Hopkins University. HCT116 p53
+ /+ og p53
– /- celler ble dyrket i RPMI 1640 supplementert med 10% FBS, 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin og inkubert i en atmosfære av 5% CO
2 ved 37 ° C.
Bestråling
for
in vitro
eksperimenter, cellene ble bestrålt med en
137Cs γ-ray kilde (Atomic Energy of Canada, Ltd., Chalk River, Ontario, Canada) ved en dose på 2,67 Gy /min. For
in vivo
eksperimenter, mus ble bestrålt ved hjelp av en
60Co γ-ray kilde (Theratron 780, Atomic Energy of Canada, Chalk River, Ontario, Canada) med en 0,5 cm diameter bolus av vev verdig materiale for å tillate dose oppbygging. En leder barrieren ble brukt til å skjerme normalt vev hvor det er mulig.
Vannløselig tetrazolium (WST-1) assay
For cytotoksisiteten analysen ble cellene sådd ut i 96-brønners kulturplater i plast en tetthet på 1 x 10
3-celler per brønn. Metformin ved varierende konsentrasjoner (0-10 mM) ble tilsatt til hver brønn og cellene ble inkubert i 48 timer fulgt av anvendelse av den vannoppløselige tetrazolium (WST) -1 cytotoksisitet assay reagens (Roche Diagnostics, Laval, Quebec, Canada) i henhold til produsentens anbefalinger. Cellelevedyktigheten ble bedømt ved å bestemme A450 nm av cellekulturmedier etter tilsetning av WST-1 i 2 timer. Resultatene ble rapportert som en prosent av den optiske densitet av de ubehandlede kontrollcellene, som ble betegnet som 100% celleviabilitet. Andel av cytotoksisitet ble beregnet som følger: (1-Aexp /Acon) × 100; hvor Aexp og Acontrol er absorbansverdiene for de eksperimentelle narkotika-behandlede og kontroll un-behandlede celler, henholdsvis.
klonogene analysen
HCT116 p53
+ /+ og p53
– /- celler ble behandlet med metformin på 1-10 mM i 48 timer eller 2,5 mM i 24 timer fulgt av IR, og deretter ytterligere inkubert i 24 timer. Den klonogene Analysen ble deretter utført som tidligere beskrevet [17].
tumorxenografter i atymiske mus
atymiske Balb /c nakne mus (4 uker gamle hanner) ble oppnådd fra Nara Biotech Co. . (Seoul, Korea) og vedlikeholdes i en laminær luftstrøm skap under patogenfrie forhold. HCT116 p53
+ /+ og p53
– /- xenograft musemodeller ble etablert ved subkutan inokulering av 3 × 10
6 HCT116 p53
+ /+ eller p53
– /- celler i den høyre bakben. Etter tumorimplanteringen, overvåket vi tilstanden til dyrene en gang om dagen og fremstilt smertestillende midler for å minimalisere lidelser av dyrene. Når tumoren oppnådd et volum på omtrent 100 mm
3, ble musene tilfeldig delt inn i fire grupper (n = 5) som innbefatter (a) kontroll, (b) metformin, (c) IR, og (d) kombinasjon av metformin og IR. De metformin-behandlede grupper (b og d) ble injisert (intraperitonealt) en gang daglig med 250 mg /kg.
Når tumorvolum til kontrollgruppen oppnås 200 mm
3, IR-behandlede grupper (c og d) ble behandlet med en enkelt 5 Gy fraksjon av lokal-regional bestråling ved anvendelse av en
60Co stråle. Svulsten volum (V) ble beregnet ved bruk av standard formel: V (mm
3) = π /6 × (mindre diameter)
2 × (større diameter). Mus ble avlivet ved karbondioksyd (CO
2) inhalering når det gjennomsnittlige tumorvolum til kontrollgruppen var 1000 mm
3.
cellesyklusanalyse
Når metformin (2,5 mM) eksponering i 24 timer, ble cellene bestrålt, inkubert i 24 timer eller 48 timer, høstet, farget med propidiumjodid (1 mg /ml) i henhold til produsentens protokoll, og deretter analysert ved hjelp av et FACScan strømningscytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Et minimum på 10.000 celler ble tellet for hver prøve og dataanalyse ble utført ved anvendelse av Cellquest-programvare.
Immunofluorescence
Immunofluorescence farging ble utført for å bestemme fordelingen av kjernefysiske γ-H2AX og Rad51 i HCT116 p53
+ /+ og p53
– /- celler ved hjelp av bildeanalyse i de tre (grønn /rød /blå) fluorescens kanaler. Cellene ble dyrket på kamret lysbilder 1 dag før bestråling eller metformin behandlinger. Etter metformin (2,5 mM) eksponering i 24 timer, ble cellene bestrålt og inkubert i 1 time eller 24 timer. Alle behandlinger ble utført mens cellene forble festet til lysbildene. Cellene ble fiksert (4% paraformaldehyd i fosfat-bufret saltoppløsning, PBS, 10 min), permeabilisert (0,5% Triton X-100 i PBS, 10 min), og inkubert med blokkeringsbuffer (4% FBS i PBS, 1 H) og deretter inkubert over natten ved 4 ° C eller i mer enn 4 timer ved romtemperatur med primære antistoffer (1: 100 hver, anti-γ-H2AX og anti-Rad51), Deretter ble cellene vasket med PBS, inkubert i 1 time ved romtemperatur i mørke, med passende fluoresceinisotiocyanat (FITC) -merket sekundære antistoffer (1: 500 hver) med Alexa Fluor 488 geit-anti-mus IgG (H + L) for γ-H2AX (grønn) og Alexa Fluor 594 geite-anti-kanin IgG (H + L) for Rad51 (rød). Cellene ble deretter vasket med PBS, farvet med DAPI (blått), og er montert på objektglass ved hjelp av fluorescens monteringsmedium. Skinnene ble til slutt undersøkt ved hjelp av en Carl Zeiss LSM510 laser scanning mikroskop og bildene ble tatt med en kostnad kombinert enhet kamera. For kvantitativ analyse, ble γ-H2AX eller Rad51 foci-positive celler telles i minst 100 celler fra tilfeldig bildene.
Immunoblotting
celler eller tumorvev ble lysert med en radioimmunopresipitasjonsanalyse analyse ( RIPA) buffer, og proteinene ble separert ved hjelp av natriumdodecylsulfat (SDS) polyakrylamid gelelektroforese (PAGE) og overført til nitrocellulosemembraner. De membraner Blottene ble blokkert med 5% (volum /volum) skummet melk i PBS med 0,1% Tween 20, inkuberes med de angitte antistoffer (1: 1000) og sekundære antistoff (1: 1000), og deretter senere utviklet ved bruk av forbedret kjemiluminescens western blotting substrat (Pierce, Rockford, IL, USA) ved hjelp av Imagequant LAS-4000 mini (GE, Fairfield, CT, USA). Signalet intensiteten av båndene ble målt med ImageJ programmet (National Institutes of Health, NIH, Bethesda, MD, USA).
Immunohistochemistry
For immunhistokjemisk analyse, 4-mikrometer tumor vevsdelene ble de-paraffinized med xylen og sekvensielt rehydrert i en serie av graderte konsentrasjoner av etanol. For å redusere ikke-spesifikk bakgrunnsfarging på grunn av endogen peroksidase, ble platene blokkert i hydrogenperoksyd i 10 min, og vasket fire ganger i buffer. Den ERCC1 (01:50) og Rad51 (1: 200) som primære antistoffer ble brukt til vev lysbilder, som ble inkubert i henhold til produsentens protokoller, og deretter vasket fire ganger i buffer. Glassene ble inkubert med primært antistoff enhancer i 20 minutter ved romtemperatur og vasket fire ganger i buffer. Deretter ble HRP polymer påført på skinnene, og fargen ble utviklet ved hjelp av Zymed diaminobenzidin (DAB) system (Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, CA, USA) fulgt av kontra med hematoksylin. De histologiske score for Rad51 og ERCC1 uttrykk ble bestemt ved bruk av to uavhengige metoder:. Prosent positiv farging celler og uttrykk intensitet
Statistisk analyse
Alle data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM). Den statistiske analysen ble utført ved hjelp av en parametrisk gjentatt tiltak enveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Tukey ærlig signifikant forskjell (HSD) test med statistikkpakke for samfunnsvitenskap (SPSS) programvare (versjon 18.0, Chicago, IL, USA ). Statistisk signifikans ble satt til et nivå på
p
0,05.
Etikk uttalelse
Alle dyr studieprotokoller og studier ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) av koreanske instituttet for Radiologisk og Medical Sciences (KIRAMS 2013-57) .
Resultater
metformin forskjellig redusert p53-mangelfull og vill type klonogene celle overlevelse
For å evaluere metformin-p53-avhengig clonogenicity og cytotoksisitet i menneskelige kolorektal kreft celler, vi utsatt HCT116 p53
+ /+ og p53
– /- celler til forskjellige konsentrasjoner i 48 timer. Metformin på 1, 2,5, 5 og 10 mM viste 86,7 ± 5,9, 73,2 ± 3,8, 45,5 ± 1,1, og 26,8 ± 2,7% klonogene overlevelse for HCT116 p53
+ /+ celler, og 77,2 ± 6,9, 35,5 ± 3,6, 13,1 ± 2,1 og 2,3 ± 0,9% for HCT116 p53
– /- celler, respektivt (figur 1A). Klonogene overlevelse av HCT116 p53
+ /+ og p53
– /- celler signifikant forskjellig på metformin konsentrasjoner 2,5-10 mm (
p
0,001), og HCT116 p53
– /- cellene mer følsomme for metformin-indusert klonogene celledød enn HCT116 p53
+ /+ celler. Men metformin hadde ingen signifikant eller differensial cytotoksisitet mot begge cellelinjer (figur 1B)
HCT116 p53
+ /+ og p53
-. /- Celler ble behandlet med 1-10 mM metformin for 48 timer, dyrket og anvendt i (A) klonogene og (B) WST-1 (cellelevedyktighet) assayer; *
p
0,001 for HCT116 p53
+ /+ celler,
†
p
0,001 for HCT116 p53
– /- celler.
§
p
0.001, mellom HCT116 p53
+ /+ og p53
– /- celler, sammenlignet med kontroll. WST, vannløselig tetrazolium.
Metformin indusert høyere bestrålingssensibilisering i p53-mangelfull enn p53 villtype celler
Å vurdere radiosensitizing effekten av metformin, HCT116 p53
+ /+ og p53
– /- kreft celler ble behandlet i 24 timer med 2,5 mM fulgt av IR, og deretter fjernes 24 timer etter IR. De overlevende fraksjonene etter eksponering for en 2 Gy stråledose (SF2) ble bestemt å være 0,24 og 0,20 for HCT116 p53
+ /+ celler (figur 2A) og 0,58 og 0,43 for HCT116 p53
– /- celler ( figur 2B), etter behandling med stråling alene og metformin stråling, respektivt. En kombinasjon av metformin og IR markert redusert klonogene overlevelse sammenlignet med IR alene i HCT116 p53
– /- (
p
0,01), men ikke p53
+ /+ celler, noe som tyder på at bestrålingssensibilisering var høyere i HCT116 p53
– /-. enn i p53
+ /+ celler
Radiosensitivity av (A) HCT116 p53
+ /+ og (B) p53
– /- celler med og uten eksponering for metformin (2,5 mM) etter varierende doser på
60Co γ-ray stråling ble målt ved anvendelse av en klonogene assay. HCT116 p53
+ /+ og p53
– /- xenopodet mus ble tilfeldig delt inn i fire grupper, inkludert kontroll (Con), metformin (Met), ioniserende stråling (IR) og kombinasjon av metformin og IR (Met + IR). Grafer viser tumorvolumet i (C) HCT116 p53
+ /+ og (D) p53
– /- xenograft-modell; *
p
0,05.
Metformin hemmet tumorvekst i p53-mangel xenografter
For å undersøke effekten av metformin på p53-avhengig og uavhengig tumorvekst, vi brukte sammen isogen menneskelige kolorektal HCT116 p53
+ /+ og p53
– /- kreftceller. Når gjennomsnittet av tumorvolumet i kontrollgruppen oppnås omtrent 1000 mm
3, xenografter i tumorvolum hos mus behandlet med metformin, IR, og en kombinasjon av begge var 4,5 ± 0,2, 48,3 ± 6,1 og 59,0 ± 5,0% mindre henholdsvis enn den for kontrollene på ca 1000 mm
3 for HCT116 p53
+ /+ tumorer (figur 2C), og 26,5 ± 1,1, 22,8 ± 2,9 og 44,3 ± 5,5%, respektivt for HCT116 p53
– /- svulster (fig 2D)
veksten av kontroll HCT116 p53
-. /- xenografter var betydelig raskere enn den HCT116 p53
+ /+ xenografter var (
p
0,05). Den kombinerte metformin og IR behandling vesentlig hemmet tumorvekst både xenograft modeller mer enn IR behandling alene gjorde (
p
0,05). Videre metformin forbedrede antitumor effekter i p53
– /- (
p
0,05), men ikke p53
+ /+ xenografter mens IR alene markert undertrykte tumorvekst i p53
+ /+ xenografter (
p
0,05).
Metformin forlenget IR-indusert G2 /M arrest i p53-mangel kolorektal celler sammenlignet med p53 villtype celler
å bestemme hvorvidt metformin påvirkes IR-indusert cellesyklus akkumulering i G2 /M-fasen, og andelen av G2 /M-fase-celler er forbundet i nærvær eller fravær av p53, analyserte vi cellesyklusen fasefordeling av HCT116 p53
+ /+ og p53
– /- celler. Metformin kombinert med IR økt andelen av G2 /M-fase celler vesentlig sammenlignet med IR alene HCT116 p53
– /- (
p
0,001), men ikke p53
+ /+ celler (fig 3A og 3B)
HCT116 p53
+ /+ og p53
-. /- celler ble forbehandlet med 2,5 mM metformin i 24 timer, og deretter bestrålt med 6 Gy. Cellesyklus målt ved flow-cytometri (A) 24 og (B) 48 timer etter IR. (C) Uttrykk for G2 /M sjekkpunkt regulatorer inkludert cyclin B1, fosforylert cdc2 (Tyr15), fosforylert histon H3 (Ser10), og fosforylert Chk2 (Thr68) ble målt ved hjelp av immunoblotting i HCT116 p53
+ /+ og p53
– /- celler 48 timer etter bestråling. Densitometrisk kvantifisering ble normalisert til
β
aktin. Verdier er gjennomsnitt ± SEM. av tre forsøk, *
p
0,001. IR, ioniserende stråling
For å bekrefte akkumulering av G2 /M fase, uttrykket nivåer av G2 /M sjekkpunkt regulatorer som cyclin B1, fosforylert cdc2 (Tyr15), fosforylert histon H3 (Ser10), og fosforylert Chk2 (Thr68) ble undersøkt ved hjelp av immunoblotting. Kombinasjonen av metformin og IR økt betydelig uttrykk for fosforylert cdc2 (Tyr15) sammenlignet med IR alene HCT116 p53
– /- men ikke p53
+ /+ celler (
p
0,05 ). Videre metformin pluss IR betydelig økt uttrykk av fosforylert histon H3 (Ser10) og fosforylert Chk2 (Thr68) sammenlignet med IR alene HCT116 p53
+ /+ og p53
– /- celler. I tillegg ble ekspresjon av fosforylert histon H3 (Ser10) og fosforylert Chk2 (Thr68) i den metformin IR gruppe signifikant økt i HCT116 p53
– /- sammenlignet med p53
+ /+ celler (
p
0,001, figur 3C). I sammendraget, viste vi at metformin hindret cellesyklusprogresjon ved å signifikant øke IR-indusert G2 /M arrest i HCT116 p53
– /-. Celler
Metformin forsinket reparasjon av IR-indusert DNA-skader i p53- manglende celler sammenlignet med i p53 villtype celler
Vi analyserer effekten av metformin på farmakokinetikken av DNA skade og reparasjon ved å vurdere immunfluorescens farging for γ-H2AX, en markør for DNA-skader; Rad51, en markør for DNA-reparasjon; og DAPI-farget kjerne-DNA ved hjelp av bildeanalyse i de tre (grønn /rød /blå) fluorescens kanaler. Metformin kombinert med IR og IR alene oppviste γ-H2AX foci ved 6 timer etter IR mens metformin i kombinasjon med IR beholdt γ-H2AX foci i opptil 24 timer etter IR. I tillegg var denne effekten større i HCT116 p53
– /- enn det var i p53
+ /+
celler (
p
0,001). Imidlertid, 6 og 24 timer etter IR, metformin i kombinasjon med IR viste en signifikant reduksjon i den Rad51 foci sammenlignet med IR alene, noe som viste en økning i den Rad51 foci. (Fig 4A og 4B). HCT116 p53
– /- cellene mer følsomme for metformin enn HCT116 p53
+ /+ celler (
p
0,001). Disse resultatene viser at kombinasjonen av metformin og IR forsinket reparasjon av IR-indusert DNA-skade i mer HCT116 p53
– /-. Lignet med p53
+ /+
celler
HCT116 p53
+ /+ og p53
– /- celler ble forbehandlet med 2,5 mM metformin i 24 timer, og deretter bestrålt med 6 Gy. (A) Immunofluorescens farging ved 6 og 24 timer etter IR viste γ-H2AX, en markør for DNA-skade; Rad51, en markør for DNA-reparasjon; og kjerne-DNA farget med DAPI å bruke bildeanalyse i tre (grønn /rød /blå) fluorescens kanaler. (B) For kvantitativ analyse, γ-H2AX eller Rad51 foci-positive celler ble talt i minst 100 celler fra tilfeldig bildene. Verdier er gjennomsnitt verdier ± S.E.M., *
p
0,001. IR, ioniserende stråling; γ-H2AX, γ-H2A histon familie, medlem X.
Metformin forbedret Radiosensitivity ved å redusere DNA reparasjonsproteiner
in vitro Hotell og
in vivo
for å undersøke om metformin berørt DNA reparasjon veier
in vitro
, undersøkte vi uttrykket av p53-relaterte HR reparasjon proteiner inkludert MRE11-Rad50-P95 /NBS1 kompleks, BRCA1, BRCA2, Rad51, Rad52, og ERCC1 i HCT116 p53
+ /+ og p53
– /- celler ved hjelp av immunoblotting. Som vist i figur 5, metformin i kombinasjon med IR kraftig redusert MRE11, BRCA2, Rad51, og ERCC1 proteinnivåer sammenlignet med IR alene i HCT116 p53
+ /+ og spesielt p53
– /- celler (
p
0,01). Videre metformin kombinert med IR betydelig redusert uttrykk for Rad50 og BRCA1 sammenlignet med IR alene HCT116 p53
– /- men ikke p53
+ /+ celler (
p
0,01). Interessant, i HCT116 p53
– /- celler, IR alene betydelig økt BRCA1 og Rad51 proteinnivåer sammenlignet med kontrollen (
p
0,01) mens metformin i kombinasjon med IR markert redusert ekspresjon av BRCA1 og Rad51 sammenlignet med IR alene (
p
0,01)
HCT116 p53
+ /+ og p53
– /- celler ble forbehandlet med 2,5 mM metformin i 24 timer. , og deretter bestrålt med 6 Gy. Celler fra begge grupper ble immunoblottet med p53-relaterte HR reparasjons proteiner som MRE11-Rad50-P95 /NBS1 kompleks, BRCA1, BRCA2, Rad51, Rad52, og ERCC1 24 timer etter ioniserende stråling (IR). Densitometrisk kvantifisering ble normalisert til
β
aktin. HR, homolog rekombinasjon; MRE11, meiotisk rekombinasjon 11; NBSI, Nijmegen brudd syndrom protein 1; BRCA, brystkreft tidlig debut; ERCC 1, excision reparasjon cross-komplemente gruppe 1.
Deretter evalueres vi enten metformin berørt DNA reparasjon veier
in vivo
av immunohistochemically undersøke uttrykket av Rad51 og ERCC1 i tumorprøver . Rad51 og ERCC1 protein nivåer av HCT116 p53
– /- kontrollgruppen svulster var høy, men var under deteksjonsgrensene for p53
+ /+ kontrollgruppen svulster. Uttrykket av IR-indusert Rad51 og ERCC1 ble markert økt i HCT116 p53
– /- svulster sammenlignet med p53
+ /+ svulster mens metformin kombinert med IR betydelig redusert proteinnivå Rad51 og ERCC1 i HCT116 p53
– /- sammenlignet med p53
+ /+ tumorer (
p
0,05, figur 6A og 6B). I tillegg fikk vi bekreftet uttrykk for Rad51 og ERCC1 ved immunoblotting tumorprøver fra
in vivo
studien. IR-indusert Rad51 og ERCC1 uttrykket ble mer markert økt i HCT116 p53
– /- enn det var i p53
+ /+ tumorer (
p
0,05, figur 6C). I tillegg metformin kombinert med IR betydelig redusert uttrykk for Rad51 i HCT116 p53
– /- tumorer (
p
0,05) til nivåer sammenlignes med de i p53
+ /+ tumorer ( fig 6C). I sammendraget, viste vi at metformin forbedret svulst Radiosensitivity ved å redusere DNA reparasjons protein nivåer, spesielt i HCT116 p53
– /-. Celler og svulster
In vivo
, bekreftelse av (A ) Rad51 og (B) ERCC1 uttrykk i HCT116 p53
+ /+ og p53
– /- tumorvev analysert ved immunhistokjemi og grafer viser histologiske score for hver gruppe. (C) Tumor vev ble lysert og immunoblottet med Rad51 og ERCC1. Densitometrisk kvantifisering ble normalisert til
β
aktin. Data er gjennomsnittsverdier ± S.E.M., *
p
0,05.
Diskusjoner
mutasjon av svulst suppressor p53 faktor spiller en stor rolle i radioresistance av kreftceller [9]. Mer enn 50% av alle kreftformer har en manglende eller skadet p53-genet, og derfor har tilbøyelighet til å bli svært radioresistant. I tillegg p53 mutasjon korrelert med høye nivåer av DNA-reparasjons proteiner [10]. Blant DNA reparasjons proteiner, p53 forbundet med HR ved transkripsjonen undertrykkelse av
Rad51
genet og opphevelse Rad51 polymerisering på DNA [12]. Nylig har den cytotoksiske [21-23] og radiosensitizing [16, 17, 24, 25] virkninger av metformin ble rapportert i forskjellige kreftceller uten hensyn til p53 status. Men Buzzai
et al
. [18] har vist at metformin selektivt svekket p53
– /- celler i fravær av glukose eller i en fast tumor mikromiljøet. I denne studien undersøkte vi muligheten av metformin for å forbedre IR-induserte antitumor effekter i radioresistant p53-mangel kolorektal kreft celler, med fokus på reparasjon trasé for IR-indusert DNA skade.
Først, vi bekreftet at HCT116 p53
– /- xenografter ikke bare vokste raskere, men også var radioresistant og mer følsomme for metformin enn p53
+ /+ xenografter var. Metformin hemmet tumorvekst og overvinnes radioresistance i HCT116 p53
– /- xenografter. Mens metformin indusert konsentrasjonsavhengig cytotoksisitet i både HCT116 p53
+ /+ og p53
– /- celler, var denne effekten større i p53
– /- enn det var i p53
+ /+ celler. Vår tidligere studie [24] viste at metformin indusert apoptose i leverkreft, men ikke i normale hepatocytter
Deretter undersøkte vi de bestrålingssensibilisering mekanismer for metformin i HCT116 p53
+ /+ og p53
. – /- celler og xenografter. Metformin kombinert med IR ble nylig rapportert å indusere cytotoksisitet av hepatomceller mer enn IR alene gjorde, ved inhibering av DNA-reparasjon, noe som er mediert av akkumuleringen av celler i cellesyklus G2 /M fase og forsvinning av γ-H2AX uttrykk [17] . De foreliggende resultatene viste at metformin kombinert med IR forhindret cellecyklusprogresjonen ved å signifikant øke IR-indusert G2 /M arrest, og indusert større DNA-skader enn IR alene gjorde. Spesielt er HCT116 p53
– /- celler som var mer følsomme for metformin enn HCT116 p53
+ /+ celler, noe som tyder på at metformin forsinket reparasjon av IR-indusert DNA-skade i HCT116 p53
– /- celler. Følgelig er disse data tyder på at metformin-indusert bestrålingssensibilisering kan være forbundet med DNA-skade og reparasjon av veier.
tumor suppressor p53-protein regulerer ekspresjonen av DNA-reparasjonsproteiner og tallrike studier har rapportert at DNA-reparasjons proteiner så som Rad51 [26, 27] og ERCC1 [28] var meget aktive i kreftceller som mangler funksjonell p53, men mindre aktiv i normale celler og kreftcellelinjer med intakt p53-funksjon. I våre
in vivo
studier uttrykk for Rad51 og ERCC1 på basalnivåer og etter IR var betydelig høyere i p53
– /- enn de var i p53
+ /+ tumorer (fig 6 ), som er i overensstemmelse med tidligere rapporter [26-28]. Metformin kombinert med IR betydelig redusert proteinnivå Rad51 og ERCC1 i p53
– /- svulster til nivåer som var sammenlignbare med de av p53
+ /+ svulster. Videre våre
in vitro
studier viste at kombinasjonen av metformin og IR betydelig redusert ekspresjon av p53-relaterte HR reparasjons proteiner som MRE11, Rad50, BRCA1, BRCA2, Rad51, og ERCC1 sammenlignet med IR alene HCT116 p53
+ /+ og spesielt p53
– /- celler. Videre IR alene betydelig økt BRCA1 og Rad51 protein nivå sammenlignet med kontroll i HCT116 p53
– /- cellene mens metformin kombinert med IR markert redusert uttrykk av BRCA1 og Rad51 sammenlignet med IR alene HCT116 p53
– /- celler. Derfor er disse resultatene tyder på at metformin forbedrer Radiosensitivity i p53
– /- celler og tumorer, som høyt uttrykte BRCA1, Rad51, eller ERCC1 protein i kontroll og følgende IR-behandling ved å redusere ekspresjon av DNA-reparasjons proteiner.
