Abstract
Bakgrunn
Spytt (spytt) er en voksende biofluid klar for påvisning av kliniske sykdommer. Selv om begrunnelsen for orale sykdommer applikasjoner (f.eks munnhulekreft) er intuitiv, begrunnelsen og forholdet mellom systemiske sykdommer og spytt biomarkører er uklare.
metodikk /hovedfunnene
I denne studien brukte vi musemodeller av melanom og ikke-småcellet lungekreft og sammenlignet de transkriptomet biomarkør profiler av tumorbærende mus til de av kontroll mus. Mikromatriseanalyse viste at spytt transcriptomes ble signifikant endret i tumorbærende mus sammenlignet med kontroller. Betydelig overlapping blant transcriptomes av mus svulster, serum, spyttkjertler og spytt tyder på at spytt biomarkører har flere opphav. Videre identifiserte vi at uttrykket av to grupper av vesentlig endrede transkripsjonsfaktorer (TFS) Runx1, Mlxipl, Trim30 og Egr1, Tbx1, Nr1d1 i spyttkjertelen vev av melanom bærende mus kan potensielt være ansvarlig for 82,6% av oppregulert genekspresjon og 62,5% av den nedregulert genekspresjon, henholdsvis i spyttet til melanom-bærende mus. Vi viste også at ektopisk produksjonen av nervevekstfaktor (NGF) i melanomtumorvevet som en tumor-utgitt mediator kan indusere ekspresjon av TF Egr-1 i spyttkjertelen.
Konklusjoner
til sammen våre data støtter konklusjonen om at på systemisk sykdom utvikling, kan betydelige endringer oppstår i spytt biomarkør profil. Selv om opprinnelsen til de sykdomsinduserte spytt biomarkører kan være både systemisk og lokal spiller stimulering av spyttkjertel av meklere løslatt fra eksterne svulster en viktig rolle i å regulere spytt surrogat biomarkør profiler
Citation. Gao K, Zhou H, Zhang L, Lee JW, Zhou Q, Hu S, et al. (2009) systemisk sykdom-indusert Spytt biomarkør Profiler i musemodeller av melanom og ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 4 (6): e5875. doi: 10,1371 /journal.pone.0005875
Redaktør: Benjamin Rich, Harvard Institute of Medicine, USA
mottatt: 05.01.2009; Godkjent: 16 mai 2009; Publisert: 11 juni 2009
Copyright: © 2009 Gao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av NIH tilskudd RO1 DE017170 og R21 CA126733 til DTW de organer hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Spytt havner et bredt spekter av proteiner /peptider, nukleinsyrer, elektrolytter, og hormoner som kommer i flere lokale og systemiske kilder. De biokjemiske og fysiske og kjemiske egenskaper spytt støtte sine viktige funksjoner i oral helse slik som fordøyelsen, antibakteriell aktivitet, og opprettholdelse av integriteten av tennene [1], [2]. For eksempel, er xerostomia en oral sykdom forårsaket av en dysfunksjon av spyttkjertler, som er ledsaget av nedsatt eller manglende sekresjon av spytt og er årsaken til karies og frodig mukositt.
Diagnostisk, et antall funn i siste tiår har ført til interesse for bruk av spytt som en kilde av biomarkører. Den oppløselige fragment av c-erbB-2 var påviselig i spyttet hos brystkreftpasienter, men ikke i friske kontroller eller pasienter som bærer godartede svulster [3]. Nivåer av hormoner (f.eks kortisol, oxytocin) og legemidler (for eksempel cisplatin, nikotin, metadon) i spytt reflektere deres konsentrasjon i serum [4], [5], [6]. I 2004 spytt-baserte HIV testing ble godkjent av US Food and Drug Administration (FDA).
En betydelig løft til det vitenskapelige grunnlaget og infrastruktur av spytt diagnostikk forskning kom for seks år siden da National Institute of Dental Kraniofacial forskning (NIDCR) gjort en betydelig investering mot å utvikle bruken av spytt som et diagnostisk verktøy. Spytt har siden blitt en biofluid som er klar for translasjonsforskning og kliniske applikasjoner. Av notatet er modningen av spytt proteomet, den første implementere i den diagnostiske verktøykasse for spytt basert diagnostikk. Vi vet nå er det 1166 proteiner i menneskets spytt, funksjoner som spenner fra strukturell binding til deltakelse i ulike biologiske prosesser [7]. En annen diagnostisk ressurs i spytt har siden dukket opp, spytt transkriptom. Ved hjelp av spytt transkriptomet som et diagnostisk verktøy, ble et sett av 185 mRNA identifisert som «normal spyttkjerne transkripsjoner» (NSCT) [8]. Videre har spytt transkriptomet blitt vist å være klinisk diskriminerende for detektering av oral cancer og Sjøgrens syndrom (SS). Kombinasjonen av syv spytt transkripsjoner biomarkører (
IL8, IL1B, DUSP1, HA3, OAZ1, S100P, og SAT
) kan brukes til å skille mellom spytt av pasienter med oral plateepitelkarsinom (OSCC) og som av kontroller med 91% sensitivitet og spesifisitet [9]; mens fem spytt proteomic markører (M2BP, CD59, katalase, MRP-14 og profilin) sammen viser en 93% sensitivitet og spesifisitet henholdsvis for å påvise kreft i munnhulen ved hjelp av spytt [10]. En annen studie viste at 27 mRNA og 16 peptider i spyttprøver av SS pasienter var betydelig opp- eller nedregulert [11]. Teknologien av spytt transkriptomet har nylig blitt avansert til exon nivå med kapasitet til omfattende profil spytt transkriptomet ved hjelp av en ekson-basert teknologi [12].
Det er mange fordeler ved å bruke spytt som en klinisk diagnostisk biofluid . Prøvetaking er enkel, ikke-invasiv, og forårsaker lite angst på den delen av pasientene. Bruken av spytt tilbyr også en kostnadseffektiv tilnærming for store skjermer [6].
Bruk av spytt for påvisning av orale sykdommer er blitt bekreftet, men bruken for systemisk sykdom er i stor grad uklart. Mens rapporter har beskrevet påvisning av biomarkører for systemisk kreft i spytt (f.eks c-erb2 hos brystkreftpasienter), mekanismene bak dette fenomenet er fortsatt ubekreftet. Målet med denne studien var å utforske vitenskapelige bevis og gi en begrunnelse for bruk av spytt for systemisk sykdom deteksjon. Vi brukte syngeniske mus tumormodeller for å utvikle tumorer i avstand fra munnhulen, og som brukes spytt transkriptomet som biomarkør profil avlesning (fig. 1). Spytt transkriptomet har blitt vurdert som et vitenskapelig troverdig og under biomarkør kilde i spytt [8], [9], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17 ], som tillater høy gjennomstrømning analyser og utlesning er nødvendig for undersøkelsene
mus (enten C57BL /6 mus eller DBA /2-mus) ble tilfeldig delt inn i to grupper som følger:. kontrollgruppen (kontroll mus ) og tumor gruppe (tumor-mus) (15 dyr per gruppe). PBS ble injisert i kontrollmusene mens musene i gruppe tumor ble injisert med tumorcellene. Svulster etablering tok ~3 uker. Spytt, spyttkjertel, serum og tumorvev ble tatt fra hver mus. Fem mus hvert ble slått sammen til en gruppe og behandlet for å profilere sin transkriptomet av uttrykket mikromatriser.
Resultater
Betydelige sykdomsinduserte forskjeller mellom spytt transkriptomet biomarkør profiler i tumorbærende og kontroll mus
for å vurdere om spytt transkriptomet biomarkør profilendringer ved utvikling av en ekstern svulst, utførte vi microarray analyse for å sammenligne transkriptomet biomarkør profilene i spytt av kontrollmusene (tre grupper, 5 mus i hver gruppe) med tumorbærende (melanom eller lunge) mus (tre grupper, 5 mus i hver gruppe) (fig. 1). Det er nødvendig å ha fem mus i hver tumor eller kontrollgruppe for å samle tilstrekkelig spytt for RNA-isolering. Biomarkør utvalgskriteriene ble satt som foldendring 2 og
P
0,05. Vi identifiserte 152 signifikant oppregulert kjente gener og 359 signifikant nedregulert kjente gener (Fig. 2A, Tabell S3 og S4) i spyttet til melanom-bærende mus sammenlignet med kontroll mus. Tilsvarende fant vi 290 signifikant oppregulert utskrifter og 784 signifikant nedregulert transkripsjoner (Fig. 2B, .table S5 og S6) i spyttet til lungekreft bærende mus sammenlignet med kontroll mus.
En
, Cluster analyse av 152 oppregulert kjente gener (som representerer 225 probsets, venstre panel) og 359 nedregulert kjente gener (som representerer 403 probsets, høyre panel i) forskjellig uttrykt i spytt av melanom mus kontra kontroll mus (P-verdi 0,05; fold endring ≥2). Ekspresjonselementene profiler ble standardisert til å ha null middelverdi og standardavvik enhet. Rød og grønn representerer høye og lave nivåer etter standardiseringen, henholdsvis.
B
, Cluster analyse av 290 oppregulert og 784 nedregulert probesets forskjellig uttrykt i spytt av lunge karsinom mus kontra kontroll mus (P-verdi 0,05; fold endring ≥2).
C Hotell og
D
, Overlapping av differensiert genuttrykk mellom melanom modell og lungekreft modell.
C
, overlapping av 225 oppregulert gener i melanom modellen og 290 oppregulert gener i lungekreft modell.
D
, overlapp av 403 nedregulert gener i melanom modellen og 784 nedregulert gener i lungekreft modell.
Vi har også overlappet differensiert genuttrykk i spytt av melanom mus med den for lungekreft mus. Sammenligne oppregulert eller nedregulert spytt gener i to modeller, henholdsvis, fant vi 11 oppregulert (Fig. 2C) og 17 nedregulert (Fig. 2D) transkripsjoner eksisterer i begge modellene. Imidlertid, tatt i betraktning de forskjellige genetiske bakgrunn og cancercellelinjer i de to muse moduser, er det ikke overrasket over at bare en brøkdel av totale endrede gener ble overlappet (4,8% (11/225) eller 3,8% (11/290) oppregulert gener i melanom modell eller kreft modell lunge, henholdsvis;. 4,2% (17/403) eller 2,1% (17/784) nedregulert transkripsjoner i de to modellene, henholdsvis)
Flere kilder bidra til svulsten indusert spytt mRNA profil endring
for å undersøke mulige kilder som bidrar til spytt transkriptom endringer i mus som svar på systemisk sykdom, filtrert vi uttrykket profilering data for melanom-bærende mus (tumor, serum, spyttkjertel og spytt) for å velge «til stede» mRNA med en
P
verdi 0,001 og en intensitet verdi 200. I det melanom-modellen, 20175, 5493, 19904, og 306 transkripter ble identifisert i svulsten, serum, spytt og spyttkjertel, henholdsvis (fig. 3A). Etter å ha overlappende alle de foreliggende genene fra svulsten, serum, spytt og spyttkjertel, fig. 3B viste at av de 306 transkriptene til stede i saliva, 67,6% er også til stede i melanom-tumorvevet, 51,6% er også til stede i serum og 69,6% er også til stede i spyttkjertel. Disse data indikerer at opprinnelsen til den foreliggende transkriptomet i spytt kan være forbundet med forskjellige avdelinger i hele kroppen utgjør totalt ~75.2% av de 306 spytt transkripter. I tillegg gjorde 24.8% av de 306 utskrifter ikke overlapper med gener i svulsten, spyttkjertel og serum, noe som tyder på at de kan stamme fra munnhulen.
En
, Overlapp transkripsjoner presentere i spytt, spyttkjertel, serum og tumor på melanom-bærende mus.
B
, Av de 306 spytt transkripsjoner, var 69,6% til stede i spyttkjertel, 51,6% til stede i serum, 67,6% til stede i tumor (melanom), og 24,8% kan stamme fra munnhulen (lokal).
endret uttrykk for transkripsjonsfaktorer (TFS) i spyttkjertlene melanom-bærende mus korrelerer med endret transkripsjonsfaktor-mediert genuttrykk endringer i mus spytt
Siden spytt transkriptomet var tydelig endret i tumorbærende mus sammenlignet med kontroll, hypotese vi at svulstene oppfører seg som endokrine organer ved at de utskiller mediatorer (hormoner, lymfokiner, cytokiner) som kan påvirke aktiviteten av TF i spyttkjertlene og derved induserer opp eller ned-regulering av transkripter nivåer i spytt.
Selv om de to musekreft modeller i denne studien er veletablert [34], [35], simulerer melanom musemodell human melanom bedre enn kreft modell lunge teoretisk og patologisk fordi både menneskelig melanom og denne musen melanom oppstå subkutant. Derfor har vi brukt melanom bærende C57BL /6 mus som en fungerende modell for å teste vår hypotese.
Vi først sammenlignet genuttrykk profiler av spyttkjertelvevet i melanom bærende mus med kontroll mus og identifisert en liste av 46 signifikant oppregulert TFS (endring 2 og
P
0,05) (Tabell S1). Vi deretter beregnet korrelasjonskoeffisientene mellom uttrykk profiler av disse vesentlig endret TFS og differensielt uttrykte gener (både opp- og ned-regulert) i spytt av melanom-bærende mus. TFS ble deretter rangert etter antall høyt co-uttrykte gener hvis korrelasjon med TF uttrykket er 0,5. De 6 oppregulert TFS med høyest ranking var RunX1 (runt relatert transkripsjonsfaktor 1), MLXIPL (musculus MLX samspill protein-aktig) og TRIM30 (tredelt motiv protein 30) for oppregulert spytt gener og Egr1 (tidlig vekstfaktor-1), Tbx1 (T-box 1) og Nr1d1 (musculus atom reseptorunderfamilien 1, gruppe D, medlem 1) for nedregulert spytt gener (fig. 4A, E, F).
A
, de 6 TFS (
Runx1, Trim30, Mlxipl, Egr1, Nr1d1, TBX1
) er betydelig uttrykt høyere i spyttkjertelen av melanom bærende mus vs. kontroll mus (P 0,05, Tabell S1).
B
, mRNA uttrykk nivåer av disse 6 TFS (
Runx1, Trim30, Mlxipl, Egr1, Nr1d1, TBX1
) i spyttkjertelen av melanom mus vs at av normale mus validert av qRCR . Den horisontale stiplede linje indikerer nivået av genekspresjon i kontrollmus, som er vilkårlig satt til 1. Søylene representerer genekspresjon nivå i spyttkjertel av melanom mus i forhold til kontrollmus. Forsøkene ble gjort i tre paralleller; barer, SD.
C
, Expression nivåer av fem TFS (Runx1, Mlxipl, Egr1, Nr1d1, og TBX1) i spyttkjertelen vev av kontroll mus og melanom mus ble målt ved immunoblotting. (C1, C2, C3 og T1, T2, T3 er den samme batch av vev som brukes i mikromatriseanalyse). Legg merke til at kommersielle antistoff var ikke tilgjengelig for murine Trim30.
D
, Relative protein uttrykk nivåer av de ovennevnte fem TFS i melanom mus vs. kontroll mus. Signalstyrken for blot i Figur 4
C
ble kvantifisert av Image J programvare (NIH). Den horisontale stiplede linje angir uttrykket nivåer av disse 5 TF’er i kontrollmusene, noe som er vilkårlig satt til 1. kolonnene viser at den relative proteinnivåene av de 5 TF’er i tumor-bærende mus sammenlignet med kontroll-mus; barer, SD.
E Hotell og
F
, Uttrykket av 6 TFS (
Runx1, Trim30, Mlxipl, Egr1, Nr1d1, TBX1
) i spyttkjertelen av melanom mus ble korrelert med differensiert genuttrykk i musen spytt. Tre av dem (Runx1, Trim30 og
Mlxipl
) kan være potensielt ansvarlig for 180, 35 og 16 av de oppregulert spytt transkripsjoner i melanom mus (
P
0,05), henholdsvis , mens de andre 3 TFS (
Egr1, Tbx1 og Nr1d1
) er potensielt korrelert med 119, 116 og 77 nedregulert spytt transkripsjoner (
P
0,05).
G
, Uttrykket av de 3 TFS (Runx1, Trim30 og Mlxipl) helt korrelert med 82,6% ((180 + 5 + 1) /225 = 82,6%) oppregulert genuttrykk i melanom mus spytt etter overlappende alle spytt gener som har sammenheng med disse 3 TF’er fra fig. 4
E
.
H
, Uttrykket av de andre 3 TFS (Egr1, TBX1 og Nr1d1) helt korrelerte med 62,5% ((119 + 58 + 2 + 73) /403 = 62,5%) nedregulert genuttrykk i spytt av melanom mus ved å overlappe alle spytt gener som har sammenheng med disse 3 TF’er fra fig. 4
F
.
Deretter de endrede uttrykk mønstre av disse spyttkjertel TFS ble validert både på transkripsjon og proteinnivået ved qPCR og immunoblotting. Figur 4
B
viser at mRNA-nivåene av de seks TFS er økt fra 3 til 16- fold i spyttkjertlene melanom-bærende mus sammenlignet med kontroll mus. Immunoblotting deteksjon ved hjelp av 5 kommersielt tilgjengelige murine TFS antistoffer avslørte 1.5 til 3.5 ganger høyere nivåer av disse TFS uttrykk i spyttkjertlene melanom-bærende mus enn hos kontroll mus (Figur 4
C og 4D
). Deretter Figur 4
E og F
viser at de ovennevnte 6 TF’er var assosiert med en rekke differensierte genekspresjon i mus spytt. Etter overlapp de tilhørende genene i hver TF, kan det sees at de endrede aktiviteter av tre TFS (RunX1, MLXIPL og TRIM30) potensielt kan være ansvarlig for 83% av de opp-regulert mRNA i spytt (fig. 4
G
), mens de kollektive endrede aktiviteter Egr1, Tbx1 og Nr1d1 kan potensielt utgjøre 63% av nedregulert uttrykk for spytt mRNA (fig. 4
H
).
EGR-1 signalveien og deteksjon av nervevekstfaktor (NGF) i melanom svulstvevet og serum
for å undersøke om de utviklede svulster kan formidle den endrede uttrykk for TFS i spyttkjertlene tumorbærende mus, vi undersøkte NGF /Egr1 signalveien fordi Egr1 ble identifisert som en oppregulert TF i spyttkjertelen av melanom-tumor mus. Det er vel kjent at Egr-1 er et TF i NGF signalveien [18], [19] (fig. 5A). Vi har derfor hypotese at NGF blir utskilt inn i sirkulasjonen av melanom, sirkulerer i spyttkjertelen hvor den aktiverer reseptor-mediert signalkaskade som fører til Egr-1 oppregulering og induksjon av spesifikk gentranskripsjon og proteintranslasjon. Figur 5B viser at NGF er produsert i melanom vev på et betydelig høyere nivå enn i normal hud (
P
0,001). Figur 5C viser at NGF er også vesentlig høyere i serumet til melanom-bærende mus sammenlignet med kontroll-mus (
P
0,05). Til sammen tyder disse data på at melanom kan produsere NGF og utskilles det i blodet. Ved oppnådd spyttkjertler, kan de økte NGF-nivåene i blodet deretter stimulere den økte ekspresjon av TFS som Egr-1 fører til forandret genekspresjon og proteinprofiler i spyttet til melanom-bærende mus.
A
, En vei som involverer transkripsjonsfaktor Egr1. Nervevekstfaktor (NGF) kan være en oppstrøms faktor på Egr1.
B
, Expression av NGF i mus hud og melanom vev målt med ELISA. Kolonnene er absolutte middelverdier av NGF-konsentrasjon i vev fra fem mus melanoma. ***,
P
0,001.
C
, Expression av NGF i serum av kontroll mus og kreft mus. Kolonnene er absolutte middelverdier av NGF-konsentrasjonen i serum fra fem kontrollmusene og fem mus melanoma. Bar, SD. **
P
0,05
Diskusjoner
Studier har vist at potensialet for bruk av spytt som et diagnostisk biofluid i translasjonell og kliniske applikasjoner. Som en biologisk prøve, er spytt billig og lett tilgjengelig ved ikke-invasive midler. Den omfattende kunnskapsbase av spytt diagnostiske sammensetning gir en verdifull og informativ ressurs for biomarkører (www.skb.ucla.edu). Meget diskriminerende spytt biomarkører for to orale sykdommer: kreft i munnhulen og Sjøgrens syndrom har blitt identifisert og validert [9], [11]. Imidlertid er koblingen mellom systemiske sykdommer og spytt biomarkører fortsatt uklart. I denne studien brukte vi musemodeller av kreft for å avgjøre om spytt biomarkør profiler blir påvirket av distal sykdomsutvikling. Våre data viser at spytt transkriptom profilene endres i vesentlig grad i mus som bærer en av to tumorer: melanom og lungekarsinom (Fig. 2.). Hver tumor-type var assosiert med en annen spytt transkriptom profil. I tillegg er analysen av NGF-produksjon og TF Egr1 tyder på at produksjonen av vekstfaktorer i tumorvevet representerer en mekanisme hvorved en fjern svulst kan endre transkriptomet av spyttkjertelen og dermed spytt. Disse funnene viser også at spyttkjertlene kan spille en nøkkelrolle i formidling av tumor-indusert endringer i spytt transkriptomet biomarkør profil. I tillegg til å vise at sykdom-indusert sirkulerende biomarkører kan finne veien inn i spytt, disse funnene tyder på at sykdom-indusert spyttkjertel surrogat biomarkører kan ha diagnostisk verdi for påvisning eller overvåking av systemiske sykdommer.
Siden vår første rapport om spytt transkriptomet [8], [9], har vi vært å undersøke opprinnelsen til spytt mRNA, som synes å være forskjellig fra mRNA som finnes i andre kroppsvæsker. Nukleinsyrene i serum hos kreftpasienter er antatt å være felle direkte fra kreftceller, eller for å bli gitt ut som et resultat av cellelysering i skadede organer mens nukleinsyrene i urin kan komme fra blod mRNA eller DNA [20], [21 ]. I en studie av menneskelig spytt, kan transkripsjoner i spytt transkriptomet påvises i alle kilder til spytt inkludert parotidkjertelen, submandibular og sublingual kjertler, gingival crevikulære væske og muntlige epitelceller [16]. Det har nylig blitt vist at flertallet av mRNA i spytt transkriptomet har en AU-rik element (ER) i sin 3’UTR som gir stabilitet ved kompleksdannelse med ARE-bindende proteiner [17]. I denne studien sammenlignet vi transcriptomes av svulsten, serum, spyttkjertler og spytt og fant spytt transkriptomet i tumorbærende mus svært overlappet i stor grad sammen med de transcriptomes av spyttkjertel, serum og tumor. Disse analysene tyder på at det kan være flere opprinnelse spytt mRNA og /eller som en kompleks systemisk forhold kan eksistere mellom munnhulen og systemisk helse.
Vi har undersøkt mulige mekanismer som de fjerne svulster megle endringer i spytt biomarkør profiler i tumorbærende mus. Tidligere studier har vist at systemiske sykdommer eller behandlinger kan påvirke funksjonen av spyttkjertelen som resulterer i forandringer i sammensetningen av spytt [22], [23], [24]. Spytt natrium og proteinnivåer ble forhøyet etter interleukin-2 (IL-2) behandling av pasienter. En studie ved hjelp av en musemodell viste også at nivåene av inflammatoriske faktorer som IL-1beta økt i spytt etter fjern betennelse i kroppen [24]. Som spyttkjertelen er den viktigste kilden til spytt, hypotese vi at spyttkjertlene kan være ansvarlig for spytt spesifikk biomarkør endringer knyttet til distale svulster. Siden vår forsøket ble utført i tre eksemplarer, kan Bayesiansk metoden være aktuelt. Men denne metoden krever spesifikke modellforutsetninger for dataene. Endelig Expression konsollen (Affymetrix, Inc.) og Dchip (https://biosun1.harvard.edu/complab/dchip/) programvare ble brukt i denne studien. For melanom syngenisk modellen, identifiserte vi 46 TFS er signifikant oppregulert i spyttkjertlene hos de melanoma-bærende mus som kan føre til direkte induksjon eller undertrykkelse av genekspresjon. De relative fold endringer av TF uttrykk som Egr1 og Nr1d1 er forskjellig mellom mRNA nivåer og proteinnivåer, som kan gjenspeile translasjonell modifikasjon eller proteasomal degradering [25]. Vi har da funnet at disse endrede ekspresjon av TFS er forbundet med melanom-indusert transkriptomet i spytt. Vi fant at ca 83% av betydelig oppregulert transkripsjoner i spyttet kan regnskapsføres etter tre TFS (Runx1, Trim30 og Mlxipl) (Fig. 4G) og 63% av betydelig nedregulert spytt transkripsjoner kan gjøres rede for med ytterligere tre TFS (Egr1, TBX1 og Nr1d1) (fig. 4H). Sammen disse funnene tillate oss å konkludere med at spyttkjertlene tjene en tidligere verdsatt rolle som et organ overvåking systemisk sykdom ved å fremkalle sykdomsspesifikke TFS og endre uttrykket av spesifikke gener og oversettelse av de tilsvarende proteiner. Disse endrede spytt mRNA og proteiner er sykdomsassosierte surrogat biomarkører som skilles ut i kjertel væsker og inn i munnhulen som helhet spytt.
Siden induksjon av TFS uttrykk i spyttkjertlene skjedde i mus med en distal tumor vi videre hypotese er det kreftspesifikke meklere som kan påvirke den endrede TG uttrykk i spyttkjertlene. Det er velkjent at svulster ectopically uttrykke meklere som har systemiske effekter på distal organer og tilrettelegge metastasering av kreft celler [26], [27]. Melanomer er kjent for å ectopically uttrykke TGF-beta [28] mens lungesvulster ectopically ekspress gonadotropiner og andre hormoner [29], [30]. Vi har undersøkt om en slik signalveien kan i forbindelse med en av de identifiserte TFS som kan være ansvarlig for induksjon eller undertrykkelse av spytt transkriptomet i musemelanommodellen. Faktisk er NGF kjent for å stimulere ekspresjon av TF Egr-en gjennom en godt studert signalveien (Fig. 5A). Ved hjelp av en NGF-ELISA-analyse, ble det observert at konsentrasjonen av NGF i melanoma vev og serum er betydelig høyere enn i (Fig. 5B-C) motstykke kontroll vev. Disse data antyder en biologisk scenario og begrunnelsen i hvilken det fremkallende musetumor utskiller NGF i sirkulasjonen, hvor det sirkulerer i blodet til spyttkjertlene og bindes til NGF-reseptorer uttrykt ved spytt akinærceller, aktivere en signalveien som fører til oppregulering av Egr-1 mRNA og proteinnivåer. Det bør bemerkes at melanomceller er utledet fra melanocytter, som migrerer fra den nevrale kløft under embryonal utvikling. NGF kan stimulere spredning og metastasering av melanom celler [31]. På den annen side har NGF og dens reseptor (TrkA IR og TrkC IR) ble funnet i spyttkjertelen [32], [33]. Derfor er det rimelig å foreslå at NGF utskilt av melanom svulst ble overført gjennom blod og bundet til sine beslektede reseptorer i spyttkjertelen, til slutt resulterer i stimulering av flere TFS uttrykk inkludert Egr-1 (Fig. 6).
Meklere som NGF utskilles av eksterne svulster blir overført til spyttkjertel gjennom blod for å stimulere TFS uttrykk og endre spytt mRNA-profil.
Vi har også målt NGF nivåer i svulsten lysat av musen lunge kreft modell. Mens NGF var synlig, det var på et betydelig lavere nivå enn melanom svulst lysat (20,9 ± 4,3 pg /mg i lunge svulst vs. 75,73 ± 24 pg /mg i melanoma vev, P 0,05, ikke data vist). I tillegg ble bare 11 oppregulert og 17 nedregulert transkripter overlappet når vi sammenlignet spytt mRNA profilen av melanom-modellen til lungekreft modellen (225 oppregulert eller 403 ned-regulerte gener i melanom-modellen 290 vs. oppregulert eller 784 ned-regulert transkripter i kreft-modellen lunge, henholdsvis fig. 2C og D). Og 2 av de 17 overlappende ned-regulerte gener ble korrelert med Egr1 uttrykket (data ikke vist). Kollektivt disse dataene tillater oss å konkludere med at melanom-avledet NGF er en potensielt viktig megler i nedregulering av spesifikke spytt transkriptomet bare i melanom-bærende mus.
Selv om vår rapport ikke omfattende demonstrere mekanistiske sammenheng mellom systemisk sykdomsutvikling og spytt biomarkør endringer, vil det begynne å male bildet for konseptet at systemiske nettverk som finnes i kroppen vår, som tillater kommunikasjon mellom distal sykdommer og spyttkjertlene. Signaler sendes gjennom slike nettverk kan indusere relaterte signalveier som fører til endret genekspresjon og proteiner oversettelse og dermed gi sykdom-indusert spytt biomarkør profiler. Vi hypotese at slike sykdom-indusert spyttkjertel-mediert transcriptomes og translasjonsforskning produkter kan tjene som verdifulle indikatorer på sykdomsutbruddet og /eller progresjon. Derfor kan spyttkjertelen betraktes som et reaktivt organ overvåking systemiske sykdommer og spytt kan undersøkes som en biomarkør anriket sykdom-reflekterende biofluid. Den lokale produksjon og sekresjon av spytt fra en enkelt anatomiske kilde (spyttkjertlene), og det faktum at det kan bli brukt en enkel og ikke-invasiv måte, så vel som med forholdsvis lite ubehag for pasienten, tilveiebringe et sterkt insentiv for den videre undersøkelse av salvie som en potensiell diagnostisk indikator på systemiske sykdommer.
Materialer og metoder
Dyr
seks til åtte uker gamle DBA /2 mus og C57BL /6 mus var kjøpt fra Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) og plassert i Divisjon for Forsøksdyr Medicine (DLAM) ved University of California i Los Angeles. De eksperimentelle protokollene ble godkjent av kanslerens Forsøksdyrutvalget (ARC) ved University of California i Los Angeles (UCLA).
Cellelinjer
Murine cellelinjer KLN-205 og B16-F1 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC). KLN-205 er en ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinje opprinnelig etablert i en DBA /2 mus. Celler ble dyrket i MEM (GIBCO). Og B16-F1, en C57BL /6-avledede melanom-cellelinje, ble holdt i DMEM (GIBCO) [34]. Alle celler ble opprettholdt i en atmosfære av 5% CO2 ved 37 ° C.
In vivo
tumormodeller
Melanoma musemodell ble indusert ved subkutan (SC) injeksjon av 1 × 10
5 B16-F1 celler i 0,1 ml PBS i det nederste høyre flanke av C57BL /6 mus. Den lungekreft modellen ble etablert ved s.c. injeksjon av 2 x 10
5 KLN-205 celler i DBA /2 mus [34], [35]. Kontrolldyrene ble injisert med PBS alene. Etablerte tumorer ble observert etter 2-3 uker (Fig. 1).
samling av mus spytt, blod og tumorvev
Når tumorer nådde 15 mm i diameter spytt ble oppsamlet og mus var ofret. Mild anestesi ble indusert ved intramuskulær (IM) injeksjon av 1 ul /kg kroppsvekt av en oppløsning inneholdende 60 mg /ml ketamin (Phoenix Scientific, St. Joseph, MO) og 8 mg /ml xylazin (Phoenix Scientific). Mus ble injisert subkutant med pilokarpin (0,05 mg pilocarpin /100 g kroppsvekt) mellom ørene til stimulert spyttsekresjon. Spytt ble oppnådd fra munnhulen ved mikropipette og umiddelbart plassert i pre-kjølte 1,5 ml mikrosentrifugerør.
