Abstract
tumorspesifikt adenovirus vektorer omfatter et fruktbart gen-baserte bildediagnostikk og behandling forskningsområde for avansert stadium av kreft, inkludert metastatisk sykdom. Imidlertid har oppstått klinisk oversettelse av virale vektorer betydelige hindringer, i stor grad på grunn av vertens immunrespons mot viruset. Her utforsket vi utnyttelse av en immunsuppressiv, rapamycin, for å omgå anti-adenovirus immunitet hos immunkompetente murine prostatakreft modeller. Rapamycin redusert adenovirus-indusert akutt immunrespons ved å hemme NF-kB aktivering; det også redusert målestokk og forsinket inntreden av inflammatoriske cytokin sekresjon. Videre fant vi at rapamycin avskaffet anti-adenovirus antistoffproduksjon og tilbakestående funksjon av myeloide celler og lymfocytter som ble aktivert ved viral administrasjonen i pre-vaksinert verter. Dermed kan samtidig administrering av rapamycin forlenget og forbedret adenovirus-levert transgene uttrykk
in vivo
, og dermed utvidet bilde evnen av adenovirus vektorer i både bioluminescent og positronemisjonstomografi modaliteter. Videre viste vi at til tross for en utmerket respons på kreftceller til en cytotoksisk gen terapeutisk vektor
in vitro
, kun minimale terapeutiske effekter ble observert
in vivo
i pre-immuniserte mus. Men når vi kombinert genterapi med forbigående immunsuppresjon, ble komplett tumorvekst arrest oppnådd. Samlet sett forbigående immunsuppresjon ved rapamycin var i stand til å øke diagnoseverktøy og terapeutiske potensialer av adenovirus vektorer
Citation. Jiang ZK, Johnson M, Moughon DL, Kuo J, Sato M, Wu L (2013) Rapamycin Forbedrer adenovirus-mediert Cancer Imaging og terapi i Pre-vaksinert Murine verter. PLoS ONE 8 (9): e73650. doi: 10,1371 /journal.pone.0073650
Redaktør: Maria G Castro, University of Michigan School of Medicine, USA
mottatt: 31. mai 2013; Godkjent: 19 juli 2013; Publisert: 02.09.2013
Copyright: © 2013 Jiang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet er støttet av National Cancer Institute gir RO1CA101904 til LW. ZKJ er støttet av University of California Los Angeles (UCLA) JCCC predoctoral fellesskap og UCLA Dissertation År fellesskap. DLM ble støttet av DOD Ovarian Cancer Research Program; MJ og DLM ble støttet av Tumor Cell Biology Training stipend (T32-CA009056). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
adenovirus vektorer (ADS) er mye brukt som
in vivo
genet levering agenter i prekliniske og kliniske settinger, for både kreft diagnostikk og terapeutiske formål [1,2]. Nylig har vår gruppe demonstrert evne annonser for spesifikt å påvise kreft metastase følgende lymfatisk styrt eller systemisk viral administrasjon [2,3]. Til tross for disse oppmuntrende resultater i dyremodeller, flere hindringer må overvinnes før gjennomføringen av annonser i kliniske applikasjoner, den mest formidable hindringen være vertens immunresponser mot Ad (anmeldt etter [4]). Tidligere studier med gnagere og ikke-menneskelige primater har vist at systemisk injisert Ad (serotype 5) hovedsakelig er lokalisert til leveren og infisert Kupffer celler, endotelceller og hepatocytter [5-7]. Ad infeksjon av disse cellene og milt dendrittiske celler (DCS) starter et skred av inflammatoriske cytokiner og chemokiner preget av tidlig induksjon av interleukin (IL) -1 og tumor nekrose faktor (TNF) -α [8,9] etterfulgt av IL-2 , IL-6, makrofag inflammatoriske protein-2 (IL-8), regulert og normal T-celle uttrykt og utskilt (RANTES), IL-12 og interferon (IFN-γ) [10-15]. Disse faktorene i sin tur kunne rekruttere og aktivere effektorceller inkludert nøytrofile, monocytter, polymorphonucleocytes og V
α14 invariant natural killer (NK) celler, som kan føre til vev (hovedsakelig i leveren) skader, aseptisk sjokk og død [16-18 ].
Mens Ad pådrar inflammatoriske fornærmelser ved verter ved å utløse medfødte immunreaksjoner [5,7,19], det adaptive immunsystemet kan også klare ut viruset og viralt transduced celler, svekke effektiviteten av Ad-baserte bildebehandling og terapeutiske tilnærminger [18,20,21]. Videre flertallet av befolkningen besitter anti-annonse antistoffer på grunn av allestedsnærværende eksponering mot dette patogenet; dermed gjentatt administrasjon av Ad vektorer ville prime utvidelse av Ad-spesifikke plasmaceller, som fører til kraftig sekundært antistoff utskillelse og påfølgende viral clearance, redusere vektor biotilgjengelighet og poten vert toksisitet [12,20]. I tillegg vil transgene-uttrykkende celler støter cellemediert immunklaring [22-24]. Spesielt, blir en slik eliminering ikke begrenset til Ad rettet immunitet, men kan også forbundet med det innførte fremmede transgenet hvis genproduktet er immunogen [19]. Siden de fleste bilde- og terapeutiske gener er eksogene til verten, utgjør dette immunogenisitet problemet en betydelig utfordring for å oppnå vellykket utfall av Ad-basert diagnose og genterapi.
I denne studien har vi vedtatt en FDA-godkjent immunsuppressiv, rapamycin (RAPA), for å vurdere verdien av forbigående immunsuppresjon i å forsone disse konfliktene mellom annonse og vertens immunsystem. RAPA binder seg til FKBP12 (FK-bindende protein 12) og inhiberer aktiviteten av mTOR-kinase kompleks 1, et enzymkompleks avgjørende for et bredt utvalg av cellulære funksjoner som kreves for hurtig prolifererende celler [25,26]. RAPA hemmer cellesyklusprogresjon (G1 /S), proliferasjon, aktivering og differensiering av T og B-lymfocytter fremkalt i respons på en rekke sentralstimulerende midler, så vel som responsen til DC og andre medfødte immunceller til inflammatoriske signaler [27-30]. Videre oppviser RAPA vesentlig anti-angiogenese og anti-kreft egenskaper [20,31]. I denne studien rapporterer vi at rapamycin hell redusert Ad-forbundet medfødte og ervervede immunresponser hos immunkompetente verter ved hjelp av to pre-vaksinert musestammer. Strategien tatt her kan tjene som en plattform for å forbedre sikkerhetsprofilen og transgene uttrykk effektivitet for Ad mediert molekylær avbildning og behandling.
Materialer og metoder
Cell kultur, adenovirus og narkotika
Murine prostata kreft cellelinjer RM-9 (en slags gave fra Dr. Timothy C. Thompson, Baylor College of Medicine [32]) og MycCaP (en slags gave fra Dr. Charles Sawyers [33]) ble dyrket i DMEM medium inneholdende 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin. Intraperitoneal (i.p.) dose av rapamycin (LC Laboratories, Woburn, MA) ble oppløst i sterilt DMSO og ble brukt ved indikerte konsentrasjoner. Muntlig brukes Rapamune ble kjøpt fra Wyeth Pharmaceuticals Inc, Philadelphia, PA. Ganciclovir (GCV) (Cytovene-IV; Genentech, Roche gruppe, South San Franscisco, CA) ble rekonstituert med sterilt vann, fortynnet med sterilt saltvann og ble brukt ved 50 mg /kg /dag i
in vivo eksperimenter eller
indikerte dose for
in vitro-eksperimenter
Ad serotype 5 vektorer ble konstruert basert på et modifisert system Adeasy -. den AdNUEZ system, der transgener som kan plasseres inn i E3 området ved multiple kloningsseter . Homolog rekombinasjon av pAdEZ og pShuttle ble realisert i
E. Coli
BJ5183 kompetente celler. Virale kloner ble screenet, formert, renset og titrert som beskrevet tidligere [3]. Alle Annonser brukt i denne studien er replikering-mangelfull. Den tomme Ad inneholder E1- og E3-slettet viral ryggrad, uten transgener. Den titer av alle annonse vektorer ble bestemt av plakk analyser, derav plakk dannende enhet (PFU).
For GCV
in vitro
mottakelighet analysen, RM-9 og MycCap celler ble infisert av annonser ved multiplisitet av infeksjon (MOI) på 100 og behandles med GCV fra dag 2 til dag 7 etter infeksjon (pi). Celleviabilitet ble målt ved hjelp av celletelling Kit-8 (CCK-8) i henhold til produsentens instruksjoner (Dojindo Laboratories, Japan).
medfødte immunrespons eksperimenter
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med Institutional Animal Care og bruk komité UCLA, kjent som kanslerens forsøksdyr~~POS=TRUNC (ARC), retningslinjer (ARC # 2002-049-33, godkjent gjennom 3/20/2014). 4-5 uker gamle BALB /c-mus (Taconic Farms, Germantown, NY) ble gitt daglig oral behandling av Rapamune (30 mg /kg; Wyeth, Madison, NJ) 3 dager før den intravenøse (i.v.) viral injeksjon. Serumprøver fra mus ble samlet og cytokin ELISA ble utført i henhold til produsentens instruksjoner (Mouse cytokin ELISA Kit, BD Biosciences). Mus levervev ble lysert og utsatt for Western blot. Kanin anti-IkB-α (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-β aktin (Sigma, St. Louis, MO), ble pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin og anti-mus sekundære antistoffer (Santa Cruz) benyttes .
SCID og immunkompetente dyr sammenligning eksperiment
5-6 uker gammel mannlig SCID og BALB /c129 mus (Taconic Farms) ble behandlet med daglig oral Rapamune i 3 dager og deretter intraprostatically injisert med 2 × 10
8 PFU av Firefly luciferase (FL) -expressing Ad. Luciferaseekspresjon ble overvåket ved hjelp av en IVIS avkjølt CCD-kamera (Xenogen, Alameda, CA). Bilder ble analysert med IGOR-PRO LivingImage programvare (Xenogen).
PET avbildning eksperiment
RM-9 celler ble implantert subkutant på høyre skulder av mannlige C57BL /6 mus (Taconic Farms), som, 7 dager senere mottok oral saltvann eller Rapamunebehandling i 4 dager. 5 x 10
8 PFU sr39tk-uttrykkende Ad ble deretter injisert intratumorally og 6 dager senere ble musene utsatt for PET-avbildning med
18F-FHBG som tidligere beskrevet [3]. En 10-minutters CAT avbildning sesjon følges for å gi strukturell informasjon.
Imaging eksperimenter i pre-vaksinert modeller
4 til 5 uker gamle C57BL /6 og FVB mus (Taconic Farms) ble implantert med RM-9 eller MycCaP svulster, henholdsvis. I begge modellene, dyrene ble pre-eksponert for annonsen ved i.p. injeksjon av 1 x 10
8 PFU av den tomme viruset. Tre uker etter den primære viruseksponering, 2,5 x 10
5 RM-9 celler eller 3 x 10
6 MycCaP Cellene ble deretter implantert subkutant på høyre flanke av dyr i matrigel (1: 1 volum /volum; BD biovitenskap). Indikert dose (for C57BL /6) eller 5 mg /kg (for FVB) daglig i.p. RAPA eller fortynningsmidler behandling startet da svulsten var følbar (~ (5mm)
3) og 3 dager senere mottok dyrene intratumoral injeksjon av 1 x 10
8 PFU (for C57BL /6) eller 5,42 × 10
8 PFU (for FVB) FL-uttrykke annonser. Dyr fikk fortsatte daglig RAPA eller fortynningsmidler behandlingen til slutten av studien. Bioluminescent avbildning ble utført på angitte tidspunkter som beskrevet ovenfor.
Immunofluorescent flekker
subkutane svulster ble dissekert og fikset i histologi kassett i 3% paraformaldehyde ved 4
° C over natten. Parafin innebygde tumorsnitt (5 mikrometer) ble gjort på patologi lab ved UCLA. Anti-F4 /80 (1: 500; Serotec, Raleigh, NC) og anti-CD31 (1: 300; BD Biosciences, Bedford, MA) antistoffer ble brukt til å farge tumor seksjoner. Bildene ble tatt ved hjelp av Eclipse 90i mikroskop fra Nikon
Flowcytometri av svulster
subkutane svulster ble dissekert og dissosiert ved fysisk hakking og kollagenase behandling (Invitrogen, Carlsbad, CA,. 80 enhet /ml i DMEM medium inneholdende 10% FBS) ved 37
° C i 1,5 timer. Myeloide celler er definert av CD11b og CSF1R flekker samtidig lymfocytter er definert som CD11b- CD4 + eller CD11b- CD8 +. For å gjøre «stimulering» medium som brukes i T-celle reaktivitet eksperiment, 7,6 × 10
6 MycCaP celler ble infisert med 3,8 × 10
7 PFU FL-uttrykke annonse; 36 timer senere ble cellene høstet i 200 ul passiv lyseringsbuffer (Promega, Madison, WI), som er utsatt for tre sykluser av fryse-og-tine og sentrifugert. Stimuleringen medium inneholdt 120 mikrogram /ml cellelysat og 3 x 10
7 PFU /mL tom virus. Cellesuspensjoner fra dissosierte tumorer ble deretter inkubert med ren eller denne stimulering medium ved 37
° C i 3,5 timer. All flowcytometri antistoffer ble kjøpt fra BD Biosciences.
Medisinske studier
4 til 5 uker gamle hann FVB mus (Taconic Farms) ble pre-eksponert for reklame av en i.p. injeksjon av 1 x 10
8 PFU av den tomme viruset. 3 uker senere, 3 x 10
6 MycCap celler ble implantert subkutant på høyre flanke av dyr i en 1: 1 volum /volum blanding av steril PBS og matrigel (BD Biosciences). Svulstene ble følbar (~ (5mm)
3) fem dager senere og daglig i.p. RAPA eller fortynningsmiddel behandlingen ble startet for fire dager på rad. Dyr deretter fikk intratumoral injeksjon av 6 × 10
8 PFU kontroll (FL-uttrykke) eller terapeutiske annonser. RAPA eller fortynningsmiddel behandling ble deretter fortsatt i 7 dager. 50 mg /kg /dag GCV ble administrert til de terapeutiske kullene begynner dag 1 etter viral injeksjon. Tumorer ble målt med en skyvelære to ganger per uke inntil slutten av studien. Dyrene ble avlivet 30 dager etter tumor implantasjon.
Anti-adenovirus antistoff titrering
Mus serum ble innhentet før viral administrasjon og ved endepunktet av studien med retro-orbital blødning etterfulgt av sentrifugering i en table-top sentrifuger ved 8000 runder per minutt i 10 minutter. 96-brønners plater ble belagt med 1,5 x 10
7 PFU /brønn adenovirus i 100 mL av natriumkarbonatbuffer (0,1 mol /l, pH 8,8) og inkubert ved 4
° C over natten. På tidspunktet for analysen, ble det virale oppløsningen fjernet og platen ble inkubert med 6% blokkerende reagens (Roche, Indianapolis, IN) i 0,05% Tween-PBS ved 37
° C i 1 time. Serielle fortynninger av museserum ble gjort i duplikat og inkubert ved 37
° C i 2 timer, etterfulgt av 5 ganger med vaske med 0,5% PBS-Tween. Biotinylert geite anti-mus IgM og IgG (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) antistoffer ble brukt til å inkubere platen ved romtemperatur i 1 time, etterfulgt av 5 ganger med vaske. Streptavidin-HRP (PerkinElmer, Boston, MA), ble deretter anvendt for å inkubere platen ved romtemperatur i 30 minutter, etterfulgt av vaskinger og utvikling med TMB-substrat (Thermo vitenskapelig, Rockford, IL). Den optiske tetthet av platen ble deretter avlest ved 450 nm bølgelengde. Den anti-adenovirus antistoff-titer ble bestemt som den høyeste fortynning ved hvilken post-viral serum har en avlesning på 0,05 som er større enn det tilsvarende pre-virusserum.
Statistisk analyse
Statistiske analyser ble utføres ved hjelp av uparet eller sammen tosidige
t
test. For alle analyser, P . Ble 0,05 ansett statistisk signifikant
Resultater
rapamycin forminskede Ad-fremkalte medfødte immunresponser
Avhengig av målet celletype og celle oppføring mekanisme, Ad infeksjon kan utløse en mangfoldig repertoar av signalmolekyler, inkludert lipid-kinase PI3K, mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK), fokal adhesjonskinase-ERK1 /2, og JAK-STAT trasé [4,5,8,11]. Nukleær faktor (NF) -κB er en felles nedstrøms effektor for aktivering av flere signalveier [8]. Vi spurte først, etter avhør degradering av sin inhibitor IKB, hvis RAPA kan avta Ad-indusert NF-kB aktivering. Vi injisert saltvann eller 1 x 10
9 PFU av Ad intravenøst (i.v.) i fortynningsmiddel kontroll eller rapa-behandlede BALB /c-mus, høstet levervev ved angitte tidspunkter og underkastet dem til western blot. Som vist i figur 1A, Ad forårsaket markert IkB nedbrytning (og således NF-kB-aktivering) ved 6 og 12 timer etter injeksjon (p.i.); RAPA avskaffet denne effekten.
(A) BALB /c-mus ble gitt daglig oral rapamycin (30 mg /kg) eller saltvann behandling 3 dager før i.v. injeksjon av 1 x 10
9 PFU Ad-CMV-FL eller saltvann. Levervev fra disse mus ble høstet ved angitte tidspunkter, lysert og utsatt for Western blot for å undersøke IκBα degradering. β-aktin ble benyttet som kontroll lasting. m1, m2 og m3: mus 1, 2 og 3 i hver gruppe ved hvert tidspunkt. (B) Sera fra disse mus ble samlet ved 1, 6 eller 12 timer og cytokinnivåer ble analysert ved hjelp av ELISA. Feilfelt: gjennomsnitt + SEM (n = 3). ns, ikke signifikant; *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001 av tosidige
t
test i forhold til Ad eneste gruppen
Siden NF-kB aktivitet er knyttet til transkripsjon av mange inflammatoriske faktorer,. resultatene i figur 1A antydet at RAPA kan effektivt redusere Ad-fremkalte cytokin storm i dyrene. For å følge denne saken videre, vi undersøkte serumnivåer av et panel av cytokiner og chemokiner fra disse musene. IL-1 og TNF-α er blant de første cytokiner som aktiveres av Ad; de fører til ekspresjon av andre nedstrøms faktorer, og også videresende signalene til det adaptive immunsystemet [24]. IL-6 og IL-8 spille viktige roller i rekruttering av effektorceller som nøytrofile, til leveren og er knyttet direkte til Ad-relaterte leverskader; IL-10 er et nøkkelregulator i utviklingen av humoral immunitet [10,11,13,34]. Som vist i figur 1B, Ad markert øket TNF-α, IL-6, MKC (mus keratinocytt-avledet Cytokine, analogt med human IL-8), IL-10 og IL-12p70-sekresjon ved 1- og 6-timers og IL -1β nivå 6 timer pi; RAPA vesentlig blokkert induksjon av disse cytokiner. I tillegg ble utbruddet av IFN-γ produksjon forsinket med RAPA fra 6 til 12 timer pi. Således er disse resultatene tyder på at RAPA behandling kan redusere omfanget eller forsinke utbruddet av komponenter av Ad-indusert cytokin storm.
Rapamycin forsterkes Ad-levert transgene uttrykk
Robust og vedvarende transgenet uttrykk er avgjørende for å sikre diagnostiske og terapeutiske effekten av annonser. Derfor setter vi ut for å fastslå effekten av vertens immunsystem på Ad-mediert transgenet uttrykk. Vi injisert ildflue luciferase (FL) -expressing annonse i prostata av immunocompetent BALBc /129 eller alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus og brukes
in vivo
bioluminescent bildebehandling til å overvåke FL uttrykk over 5 uker. Som vist i figur 2A, ble både varigheten og størrelsen av transgene ekspresjon sterkt redusert i BALBc /129-mus som besatte intakt immunfunksjoner i forhold til SCID-mus. Deretter spurte vi om RAPA kunne dempe slike hemmende effekter presentert av verts adaptive immunsystemet. Som det endelige målet med denne studien er å legge til rette for klinisk oversettelse av annonser, undersøkte vi om RAPA kunne utfylle Ad-mediert kreft avbildning ved hjelp positronemisjonstomografi (PET), en klinisk relevant avbildningsfunksjonalitet. Den bilde reportergen anvendt i dette eksperiment er den HSV1-sr39tk, en forbedret variant form for herpes simplex virus tymidinkinase-gen, og sonden for dette gen er dens substrat
18F-FHBG [35]. RM-9 prostatakreft ble implantert i syngene, ble immunkompetente C57BL /6 mus og tumorbærende mus behandlet med kjøretøy eller RAPA før intratumoral Ad-CMV-sr39tk injeksjon. PET analyse seks dager etter viral injeksjon avslørte tydelig forsterket sr39tk spesifikke
18F-FHBG tumor signal i alle fire mus i Rapa behandlet kohort; i motsetning til dette bare en mus i kontrollgruppen viste svakt signal (figur 2B). Resultatene indikerte at RAPA kan potensere Ad-mediert transgene uttrykk hos immunkompetente verter, boding godt for nytten av å kombinere denne formen for forbigående immunsuppresjon med Ad diagnostikk tilnærminger i klinisk sammenheng.
(A) 2 × 10
8 PFU prostata-spesifikt FL-uttrykke Ad ble orthotopically injisert i prostata av immunocompetent BALBc /129 eller immunsvikt SCID mus. FL bildebehandling ble utført på angitte tidspunkter legge viral administrasjon. Farge bar: fotoner /andre /cm
2 /sr. (B) Mann C57BL /6 mus bærer subkutane RM9 svulster fikk saltvann eller rapamycin behandling for 4 dager starter på 7 dager etter tumor implantasjon. Deretter ble 5 × 10
8 PFU sr39tk-uttrykke Ad injisert intratumorally. PET billeddiagnostikk ble utført 6 dager senere med
18F-FHBG. Subkutane svulster ble angitt med røde piler.
For å vurdere dette kombinert stoffet og molekylær avbildning tilnærming i klinisk relevante scenarier videre, spurte vi om det forsterke effekten Rapa kan utvides til dyr med pre-eksisterende anti -Ad immunitet. Vi har benyttet to stammer av immunkompetente mus, C57BL /6 og FVB, og immunisert dem med en intraperitoneal (i.p.) dose på 1 x 10
8 PFU tom Ad (eksperimentelt tidslinjen vist i figur 3A). Denne virale immunisering ordningen førte til utviklingen av robuste anti-Ad humoral immunrespons hos disse musene (figur S1 i File S1). Syngene prostatakreft (RM-9 eller MycCaP [36]) ble deretter etablert subkutant 3 uker etter grunn viral immunisering. Den subkutane modellen ble valgt over den ortotopisk en for denne første proof-of-hovedstudie for å lette muligheten for intratumoral administrering viral, tumorstørrelse vurdering, samt dempningen av bioluminescent signaler fra dypere prostatatumorer. Når svulster ble følbar (4-5 dager for RM9, 5-7 dager for MycCaP), daglig i.p. injeksjon av RAPA eller fortynningsmiddel ble administrert. 3 dager senere fikk dyrene den sekundære intratumoral injeksjon av FL-uttrykkende Ad (1 x 10
8 PFU for RM9; 5 x 10
8 PFU for MycCaP). Bioluminescent avbildning ble utført for å overvåke FL uttrykk. I RM-9 tumormodell, høy (5 mg /kg), middels (1,5 mg /kg) og lav (0,5 mg /kg) doser av RAPA ble testet; Alle doseringer forbedret FL ekspresjon på dag 4 i forhold til mus som mottok fortynningsmidlet (kontroll). Transgene uttrykk forsvant på dag 7 i kontrollmusene, men var fortsatt påvises i RAPA behandlet gruppene (Figur 3B). I FVB kompatibel MycCaP tumormodell, bare 5 mg /kg RAPA ble testet; Musene ble fulgt av avbildning i 21 dager. Som vist i figur 3C-D, økt RAPA FL uttrykk nivå på dag 4, og betydelig utvidet transgen utholdenhet i minst 21 dager, som var den siste gangen punktet testet. Til sammen våre resultater viser at selv under utfordringen med pre-eksisterende immunitet, kan RAPA forsterke uttrykket av Ad-levert bildebehandling reporter gen og forlenge den diagnostiske vinduet. Disse dataene støtter også at tilrettelegging effekter Rapa ikke er svulst modell- eller mus belastning spesifikke.
(A) tidsplan for pre-immunitets modeller. Dyrene ble primet med en intraperitoneal dose på 1 x 10
8 PFU tom Ad og 3 uker senere, ble subkutane svulster vaksinert. RM9 svulster ble følbar 4-5 dager etter implantasjon; MycCaP svulster ble følbar 5-7 dager etter implantasjon. På dette punktet, rapamycin eller kontroll behandling initiert og intratumoral Ad avbildnings vektorer ble gitt 4 dager senere. Daglig rapamycin behandlingen pågikk til slutten av studien. FL bioluminescent avbildning ble utført ved tidspunkter indikert i B og C. (B) FL bioluminescent avbildning av RM-9 bærende C57BL /6 mus på dag 4 og 7. Høy: 5 mg /kg /dag rapamycin; Medium: 1,5 mg /kg /dag; Lav: 0,5 mg /kg /dag. n = 3. (C) FL bioluminescent avbildning av MycCaP bærende FVB mus (n = 3 eller 4) ved angitte tidspunkter. (D) Kvantifisering av bildesignalet fra C. Color bar av selvlysende avbildning: foton teller. Feilfelt: gjennomsnitt ± SEM (n = 4 for Ad bare; n = 3 for Ad + RAPA). * P 0,05, ** P. 0,01 ved tosidig
t
test
Rapamycin trykt anti-annonse adaptive immunresponser
For å undersøke videre mekanismen bak Rapa er fremme effekter på Ad transgene uttrykk i pre-vaksinert verter, vi først undersøkte titer av anti-Ad-antistoffer i mus sera på slutten av tidligere studier. I RM-9-modellen, både middels og høye doser rapa, men ikke den lave RAPA dose, hindret sekundær produksjon av anti-Ad IgG i pre-immunisert C57BL /6 mus (figur S2 i File S1). En rettssak med større gruppestørrelse viste at høy dose RAPA redusert IgG titer fra 1,36 ± 0,33 × 10
5 til 9,88 ± 2,02 × 10
3 (P = 0,0021, tosidige
t
test ; n = 8) (figur 4A). Tilsvarende redusert RAPA endepunktet IgG titer med nesten 3 ganger i forhånds vaksinert FVB mus (P = 0,0368, tosidige sammen
t
test; n = 3-4) (Figur 4A). Disse data er i overensstemmelse med tidligere studier som viser RAPA hemming på Ad-fremkalte B-celleaktivering og IgG-produksjon [20]. Av notatet, vi fokusert på titer av IgG løpet IgM fordi IgM sekresjon forut at av IgG og var av en lavere magnitude i disse forhånds vaksinert dyr. I tillegg vil sekundær viral eksponering indusere isotypeskifte til IgG [37]. Ikke desto mindre, Xu et al. nylig rapportert hemmende effekter av naturlige IgM antistoffer på Ad transduksjon [38]; i lys av disse resultater viste vi at RAPA oppviste også undertrykkende effekt på nivået av IgM som kan binde seg til Ad (figur S3 i File S1).
(A) FVB og C57BL /6-mus ble behandlet i henhold til protokollen vist i figur 3A. Museserumprøver ble samlet ved slutten av studien og utsatt for ELISA for anti-Ad antistoff titrering (FVB: betyr fra 3 uavhengige forsøk, *, P = 0,0368 av tosidige sammen
t
test C57BL /. 6: representative data fra 2 uavhengige studier (n = 10); **, P = 0,0021 av tosidige
t
test). Feilfelt: middel + SEM. (B) Representant immunfluorescens farging av tynne snitt fra RM-9 svulster med angitte behandling. Pink, makrofag markør F4 /80; grønn, blodkar markør CD31; blå: DAPI. Scale bar = 200 mikrometer. (C) RM-9 tumor fra angitte behandlingsgrupper ble dissosiert og underkastet strømningscytometri-analyse for myeloide og T-celler populasjoner. Myelogen celle avstamning ble definert av CD11b farging. Feilfelt: gjennomsnitt ± SEM (n = 5). ns, ikke signifikant; **, P 0,01; ***, P 0,001 sammenlignet med Ad eneste gruppen med to-tailed uparede
t
test. (D) MycCaP svulster fra kontroll eller rapamycin-behandlede dyr (n = 3) ble høstet ved 1,5 cm diameter, dissosiert, og deretter inkubert med vanlig papir eller medium inneholdende adenovirus og Ad-infiserte MycCaP cellelysat i 3,5 timer ved 37 ° C , farget med intracellulære IFN-y-antistoffer og underkastes flowcytometri. IFN-γ uttrykk med stimuleringen ble deretter normalisert til tilsvarende ikke-stimulert kontroll (angitt som 100%). T-celleundersett ble avgrenset av CD4 og CD8 farging. Feilfelt: gjennomsnitt + SEM (n = 3). *, P = 0,0431 ved tosidig uparet
t
test.
Deretter utforsket vi RAPA rolle i modulerende cellebasert anti-Ad immunitet [26,28]. Spesielt vurderes vi begge infiltrasjon og aktivering av immunceller i Ad-injisert svulster. I RM-9 modell, immunfluorescens farging avdekket større infiltrasjon av F4 /80 positive makrofager utløst av Ad injeksjon. Imidlertid makrofaginfiltrering ble markert undertrykket ved RAPA (figur 4B). Vi så brukt strømningscytometri for å oppnå en bedre kvantifisering av intratumorale myeloide cellepopulasjoner (CD11b + /CSF1R +). I samsvar med immunfluorescens farging resultater, RAPA behandling betydelig redusert myeloid infiltrasjon i svulstene (figur 4C, først panel). Spesielt kan celler som uttrykker koloni-stimulerende faktor-1-reseptoren (CSF1R), et avgjørende molekyl for differensiering av makrofager, DC, og andre myeloid-avledede monocytter [39], ble nesten fullstendig eliminert ved RAPA (figur 4C, andre panel) i disse tumor infiltrerer myeloide celler. Videre har både modne (CD69 +) og umodne (CD62L +) fenotyper av CD4 + T-celler (CD11b- /CD4 +) ble redusert med RAPA (figur 4C, tredje panel), noe som tyder på at både rekruttering og aktivering av CD4 + T-celler ble hemmet. CD8 + cytotoksiske T-celler (CD11b- /CD8 +), så også ut til å være redusert med RAPA (figur 4C, siste panel) selv om CD8 + innholdet av RM-9 tumorer var meget lav, og således vanskelig å måle nøyaktig. Interessant, i samsvar med andre rapporter [20], redusert RAPA tumor angiogenese, noe som reflekteres ved redusert farging av vaskulaturen CD31 markøren (figur 4B), som tilbyr en annen mulig mekanisme som ligger til grunn RAPA hemming av immuncelleinfiltrasjon og aktivering observert i denne modellen.
Deretter søkte vi å finne ut om RAPA kan påvirke reaktiviteten av tumor infiltrerer immunceller mot Ad og Ad-infiserte, transgene-uttrykke kreftceller. IFN-γ, en viktig regulatorisk cytokin for T celle utvikling og aktivisering, ble valgt som en avlesning for immunceller funksjonalitet. MycCaP svulster, etablert i mus med pre-immunitet til Ad, som nevnt i figur 3A og C, ble høstet på 1,5 cm diameter og dissosiert til enkeltceller. De dissosierte celler ble deretter inkubert med medium eller med en «stimulering» cocktail bestående av adenovirus partikler og cellelysat fra MycCaP celler infisert med FL-uttrykkende virus. IFN-γ produksjon fra T-celler ved stimulering ble deretter vurdert av intracellulær farging og flowcytometri. Som vist på figur 4D, i kullet uten RAPA behandling (- kontroll), Ad-mediert stimulering resulterte i en 35% økning av IFN-γ ekspresjon i CD4 + T-celler i løpet av den ikke-stimulerte (vanlig media) baseline; imidlertid, T-celler fra RAPA behandlede tumorer var ikke reagerer på disse stimuli. Reaktiviteten av de sjeldne CD8 + -T-celler i MycCaP tumorer som syntes å være uendret av RAPA. Kollektivt, tilsetning av RAPA til Ad-mediert genoverføring tumor protokoll redusert infiltrasjon av myeloid og T-immunceller i svulsten miljø; det også avstumpet T-celle reaktivitet mot virusrelaterte stimuli.
Rapamycin forsterkes Ad-sr39tk /GCV genterapi i pre-immuniserte mus
Neste vi testet evnen til rapamycin å øke Ad-mediert selvmord genterapi via den forbedrede herpes simplex virus tymidinkinase (HSV-tk) genet, sr39tk, og dets prodrug ganciclovir (GCV) [40]. For å velge en passende modell for å studere sr39tk /GCV basert terapi, ble mottakelighet av RM9 og MycCap celler vurderes. Begge cellelinjer ble infisert med sr39tk-uttrykk Ads ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 100 og behandlet ved angitte doser av GCV fra dag 2 til dag 7 pi. Levedyktigheten av RM9 celler ble ikke endret ved ekspresjon av sr39tk eller tilstedeværelsen av GCV, mens MycCap celler var følsomme for denne behandling (figur 5A). Derfor er det MycCap modellen valgt; dessuten PSE-TSTA [3] prostata-spesifikke promoter oppviste robust transkripsjonen aktivitet i MycCap celler (figur 5A og S4 i File S1), og dermed vil det bli brukt i de følgende terapeutiske eksperimenter.
(A ) MycCap og RM9 celler ble infisert av Ad-PSE-TSTA-sr39tk, Ad-CMV-sr39tk eller ingen virus på MOI = 100 og behandlet ved indikerte konsentrasjoner av GCV fra dag 2 til dag 7 pi. Celleviabilitet ble målt ved CCK- 8 assay på dag 7 og normalisert til den ikke-virus, null GCV tilstand (den stiplede linje). Forsøk ble utført i duplikater.
