Abstract
Cyclin G-assosiert kinase (GAK), en sentral aktør i clathrin-mediert membran trafficking, er overuttrykt i ulike kreftceller. Her rapporterer vi at GAK uttrykket er positivt korrelert med Gleason score i kirurgiske prøver fra pasienter med prostatakreft. Embryonale fibroblaster fra knockout mus som uttrykker en kinase-død (KD) form av GAK viste konstitutiv hyper-fosforylering av den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR). I tillegg til den velkjente EGFR-inhibitorer gefitinib og erlotinib, diett flavonoid luteolin var en potent inhibitor av den Ser /Thr kinaseaktiviteten GAK
in vitro
. Samtidig administrering av luteolin og gefitinib til PC-3 celler hadde en større effekt på celle levedyktighet enn administrasjon av hver komponent alene; denne reduksjon i levedyktighet var forbundet med drastisk nedregulering av GAK proteinekspresjon. En omfattende mikroRNA rekke analyse avdekket økt uttrykk av MIR-630 og MIR-5703 etter behandling av PC-3 celler med luteolin og /eller gefitinib, og eksogene overekspresjon av MIR-630 forårsaket vekst arrest av disse cellene. GAK ser ut til å være avgjørende for celledød fordi samtidig administrering av gefitinib og luteolin til EGFR-mangel U2OS osteosarkom cellene hadde også en større effekt på celle levedyktighet enn administrasjon av hver komponent alene. Samlet utgjør disse funnene tyder på at GAK kan være en ny terapeutisk mål for prostatakreft og osteosarkom
Citation. Sakurai MA, Ozaki Y, Okuzaki D, Naito Y, Sasakura T, Okamoto A, et al. (2014) Gefitinib og Luteolin Årsak Vekst Arrest of Human prostatakreft PC-3 celler via Hemming av cyclin G-Associated kinase og Induksjon av MIR-630. PLoS ONE 9 (6): e100124. doi: 10,1371 /journal.pone.0100124
Redaktør: Ichiro Aoki, Yokohama City University School of Medicine, Japan
mottatt: 20 februar 2014; Godkjent: 21 mai 2014; Publisert: 27 juni 2014
Copyright: © 2014 Sakurai et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Grants-i-Aid for Scientific Research S (nr 15101006), Scientific Research B (nr 20370081 og 23370086), og Utforskende forskning (nr 21651085) for å HN; og forskning C (nr 22570185) til NY fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er en av de mest diagnostisert kreft og er den ledende årsaken til mannlige kreftdødsfall på verdensbasis [1]. Fordi det er drevet primært av androgen reseptor (AR) signal-, er avansert prostatakreft vanligvis behandlet av androgen deprivasjon terapi, der kirurgisk eller medisinsk kastrering er utført for å blokkere aktiv AR signaliserer enten ved å eliminere ligand eller påvirker reseptoren direkte [2] . Selv om effektiv, androgen ablasjon kontrollerer metastatisk prostatakreft for bare et par år, og nesten alle pasienter utvikler progressiv hormon-ildfast prostatakreft (hrpc). Androgen deprivasjon terapi er ikke kurativ for disse pasientene selv da sammen med mer effektive behandlinger som er rettet mot den sentrale syntese av testosteron, som CYP17A1 inhibitor abiraterone og AR antagonist MDV3100 [3], [4]. Identifisering av et nytt mål som styrer AR signale indirekte, eller til og med et mål som er relatert til AR signalering, kan være nyttig for å utvikle nye terapeutiske tilnærminger til hrpc.
Den allestedsnærværende uttrykt cyclin G-assosiert kinase (GAK) regulerer clathrin-mediert membran handel ved å fungere som en viktig kofaktor for Hsc70 avhengig avkapsling av klatrin-belagte vesikler i cytoplasma [5], [6]. GAK er også lokalisert til kjernen [7], hvor det fungerer som en transkripsjons coactivator av ARS. Spesielt, er GAK uttrykk økt betydelig i HRPC celler [8]. Dessuten spiller GAK en rolle i opprettholdelsen av riktig sentrosomen modning og mitotisk kromosom congression, og siRNA-mediert knockdown av GAK aktiverer spindel-forsamlingen sjekkpunkt, som registrerer stakk, feiljustert, eller unormalt kondensert kromosomer, som fører til cellesyklus arrest ved meta [9]. GAK er viktig for cellevekst siden GAK knockout (GAK
– /-) mus er embryonale dødelig [10] og mus embryonale fibroblast (MEF) avledet fra GAK
– /- mus ikke klarer å dele og til slutt bli senescent [ ,,,0],11] på grunn av forstyrrelser av clathrin-mediert endocytose. Men vi tidligere viste at knockout mus som uttrykker kinase-døde form av GAK (GAK-kd) var ikke embryonale dødelige og GAK-kd MEFs vokste normalt [12], noe som tyder på at tap av GAK kinase aktivitet kan ikke være dødelig i normale celler som uttrykker den passende mengde av GAK. Dette tyder på at en inhibitor for GAK kinase-aktivitet kunne brukes til å utvikle en ny molekylær-target-terapi som selektivt hemmer veksten av HRPC celler med forbedret GAK ekspresjon ved kontroll av AR signale indirekte.
Gefitinib [13], en tyrosinkinaseinhibitor selektiv for den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR), også hemmer kinaseaktiviteten av GAK [14]. Selv om EGFR [15] og GAK [8] blir uttrykt ved høye nivåer i prostatacancer og deres forbedrede ekspresjon er assosiert med dårlig prognose [8], [15], administrasjon av gefitinib alene er ineffektiv [16] og kombinerte administreringer av gefitinib og strålebehandling [17] eller docetaxel [18] har begrenset terapeutiske effekter. Luteolin, en felles kosttilskudd flavonoid funnet i et stort utvalg av planter og matvarer [19], er en annen motstander av EGFR-assosiert tyrosin protein kinaser. I likhet med gefitinib, fører luteolin vekst arrestasjonen av PC-3 menneskelige prostata kreft celler via regulering av cellesyklusregulerende gener [20]. Luteolin hemmer også DNA topoisomeraser, kliniske målene for kreft narkotika [21]. Derfor kan luteolin være nyttig som en anticancer medikament, selv om sin
bona fide
target (e) og de molekylære mekanismer som er involvert i inhibisjon av kreftcellevekst er vanskelige på grunn av sitt brede spektrum av farmakologiske egenskaper.
Formålet med denne studien var å identifisere en ny faktor som styrer AR signale indirekte i hRPC pasienter, og å undersøke om GAK kan være målrettet for behandling av ikke bare hrpc men også andre krefttyper med forbedret GAK uttrykk. Faktisk har vi her rapporterer at en økning i ekspresjonen av GAK i HRPC pasienter som positivt korrelerer med Gleason stillingen, et mål på strengheten av sykdommen. Både GAK og AR lokalisert til kjernen av kreftceller i GAK-positive kirurgiske prøver. En
in vitro
kinase-analyse viste at luteolin og gefitinib inhibere kinaseaktiviteten av KIE med tilsvarende styrke, noe som tyder på deres nytte som inhibitorer av GAK s kinase-aktivitet. Sammenlignet med effekten av enten stoffet alene, samtidig bruk av luteolin og gefitinib til PC-3 celler hadde større hemmende effekt på celle levedyktighet. Disse forbindelser hadde også en kumulativ hemmende effekt på GAK protein ekspresjon som var uavhengig av proteasom-mediert degradering. Til sammen resultatene presentert her tyder på at GAK, som er overuttrykt i mange kreftceller, er en roman kandidat for lovende målrettet kjemoterapi.
Materialer og Metoder
Antistoffer og sirnas
Antistoffer mot følgende proteinene ble brukt i denne studien: AR (Santa Cruz Biotechnology), aktiv caspase 3 (Cell Signaling Technology), Ki67 (DakoCytomation), Lefty (Abcam), Lamin A /C (Bethyl Laboratories), EGFR ( kanin, Cell Signaling Technology), EGFR (mus, Millipore), ERK1 /2 (Cell Signaling Technology), perk (Cell Signaling Technology), GAPDH (Fitzgerald) og α-tubulin (Sigma-Aldrich). Den anti-GAK monoklonale antistoffer ble fremstilt som tidligere rapportert [7]. De Lefty1-spesifikke sirnas ble kjøpt fra OriGene Technologies og Gene Design
Kjemi og kosttilskudd
Følgende kjemikalier og kosttilskudd ble brukt i denne studien. Gefitinib (Tocris Bioscience), erlotinib ( Kemprotec), SB203580 (LC Laboratories), LutiMax (CalComp Nutrition), Oryza luteolin (Oryza Oil Fat Chemical), luteolin (Sigma-Aldrich), resveratrol (Sigma-Aldrich), og DMSO (Sigma-Aldrich)
Cell kultur
PC-3 celler ble gitt av japanske Cancer Forskningsressurser Bank. Alle andre humane kreftceller ble kjøpt fra American Type Culture Collection. Cellene ble holdt i 5% CO
2 ved 37 ° C i Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Hyclon Laboratories), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. WT (GAK-kd
+ /+) og KIE-kd
– /- MEFs ble opprettholdt i MEF medium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplert med 10% FBS, penicillin, streptomycin og 50 mM 2-merkaptoetanol) som tidligere beskrevet [22].
EGF-stimulering
etter to vaskinger i fosfat-bufret saltvann (PBS), MEFs ble dyrket i lav-serum MEF-medium (inneholdende 0,5% FBS) i 12 h. Mus EGF (Sigma) ble tilsatt til kulturmediet til en sluttkonsentrasjon på 10 ng /ml (for Western blot-analyse) eller 100 ng /ml (for immunofluorescens), og cellene ble deretter inkubert i 5% CO
2 ved 37 ° C i de angitte tidsrom.
FACS analyse
Celler ble farget med Cycletest Plus DNA Reagent Kit (BD Biovitenskap), i henhold til produsentens instruksjoner. Analysen ble utført ved hjelp av en FACS Calibur instrument med Cellquest programvare (BD Biovitenskap).
Vekstkurve analyse
Om lag 1,0 × 10
3 PC-3 celler ble sådd på en 3,5 cm Petri skål og inkubert ved 37 ° C over natten. Gefitinib, luteolin, og resveratrol ble deretter oppløst i DMSO og lagt til kulturmediet ved tid null.
Celleviabilitet måling ved hjelp av MIR-630
Uttrykk av MIR-630 fra miRNASelect pepper HSA-mir-630 uttrykk vektor ble utført i henhold til produsentens instruksjoner (Cell Biolabs). For å bestemme levedyktigheten ble cellene sådd ut i 6-brønns plater ved en tetthet på 1 x 10
5 celler per brønn og deretter trypsinert ved de indikerte tidspunkter. Antallet prolifererende celle ble bestemt ved hjelp av en grevinne Automated celleteller (Invitrogen).
Histologisk analyse
Kirurgiske prøver fra pasienter som gjennomgår radikal prostatektomi ble fiksert i 10% bufret formalin, innstøpt i parafin, og deretter kuttet i 4 mikrometer tykke seriesnitt. De første seksjonene ble farget med hematoksylin og eosin og anvendt for patologisk diagnose av betent område. De resterende tre seksjoner ble utsatt for immunhistokjemiske analyser, som tidligere beskrevet [23]. Kort sagt ble deparaffinized seksjoner autoklavert i 0,1 M citratbuffer, blokkert med bovint serumalbumin, og deretter inkubert med primære antistoffer i PBS inneholdende 2% bovint serumalbumin. Sekundær antistoff inkubasjoner og signalforbedring reaksjoner ble utført ved hjelp av Histofine Simple Stain kit (Nichirei) og fargen ble utviklet ved hjelp aminoethlcarbazole (Impact AEC, Vector Laboratories). Seksjonene ble kontra med hematoksylin for atom visualisering og deretter montert ved hjelp Ultramount Vann Permanent Mounting Medium (Dako). Bilder ble tatt opp ved hjelp av et mikroskop (BX51, Olympus) er utstyrt med en CCD-kamera (DP72, Olympus).
Western blot analyse
For å forberede helcellelysater, ble cellene lysert ved 4 ° C i 30 minutter i modifisert RIPA-buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM ditiotreitol, 0,1% SDS, og 0,1% deoksycholat) supplementert med 1% protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich), 1 mM NaF, 1 mM Na
3VO
4, og 10 mM β-glycerofosfat. Etter sentrifugering ble de tømte lysatene underkastet SDS-PAGE. De oppløste proteiner ble overført til PVDF-membraner, noe som ble blokkert og deretter immunoblottet med de angitte antistoffer i Tris-bufret saltvann og Tween 20 som inneholdt 5% fettfri melk. De immunoreaktive proteinbånd ble visualisert ved hjelp av Western Lightning Plus ECL-reagenser (PerkinElmer).
Rensing av rekombinante proteiner
rensing av GST-merkede proteiner for kinasebestemmelser ble utført som beskrevet tidligere [22]. Kort,
E. coli-
BL21-celler transformert med pGEX-plasmidet ble inkubert i Luria-Bertani-medium ved 37 ° C inntil de nådde en absorbans på 0,4-0,8 ved 600 nm. Ekspresjon av hvert rekombinant protein ble indusert ved eksponering av cellene til 0,5 mM IPTG over natten ved 20 ° C. Cellene ble deretter oppsamlet og lysert ved sonikering i PBS inneholdende 1% Triton X-100, 1 ug /ml leupeptin, 1 ug /ml aprotinin, 1 pg /ml pepstatin A, 1 mM benzamidin, 100 ug /ml fenylmetylsulfonylfluorid, 1 mM NaF, og 1 mM Na
3VO
4. Etter sentrifugering ble den klarede lysat adsorbert på Glutation Sepharose 4B (Amersham Pharmacia Biotech), renset med PBS, og deretter eluert med en buffer inneholdende 10 mM redusert glutation (Nacalai Tesque).
In vitro
kinaseanalyse av GAK
In vitro
kinase-analyser ble utført ved hjelp av GST-tagget humant AR (~150 ug /ml) som en testprøve og renset GST-tagget humant GAK (~ 100 ug /ml) som test-kinase. En renset fragment av B’γ3 subtype av mus PP2A (B’γ; ~ 10 pg /ml) ble anvendt som en positiv kontroll GAK substrat, som tidligere beskrevet [22]. Aurora A kinase (~ 50 pg /ml) og Lats1 /2 kinase (omtrent 25 ug /ml, i nærvær eller fravær av Mob1A (~ 50 pg /ml) som dens aktivator) ble anvendt som positive kontroll-enzymer, og en kinase -død (KD) form av Aurora A kinase (~ 50 pg /ml) ble anvendt som en negativ kontroll for fosforylering av AR. De kinaser og substrat-proteiner ble inkubert i 30 minutter ved 30 ° C i 10 ul reaksjonsbuffer (10 mM HEPES pH 7,5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl
2, 5 mM MnCl
2, 1 mM DTT, 5 mM NaF, og 50 mM β-glycerofosfat) inneholdende 5 uM ATP og 10 pCi [γ-
32P] ATP (PerkinElmer). Der det er nødvendig, gefitinib, erlotinib, SB203580, resveratrol, og luteolin ble inkludert i de angitte konsentrasjoner. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 4 x Laemmli-buffer (0,4 M Tris-Cl pH 6,8, 8% SDS, 20% glycerol, 10% 2-merkaptoetanol og 0,2% bromfenolblått). Prøvene ble løst ved gradient SDS-PAGE ved hjelp av en Multigel II Mini apparat (Daiichi Pure Chemicals), og ble oppdaget av autoradiografi. De mengder proteiner lastet på gelen ble overvåket ved farging med Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad) eller SimplyBlue ™ SafeStain (Life Technologies).
Human Genome microarray analyse
Mikromatrise-analyser ble utført som ensfargede hybridizations Agilent Whole human Genome oligonukleotid Mikromatriser (4 × 44K, Produktkode kode~~POS=HEADCOMP: 4112F). Total RNA ble ekstrahert fra PC-3-celler 24 timer etter behandling med DMSO, 60 uM luteolin, 60 uM gefitinib, eller 60 uM luteolin pluss 60 pM gefitinib ved hjelp av en miRNeasy Mini-kit ifølge produsentens instruksjoner (Qiagen). Kvaliteten på RNA ble bestemt ved hjelp av RNA 6000 Nano LabChip Kit på Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). RNA ble revers-transkribert ved hjelp AffinityScript revers transkriptase (Agilent Technologies) og oligo-dT primere som inneholder T7 RNA polymerase promoter sekvens.
In vitro
transkripsjon ble deretter utført ved hjelp av T7 RNA polymerase og en lav inngang Quick-Amp Merking Kit (Agilent Technologies) for å merke CRNAs med Cy3-CTP (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Purified Cy3-merket CRNAs (1650 ng) ble hybridisert til mikromatriser. Vasking, skanning og genanalyser ble utført i henhold til produsentens protokoll (Agilent Technologies). Agilent Feature Extraction programvare (v. 10.5.1) ble brukt for å vurdere flekk kvalitet og pakke har intensitet statistikk. Den Subio Platform og Subio Basic Plug-in (v1.15, Subio Inc.) ble så brukt til å beregne mellom-sample fold-endringer, som ble analysert av en-sample Student
t
-UNDERSØKELSER. Microarray data har blitt deponert i Gene Expression Omnibus database (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) under tiltredelse antall GSE53180.
Menneske miRNA microarray analyse
miRNA microarray analyse ble utført ved hjelp av Agilent SurePrint menneskelig v18.0 miRNA arrays, som inneholder 20-40 har rettet mot 1919 mennesker mirnas katalogisert i versjon 8.0 av Sanger database (design ID 025416). Aliquoter av total RNA (100 ng) ble anvendt for å fremstille miRNA sonder, i henhold til den Agilent protokollen (v. 2.4). I korthet, ble total RNA defosforylert med kalvetarm alkalisk fosfatase, denaturert med DMSO, og deretter merket med cyanin 3-PCP ved anvendelse av T4 RNA-ligase og miRNA Labeling Kit. Probene ble hybridisert til oppstillingene i 20 timer ved 55 ° C med rotasjon ved hjelp av Agilent miRNA Hybridisering Kit. Duplicate mikromatriser ble utført for PC-3 celler behandlet med DMSO, luteolin, gefitinib, eller luteolin og gefitinib. Objektglassene ble vasket med Gene Expression vaskebuffer 1 (Agilent) ved romtemperatur i 5 min og deretter med Gene Expression vaskebuffer 2 (Agilent) ved 37 ° C i ytterligere 5 min. Etter hybridisering og vasking ble platene skannet med et Agilent skanner (G2505C). Bilder ble hentet ved hjelp av Agilent Feature Extraction programvare (v. 10.7.3) og Agilent GeneSpring GX-programvaren (v. 12.6). Den totale genet signal fra GeneView datafiler (ekstrahert med standardinnstillinger i Agilent Feature Extraction programvare) ble brukt. Forskjeller i miRNA uttrykk nivåer ble normalisert ved hjelp av PC-tre behandlet DMSO prøven som en kontroll. aFold-endringer større enn 2,0 og
P
-verdier mindre enn 0,05 (Student
t
-test) ble vurdert for videre analyse. De miRNA microarray data har blitt deponert i Gene Expression Omnibus database under tiltredelsen tall GSE53178.
kvantitativ real-time PCR
Kvantitativ RT-PCR-analyser ble utført ved hjelp av en ABI PRISM 7900 instrument (PE Applied Biosystems) og analyse-on-Demand TaqMan prober for Lefty1 (Hs00764128_s1), MIR-630 (HSA-mir-630), og MIR-5703 (HSA-mir-5703), i henhold til produsentens protokoller (Agilent Technologies).
Statistisk analyse
Feil barer for alle data representerer SDS fra gjennomsnittet.
P
-verdier ble beregnet ved hjelp av Student
t
-UNDERSØKELSER, med mindre annet er oppgitt.
Etikk
Menneskelige prøver ble samlet inn ved biopsi fra prostata av kreftpasienter med relevante kliniske data på Kinki universitetssykehus. Alle eksperimenter med humane prøver ble godkjent av etisk komité Osaka University (Godkjenning # 326) og Kinki University (Godkjenning # 23-088); våre etiske komité fravikes behovet for samtykke. Kirurgiske prøver fra pasienter som gjennomgår radikal prostatektomi ved Kinki universitetssykehus (Osaka, Japan) ble fiksert i 10% bufret formalin, innstøpt i parafin, og deretter kuttet i 4 mikrometer tykke seriesnitt.
Resultater
GAK er lokalisert i hovedsak til kjernen i kreftceller
Selv om GAK lokaliserer hovedsakelig til cytoplasma i normale celler slik som TIG-1, vi nylig rapportert at en fraksjon av proteinet er også funnet i kjernen [7 ]. Spesielt, en tidligere studie med en neo-adjuvant hormonbehandling vev microarray viste at GAK uttrykk øker betydelig i løpet av utviklingen av prostatakreft til androgen uavhengighet [8]. For å bestemme om ekspresjon GAK er utvidet i kjernen av kreftceller, ble immunoblot anvendt for å måle GAK proteinnivåer i cytoplasmiske og kjernefraksjoner av forskjellige kreftcellelinjer. I hormon-insensitive humane prostatacancerceller (PC-3), ble GAK uttrykt på et høyere nivå i kjernen enn i cytoplasma; Dette resultat ble bekreftet ved anvendelse av to forskjellige monoklonale antistoffer (banene 3 og 4 i fig. 1). Selv om mengden av GAK var lav, kjerner av hormonsensitiv humane prostatakreftceller (LNCAP) uttrykkes også KIE (felt 6 på fig. 1). Videre er kjerne GAK båndet vandret raskere enn den cytoplasmatiske GAK båndet, noe som tyder forskjellige modifikasjoner av proteinet i disse cellulære rom. Lignende resultater ble også observert for MDA-MB231 og MCF-7 brystkreftceller, samt HeLaS3 livmorhalskreft-celler (Fig. 1). I motsetning til dette GAK var til stede på et høyere nivå i den cytoplasmiske fraksjon enn den nukleære fraksjon av TIG-1 normale fibroblaster (fig. 1). Spesielt, hormon-insensitiv kreftceller (PC-3 og MDA-MB231) uttrykte GAK på høyere nivåer enn hormon-sensitive kreftceller (LNCaP og MCF-7). Samlet utgjør disse resultatene indikerer at GAK er endret og overuttrykt i kreftceller, spesielt metastatiske celler.
Western blot analyse av GAK, Lamin A /C, og α-tubulin (kontroll) i cytoplasma (Cyt) og kjernekraft (Nuc) ekstrakter fra prostatakreft (PC-3 og LNCaP), brystkreft (MDA-MB231 og MCF-7) og livmorhalskreft (HeLaS3) cellelinjer. Lamin A /C ble brukt som en kjernefysisk markør. To forskjellige anti-GAK-antistoffer ble brukt. Pilene og pilspisser indikerer GAK band identifisert først og fremst i de nukleære og cytoplasmiske fraksjoner, henholdsvis.
Nuclear GAK er uttrykt ved høye nivåer i kirurgiske prøver fra pasienter med prostatakreft
For å finne ut hvis atom overekspresjon av GAK skjer
in vivo
, immunhistokjemiske analyser av normale og kreft kirurgiske prøver fra 42 prostatakreftpasienter ble utført. Selv om GAK ble bare uttrykt svakt i de normale vev, ble proteinet uttrykt ved høye nivåer i kjernen av kreftceller (Fig. 2A-E). En chi-squared test viste en statistisk signifikant positiv korrelasjon mellom GAK farging og Gleason score (tabell 1 og tabell S1).
A-D, hematoxylin og eosin (HE) farging (A, B) og anti -GAK farging (C, D) av representative radikal prostatektomi deler av kreft (A, C) og normal (B, D) vev fra prostata kreftpasienter (n = 42). Scale bar = 50 mikrometer. E, høyere makt forstørrelse av eske området vist i C. Scale bar = 50 mikrometer.
Over-aktivering av AR signalering er assosiert med progresjon av androgen-avhengige prostata-kreft. Fordi GAK samhandler med AR
in vitro product: [8], farging ble brukt til å avgjøre om GAK colocalizes også med AR
in vivo
. Nukleær lokalisering av GAK og AR ble påvist i kjernen av kreftceller fra alle KIE-positive kirurgiske prøver (n = 4 pasienter med en Gleason ballen ≤7 og n = 5 pasienter med en Gleason poengsum ≥8) (fig. S1) . Men til tross for sine kjernefysiske lokalisering, direkte fosforylering av AR ved GAK ble ikke oppdaget av en
in vitro
kinase assay (Fig. S1E). Videre, i tre uavhengige pasientprøver, GAK og AR ikke colocalize med Ki-67, en kreft antigen som finnes hovedsakelig i voksende celler og er fraværende i hvilende celler (Fig. S2). Dette funnet tyder på at colocalization av GAK og AR ikke nødvendigvis korrelerer med veksten av kreftceller.
Cytoplasmatiske GAK regulerer EGFR-medierte signalveier
nedregulering av GAK reduserer tyrosin kinase aktiviteten av EGFR og endrer dets nedstrømssignalveier [5]. For å finne ut om denne reguleringen er formidlet av Ser /Thr kinase aktivitet GAK undersøkte vi oppførselen til EGFR i GAK-kd MEFs [12]. En immunoblotanalyse av villtype (WT) og GAK kD MEFs viste nærvær av to EGFR proteiner i begge prøver, den største av hvilke var dominerende i GAK kD MEFs (fig. 3A). Jo større båndet forsvant etter behandling av cellene med λ-fosfatase (fig. 3B, spor 2), noe som tyder på at den representerte et fosforylert form av EGFR. Tyr-fosfatase-hemmer Na
3VO
4, men ikke den Ser /Thr fosfatase-inhibitorer NaF, β-glycerofosfat, og okadainsyre, avskaffet denne effekten av λ-fosfatase, hvilket antyder at Tyr-rester i EGFR er konstitutivt fosforylert i GAK-kd MEFs i fravær av EGF stimulus (fig. 3B). Tilsvarende, når de MEFs ble serum-sultet i 11 timer, behandlet med cykloheksimid i 1 time for å inhibere ny proteinsyntese, og deretter stimulert ved tilsetning av EGF, fosforylering av EGFR var mer fremtredende i KIE-kd MEFs enn WT MEFs (Fig . 3C og 3D). Spesielt, ble en enda større EGFR-proteinet påvist i både WT og KIE-kd MEFs 10 min etter EGF-stimulering (Fig. 3C og 3D), hvilket antyder at EGF økte antall fosforylerte Tyr-rester i EGFR. Dette hyper-fosforylering akselerert defosforylering av fosforylerte ekstracellulære signalregulerte kinaser 1/2 (pErk1 /2) (fig. 3C), som er nedstrøms effektorer av EGFR, noe som tyder for tidlig reduksjon av EGFR-signalisering.
A , western blot analyse av EGFR uttrykk i WT (GAK-kd
+ /+) og mutant (GAK-kd
– /-) MEFs. B, virkningene av en Tyr-fosfatase-inhibitor (50 mM Na
3VO
4) og Ser /Thr fosfatase-inhibitorer (50 mM NaF og 50 mM β-glycerofosfat, eller 2,5 uM okadainsyre) på hemming av EGFR fosforylering av λ-fosfatase (λPPase; 200 U). A, B, pilene indikerer fosforylert EGFR-proteinet. Alfa-tubulin (α-Tub) ble anvendt som en kontroll lasting. (C, D) Western blot-analyse av ekspresjonsnivåer av EGFR og ERK1 /2 i WT (+ /+) og KIE-kd (- /-) MEFs følgende EGF-stimulering i de angitte tidsrom. Cykloheksimid (50 ug /ml) ble tilsatt til kulturmediet i 1 time før EGF (10 ug /ml) for å inhibere ny proteinsyntese. De skråstilte og horisontale piler indikerer fosforylerte og hyper-fosforylert EGFR band, henholdsvis. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. C, pilene indikerer differensial uttrykk for fosforylert ERK1 /2 i WT og GAK-kd MEFs. D, NT, ikke-behandlet. E, farging av EGFR-protein i WT (+ /+) og mutant (- /-) MEFs behandlet med eller uten proteasominhibitor MG132 (50 ug /ml). Kjente paneler er omkranset av turkis og grønne linjer. F, antallet EGFR-positive celler i WT og KIE-kd (Homo)-celler i nærvær eller fravær av MG132. Dataene er vist som gjennomsnitt ± SEM av n = 3 uavhengige eksperimenter ved hvert tidspunkt.
Immunfarging viste at nivåene av EGFR i cytoplasma av GAK kD MEFs var lavere enn de i cytoplasmaet til WT MEFs, noe som antyder unormale internalisering av EGFR i knockout-celler (kolonne 2 paneler av fig. 3E). Lignende resultater ble oppnådd når forsøket ble gjentatt i nærvær av det proteasominhibitor MG132, noe som tyder på at abnormitet var ikke på grunn av nedbrytning av proteiner EGFR (kolonne 4 paneler av fig. 3E). Videre er antallet av EGFR-positive celler var lavere i GAK kD MEFs enn WT MEFs, og denne fenotype var også uavhengig av proteasomhemming (fig. 3F). Disse resultater antyder at konstitutiv hyper-fosforylering av EGFR forårsaket av en mangel på GAK aktivitet vanskeliggjør riktig lokalisering av reseptoren, som fører til redusert aktivering av EGFR-mediert signalisering vekst. Resultatene er beskrevet ovenfor er i samsvar med en fersk rapport som MEFs fra GAK betinget knockout mus og GAK knockdown celler fremstilt ved hjelp av små hårnål RNA vise endret intracellulær EGFR menneskehandel, gjennomgå vekst arrestasjon, og har redusert pErk1 /2 signalisering [11]. Samlet utgjør disse data tyder på at mangel på GAK aktivitet forstyrrer riktig aktivering av EGFR-medierte signalveier.
Luteolin og gefitinib hemme kinase aktiviteten til GAK
Gefitinib hemmer GAK, EGFR, og reseptor-samspill serin /treonin kinase
in vitro product: [14]. For å avgjøre om gefitinib hemmer GAK aktivitet direkte, en
in vitro
kinase analysen ble utført ved hjelp av PP2A B’γ, et kjent mål for GAK, som et substrat [22]. Gefitinib hemmet GAK autofosforylering og KIE-mediert fosforylering av PP2A B’γ på en doseavhengig måte, noe som tyder på at gefitinib inhiberer GAK kinaseaktivitet direkte (fig. 4A). Effektene av andre kinase-inhibitorer, for eksempel den velkjente EGFR inhibitor erlotinib, [24] og den p38a og GAK inhibitor SB203580 [25], på GAK aktivitet ble også undersøkt. Begge disse forbindelsene inhiberte GAK aktivitet på samme måte, selv om de var litt mindre potent enn gefitinib (Fig. 4A).
In vitro
kinase analyser ble også brukt til å fastslå effekten av luteolin (et flavonoid) og resveratrol (en polyphenol) på GAK aktivitet; disse forbindelser hemme veksten av prostatacancercellelinjer [20], [26]. Spesielt, 10 uM inhiberte luteolin GAK aktivitet drastisk, mens den samme konsentrasjon av resveratrol hadde bare en svak inhibitorisk effekt (Fig. 4B). En ytterligere analyse viste at 2 uM av luteolin var nødvendig for å inhibere GAK aktivitet (Fig. 4C). Disse resultatene tyder på at i tillegg til gefitinib, luteolin og erlotinib er nye hemmere av GAK.
A-C, representant SDS-PAGE analyse av proteiner som utsettes for
in vitro
kinase analyser ved hjelp av
32P-γATP, GAK (~ 100 ug /ml) som enzym, PP2A B’γ (~ 10 pg /ml) som substrat, og de angitte konsentrasjoner av gefitinib, erlotinib, og SB203580 som inhibitorer. Signalene innlemmet ble påvist ved autoradiografi og mengdene av proteinene lastet ble vurdert ved Coomassie Brilliant Blue (CBB) farging. Grafene viser intensitets prosenter av fosforylert PP2A B’γ og GAK forhold til den ikke-behandlede prøver. Dataene er representert som gjennomsnitt ± SEM av n = 3 uavhengige eksperimenter ved hver konsentrasjon.
Samtidig administrering av gefitinib og luteolin forårsaker død av PC-3 celler
Neste, vi undersøkt effekten av samtidig administrasjon av gefitinib og luteolin på veksten av PC-3 prostatakreftceller. Vi først brukt genomisk DNA-sekvensering for å undersøke for tilstedeværelse av mutasjoner i EGFR-genet i PC-3-celler som var rapportert tidligere for å være næret ofte av lungekreftceller [27]. Som vist på fig. S3, fant vi ingen mutasjoner ved slike seter i genomet av PC-3, noe som tyder på at en lav konsentrasjon av gefitinib (~ 1 mm) ikke kan være effektiv i PC-3-celler. Faktisk ble en høyere konsentrasjon av gefitinib (60 uM) nødvendig for å stanse veksten av PC-3-celler. Interessant, da antall prolifererende celler ble tellet etter eksponering av cellene til 60 uM luteolin, 60 uM gefitinib, eller en kombinasjon av disse stoffene for 24, 48 eller 72 timer, fant vi en kumulativ inhiberende effekt av gefitinib og luteolin videre cellevekst (fig. 5A). Kontrollceller ble behandlet med dimetylsulfoksyd (DMSO) alene.
