Abstract
Immunterapi nærmer hjelp sjekkpunkt blokade, alene, eller i kombinasjon med tumor antigen vaksinering, eller adoptiv celle overføring, er fremstår som lovende tilnærminger for behandling av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). I forberedelsene til kommende kombinert immunterapi tilnærminger i NSCLC, her har vi vurdert spontane immunresponser mot XAGE-1b, en svulst spesifikt antigen ved Kreft testikler Antigen gruppe som tidligere har vært rapportert å være spontant immunogen i den japanske befolkningen, i en kohort av kaukasiske pasienter med NSCLC. Vi har funnet spontane serologisk respons til XAGE-1b i 9% av pasientene. Viktigere, ble disse svarene begrenset til, og representerer 13% av pasienter med adenokarsinom svulster, den hyppigste histologiske subtype, der immunterapi tilnærminger er under utvikling. Ved hjelp av et sett med overlappende peptider som dekker hele XAGE-1b protein, og til støtte for de serologiske data, vi har oppdaget betydelige XAGE-1b spesifikke CD4
+ T-celle responser i alle XAGE-1b seropositive pasienter og identifisert flere CD4
+ T-celle epitoper. Til sammen våre resultater støtte relevansen av XAGE-1b antigen i kaukasiere NSCLC pasienter med adenokarsinom, og gjennomføringen av fremtidige immunterapi utnytter den høye immunogenisiteten av antigen i denne pasientpopulasjonen
Citation. Saito K, Nakayama E, Valmori D (2016) immunresponser mot Kreft testikler Antigen XAGE-1b i ikke-småcellet lungekreft kaukasiske pasienter. PLoS ONE 11 (3): e0150623. doi: 10,1371 /journal.pone.0150623
Redaktør: Takuma Kato, Mie Universitetet Graduate School of Medicine, JAPAN
mottatt: 11. desember 2015. Godkjent: 17 februar 2016; Publisert: 03.03.2016
Copyright: © 2016 Saito et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Ludwig Institute for Cancer Research (USA), den Cancer Research Institute (USA), Ligue contre le Cancer (Frankrike) og LABEX startet IGO (Frankrike) . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
lungekreft er den ledende årsak til kreft-relaterte dødelighet på verdensbasis, med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) utgjør ca 85% av alle lungekreft tilfellene [1]. Til tross for nylige forbedringer i terapeutiske strategier, utgjør NSCLC derfor en av de store folkehelseproblemer. I de fleste tilfeller, symptomene vanligvis vises på et avansert fase av sykdommen, i metastatisk eller lokalt avanserte stadier, og dermed gjøre behandlingen vanskelig [2]. Etter første diagnose, er nøyaktig iscenesettelse avgjørende for å bestemme en passende behandling. Kirurgisk reseksjon av svulsten er fremdeles standarden på omsorg, men dessverre er det aktuelt, og kan betraktes som en konsekvent og vellykket alternativ for kur, bare hos pasienter med resektable svulster og i stand til å tolerere reseksjon. Men ca 70% av lungekreftpasienter stede med lokalt avansert eller metastatisk sykdom ved diagnosetidspunktet [2]. For disse pasientene er den første linjen av behandlingen platina-basert kjemoterapi, noe som har vist seg å være gunstig for lindring og representerer standard vare. Strålebehandling er også ofte brukt som en første linje behandling for NSCLC og administrasjon av samtidig kjemoterapi og strålebehandling er indisert for stadium III lungekreft [2]. Men selv med disse behandlingene, generell overlevelse i NSCLC pasienter er fortsatt dramatisk lav, med en gjennomsnittlig 5-års overlevelse på 17% hos pasienter med tidlig sykdom og 4% hos pasienter med metastatisk sykdom [3]. Derfor er det et presserende behov for å utvikle nye terapeutiske strategier for å indusere mer effektive kliniske respons og forlenge den totale overlevelsen i denne pasienter befolkningen. I det siste tiåret har ny kunnskap i kreft biologi åpnet nye potensielle terapeutiske tilnærminger, herunder målrettet terapi og immunterapi. Målrettet terapi, slik som de som bruker angiogeneseinhibitorer, kan epidermale vekstfaktor-reseptor-inhibitorer (EGFRi) eller tyrosinkinaseinhibitorer (TKI) kombineres til hoved behandlingsmetoder hos pasienter med spesifikke mutasjoner [4-6]. Imidlertid var andelen pasienter som uttrykker disse mutasjonene er relativt liten (for eksempel bare 10-15% av NSCLC havn EGFR mutasjoner). I tillegg er de kliniske effektene av disse behandlinger er ofte ikke langvarig, på grunn av utviklingen av resistens [7,8].
På den annen side, immunterapeutiske strategier har potensial til å styrke pasientens immunrespons å indusere stabile kliniske respons og forlenge overlevelse [1]. Emerging immunterapeutiske strategier er de som bruker sjekkpunkt blokade spesifikke antistoffer, som har vist klinisk effekt i undergruppen av pasienter. Nyere data tyder på at disse responder pasienter er de som havna spontane immunresponser til autolog svulst. Andre immunbaserte strategier i NSCLC er kreft vaksinasjon tilnærminger bruker Cancer /testis antigener (CTA) [1,9], proteiner kodet av gener som normalt uttrykt i kjønnsceller i testikkel og foster eggstokk og i noen tilfeller, i placenta trophoblasts, forstummet i normalt voksent vev, men abnormt re-uttrykkes i forskjellige typer av kreft [10,11]. CTA er i stor grad uttrykt i kreft i ulike histologiske subtyper, er ofte svært immunogen og derfor regnes blant de mest attraktive mål for utvikling av kreftvaksiner [11]. Kreftvaksiner som monoterapi er for tiden under evaluering i NSCLC og kan være effektiv hos pasienter med minimal restsykdom [9]. Til tross for de første kliniske studiene som gjelder denne type strategi ikke har møtt sin kliniske endepunkt [12], kombinasjon av vaksinering med sjekkpunkt blokade behandling er svært lovende [1]. Men bruken av disse strategiene krever identifisering av tumorspesifikke antigener uttrykt av en betydelig andel av NSCLC, så vel som av egenskapene til de tumorer som uttrykker dem. Ulike CTA har vist seg å være uttrykt i NSCLC. XAGE-1b blir kodet av XAGE-1-genet, som ligger i Xp11.22 regionen av X-kromosomet [13,14]. Fire transkripsjon varianter, XAGE-1a til d, er blitt identifisert [14-16]. En transkripsjon uttrykt i svulster, XAGE-1b, koder en 81 aminosyrer lang protein [14,17]. XAGE-1b ble rapportert å være den rådende transkripsjon uttrykt i NSCLC. XAGE-1b-ekspresjon ble observert i 45% av adenokarsinomer av japanske pasienter [18]. XAGE-1b ble vist å indusere antistoff og T-celle responser i japanske NSCLC pasienter. Frekvensen av antistoffrespons ble rapportert å være høyere hos pasienter med adenokarsinom (14%) enn i SCC pasienter (2%) [19]. Hensikten med denne studien var å utvide disse funnene til den kaukasiske befolkningen, for å vurdere potensialet i XAGE-1b basert immunterapi i kaukasiere.
Materialer og metoder
Pasientprøver og celle rensing
perifere mononukleære blodceller (PBMC) prøver ble samlet inn fra en kohort av 141 NSCLC pasienter (Institut de Cancérologie de l’Ouest (ICO), Saint-Herblain, Frankrike), etter godkjenning av Institutional Review Board av ICO. PBMC fra 60 friske donorer ble hentet fra Etablissement Français du Sang (EFS) Pays de la Loire, etter godkjenning av Institutional Review Board av Etablissement Français du Sang Pays de la Loire (Nantes, Frankrike). En signert informert samtykkeskjema ble innhentet fra alle givere som deltar i studien. Kohorten inkluderte 91 adenokarsinomer, 40 plateepitelkarsinom (SCC) og 10 NSCLC svulster i andre undergrupper. PBMC ble isolert ved tetthetsgradient sentrifugering. CD4
+ og CD8
+ T-celler ble beriket fra PBMC ved magnetisk celle sortering ved hjelp av mikroperler (MACS Cell separasjonsteknologi, Miltenyi Biotec).
Proteiner og peptider
Serien av 17 16-mer XAGE-1b overlappende peptider (OLP, Tabell 1) ble syntetisert på en Multiple Peptide Synthesizer, AMS422, ABINED ved Okayama University. Det rekombinante NY-ESO-1-protein ble produsert i
Escherichia coli
som tidligere beskrevet [20]. Den XAGE-1b (GAGED2a) protein (81 aminosyrer lang) ble syntetisert ved hjelp av et peptid synthesizer av GL biokjemi.
In vitro stimulering av CD4
+ og CD8
+ T-celler
Renset CD4
+ og CD8
+ T-celler ble stimulert med bestrålte autologe antigen-presenterende celler (APC) i nærvær av en blanding av 17 16-mer overlappende peptider (OLP, 2 pM ) (tabell 1) som spenner over hele aminosyresekvensen av den XAGE-1b protein, rhIL-2 (50 IE /ml) og rhIL-7 (10 ng /ml). Celler ble dyrket i 96-brønners kulturplater ved 37 ° C (CO
2 5%) i Iscoves modifiserte Dulbeccos medium (IMDM, Gibco) supplert med 8% varmeinaktivert humanserum (HS), Glutamax (Gibco), HEPES (Gibco), ikke-essensielle aminosyrer (MEM NEAA, Gibco), ciprofloxacin og Penicillin /streptomycin.
Intracellulær cytokin farging (ICS)
Etter
in vitro
stimulering , CD4
+ og CD8
+ T-celler ble dyrket i 14 dager og deretter bedømt for XAGE-1b-spesifikke T-celle responser. Kulturer ble samlet og stimulert i nærvær eller i fravær av den XAGE-1b peptid basseng (2 uM) og testet i en standard 4 timers intracellulær cytokin farging (ICS), ved å benytte fluorescens-konjugert cytokin-spesifikke antistoffer αCD4 (BD Biosciences), αCD8 (BD Biosciences), αIL-17A (eBioscience) og αIFN-γ (BD Biosciences). Cytokin uttrykk profilen ble deretter vurdert av flowcytometri (FACSAria II, BD Biosciences).
IFN-γ-fangst analysen og etablering av CD4
+ og CD8
+ T-cellekloner
CD4
+ og CD8
+ T-cellelinjer ble samlet og stimulert i nærvær eller fravær av XAGE-1b peptid basseng (2 uM). Stimulerte prøver ble inkubert med en bi-spesifikk CD45 og IFN-γ antistoff (IFN-γ fangst-reagenset, Miltenyi Biotec) og inkubert i 5 minutter på is. Celler ble deretter plassert på en langsom rotasjonsinnretning (Miltenyi Biotec) i 45 minutter ved 37 ° C, for å tillate cytokinsekresjon. Etter denne perioden ble cellene vasket i kald buffer og inkubert med APC-konjugerte IFN-γ deteksjonsreagensen (Miltenyi Biotec), i 15 minutter på is, i nærvær av αCD4 (FITC-konjugert) cytokin-spesifikke antistoff. Celler ble ytterligere vasket med kald buffer og analysert ved FACS. CD4
+ T-celler som utskilte IFN-γ spesielt i respons til XAGE-1b peptid basseng ble sortert ved strømningscytometri cellen, ved hjelp av en FACSAria II. Det isolerte CD4
+ IFN-γ produserende T-celler ble klonet i henhold begrensende fortynningsbetingelser, i 96-brønners plater, ved stimulering med fytohemagglutinin (PHA-L, 1 ug /ml) i nærvær av bestrålte allogene PBMC og EBV celle linjer (EBV-HV, EBV-Laz) og rhIL-2 (150 IU /ml). CD4
+ T-celle kloner ble opprettholdt i IMDM supplert med 8% HS ved å re-stimulering hver 2-3 uker.
Vurdering av serologisk respons
Serologiske responser ble vurdert ved ELISA, ved bruk av 96-brønners plater belagt med det XAGE-1b protein (2 ug /ml) eller NY-ESO-1-protein (1 pg /ml) over natten ved 4 ° C. Sera ble undersøkt i en rekke fortynninger fra 1/100 til 1 /100.000. Antistofftiter ble beregnet som serum fortynning tilsvarende 50% av maksimal optisk tetthet respons.
Vurdering av IFN-γ produksjon av ELISA
For å vurdere antigen spesifikk IFN-γ produksjon, XAGE- 1b spesifikke kloner ble stimulert i nærvær eller i fravær av peptidet bassenget (50 x 10
3 per brønn, i 96-brønns rundbunnet kulturplater). IFN-γ ble målt ved hjelp av ELISA i 24 timer kultursupernatantene ved hjelp av Nunc Maxisorp flatbunnet 96-brønners plater. For den fine spesifisiteten assay-celler (50 x 10
3 per brønn) ble stimulert i nærvær eller i fravær av XAGE-1b enkle peptider (300 um), og IFN-γ konsentrasjonen ble målt som ovenfor. For antistoff-blokkerende forsøk, αDP (1 pg /ml), αDQ (1 pg /ml), αDR (1 pg /ml) og αDR52b (ascites, 1:10 fortynning) antistoffer ble tilsatt til analysekulturen. HLA-DR begrenser alleler ble likeledes bestemt ved IFN-y ELISA, ved hjelp av molekylært definerte APC. LDR1, vennlig levert av Dr. Hassan M. Zarour (University of Pittsburgh, USA), ble opprettholdt i fullstendig RPMI medium og sjekket for HLA-DR uttrykk. EBV149 og EBV156, (Epstein-Barr virus forvandlet lymfoblastoide cellelinjer) ble avledet fra pasienter uttrykker HLA-DRB1 * 13.
Resultater
Serologiske responser til XAGE-1b og NY-ESO-1 i NSCLC pasienter
Vi screenet en kohort av 141 NSCLC pasienter for serologisk respons til XAGE-1b og NY-ESO-1, som internkontroll, med ELISA. Resultatene av screeningen er oppsummert i figur 1. Vi først vurdert sera fra pasienter sammen med de fra 60 friske donorer ved en fortynning på 1: 100. Vi oppdaget betydelige serologiske reaksjoner på XAGE-1b hos 12 pasienter (fig 1A). I motsetning til dette, ble antistoffresponser på NY-ESO-1 detektert i 9 pasienter. Vi vurderte sera fra 12 XAGE-1b seropositive pasienter i en titreringskurven og beregnet antistofftiter, definert som den serumfortynningen som gir 50% av maksimal respons. De oppnådde titere var variabel mellom seropositive pasienter og varierte fra 1: 250 til 1:. 40 000 (figur 1B)
(A) Sammendrag av ELISA for de 141 NSCLC pasienter og 60 friske donorer (HD). Den optisk tetthet (OD) cut-off mellom respondere og non-respondere ble bestemt som gjennomsnittet OD oppnådd med sera fra 60 HD + 5 standardavvik (SD) (stiplet linje). (B) Sera titrering fra 12 XAGE-1b seropositive pasienter og fra en HD ble utført i en rekke fortynninger, fra 1/100 til 1 /100.000. Antistofftitre ble bestemt som serum fortynning tilsvarende 50% av den maksimale OD respons.
I kohorten, 91 svulster var adenokarsinomer, 40 var plateepitelkarsinom (SCC) og 10 tilhørte andre subtyper . XAGE-1b seropositive pasienter ble utelukkende funnet i adenokarsinom undergruppe, og utgjorde 13% av undergruppen (tabell 2). I motsetning til dette, NY-ESO-1 seropositive pasienter tilhørte det meste til SCC undergruppe, og utgjorde 13% av undergruppen, mens bare 3% av de adenokarsinom pasientene hadde betydelige serologisk respons til NY-ESO-1 (tabell 2). Således bekreftet vi at XAGE-1b er spontant immunogent i NSCLC, for det meste i adenokarsinomer, og viste at dette er tilfelle ikke bare i den japanske populasjon som beskrevet tidligere, men også i hvite. Korrelasjonen mellom serologiske reaksjoner på XAGE-1b og adenokarsinom histologisk subtype nådde statistisk signifikans (Fishers eksakte test, P = 0,0176). I motsetning til våre funn tyder på at antistoffresponser til NY-ESO-1 er hyppigere i SCC pasienter, med data nær, men likevel var ikke statistisk signifikant (Fishers eksakte test, P = 0,0563). Disse resultatene er i tråd med tidligere publiserte data som seropositive for NY-ESO-en ble observert i 29% og 15% av SCC og adenokarsinom pasienter, henholdsvis [21].
Vurdering av XAGE-1b -spesifikke CD4
+ og CD8
+ T-celle responser
Basert på resultatene av den serologiske screening, vurdert vi de 12 antistoff responder pasienter for CD4
+ og CD8
+ T-celle responser på XAGE-1b. For dette formål berikes vi CD4
+ og CD8
+ T-celler fra PBMC av pasientene ved magnetisk cellesortering og stimulert dem i nærvær av et basseng av 17 16-mer overlappende peptider som spenner over hele 81 amino- syresekvensen av den XAGE-1b protein (tabell 1) og dyrket dem i 14 dager i nærvær av bestrålte autologe APC, rhIL-2 og rhIL-7. Ved slutten av dyrkningsperioden, stimulerte vi alikvoter av kulturene som stammer fra hver pasient i fravær eller i nærvær av det XAGE-1b peptid basseng og utlignet respons til XAGE-1b i en 4 timers standard intracellulær cytokin fargingsanalyse, ved anvendelse av antistoffer spesifikk for IFN-γ og IL-17. Vi analyserte prøvene ved flowcytometri (Fig 2A og 2C) og sammenlignet andelen av IFN-γ produserende celler oppnådd for hver kultur i forhold til sin egen referanse respons (i fravær av peptider) for å bekrefte den antigen-spesifikk respons. CD4
+ T-celleresponser ble betraktet som signifikant når andelen av CD4
+ T-celler som produserer IFN-γ i nærvær av peptidet bassenget var minst 3 ganger høyere enn det som ble observert ved utgangspunktet. Basert på disse kriterier, vi har oppdaget signifikante CD4
+ T-celleresponser på XAGE-1b i alle seropositive pasienter (figur 2B), I motsetning til dette, bare i tilfelle av en pasient, vi har oppdaget en XAGE-1b spesifikke CD8
+ T-cellerespons (figur 2D). Men vi klart å påvise spesifikk produksjon av IL-17 som respons på XAGE-1b for noen av kulturene.
(A, C) Nærværet av XAGE-1b spesifikke CD4
+ (A) og CD8
+ (C) T-celle-responser ble evaluert i peptid basseng stimulerte kulturer av intracellulær cytokin farging, med cytokin-spesifikke antistoffer αIFN-γ og αIL-17, etter stimulering i fravær eller nærvær av det XAGE-1b peptid basseng. Prosentandelene av IFN-y-produserende celler er vist i den øvre venstre kvadrant av hver prikk plott som viser øket IFN-γ produksjon i peptid stimulert prøver. Dataene som vises, er et eksempel på et CD4
+ og CD8
+ T-cellesvaret pasient. (B, D) Sammendrag av CD4
+ og CD8
+ T-celle responser er vist for alle de 12 seropositive pasienter. Som vist i (B), er CD4
+ responser oppdaget for alle seropositive pasienter, mens en betydelig CD8
+ respons ble identifisert i en pasient, NA703 (D). Verdier minst tre ganger høyere enn baseline (ingen peptid) ble betraktet som signifikant.
Generering av CD4
+ T-cellekloner, vurdering av de aktive peptider og HLA begrensning
Vi isolerte XAGE-1b reaktive CD4
+ T-celler fra en av de XAGE-1b seropositive pasienter, NA555, ved å anrike den fraksjon av celler som utskilte IFN-γ spesielt i respons til XAGE-1b peptid basseng, ved Miltenyi IFN-γ fangst analysen (figur 3A). For å oppnå spesifikke kloner, dyrket vi de isolerte celler i henhold begrensende fortynningsbetingelser, ekspandert dem og deretter vurderes dem i fravær eller i nærvær av det XAGE-1b peptid basseng (figur 3B). Vi fikk 14 XAGE-1b spesifikke CD4
+ T-cellekloner, som vi tegnes for sin fine spesifisitet ved å vurdere reaktivitet mot de 17 overlappende enkelt peptider som utgjør XAGE-1b peptid bassenget. Vi først testet de enkelte peptider i subpools av 3 peptider hver og kommet frem til at de reaktive peptider ble lokalisert i de første 2 subpools inkludert peptider C1-C3 og C4-C6-(tabell 1). Vi så vurdert responsen til de enkelte peptider som inngår i disse regionene. Fig 3C (venstre panel) viser et eksempel på denne analysen for en XAGE-1b reaktive CD4
+ T-celle-klon (klon A8C7) som gjenkjennes peptid C3. Et sammendrag av den fine spesifisiteten vurderingen av 14 CD4
+ T-cellekloner er vist i figur 3C (høyre panel). 10/14 kloner var reaktiv til peptid C3, 1 klone anerkjent peptider C3 og C4, en klone anerkjent peptid C4, og 2 kloner anerkjent peptid C5. Til sammen fant vi 4 forskjellige flotte særegenheter. Basert på denne reaktivitet, bestemt vi MHC klasse II-molekyler som begrenser antigen gjenkjennelse av enkelt-kloner som representerer de 4 fine spesifisiteter. For å oppnå dette, vurdert vi antigen gjenkjennelse i nærvær av αDP, αDQ, αDR og αDR52b spesifikke antistoffer, i forbindelse med en IFN-γ sekresjon assay, hvor hver klon ble testet i nærvær eller i fravær av det reaktive peptid. Figur 4A viser et eksempel på en MHC klasse II-restriksjonsanalyse utført med CD4 T-celle-klon B2F8, som anerkjente peptidet C3. Som vist, fant vi ut at antigen anerkjennelse av klonen ble spesielt hemmet av αDR antistoff, mens ingen hemming ble påvist med αDP og αDQ blokkerer antistoffer, noe som indikerer at denne klonen ble begrenset av HLA-DR. Lignende resultater ble oppnådd for de andre klonene. Vi tar sikte på å identifisere de HLA-DR begrenser allel. HLA-DR molekylær typing avslørte at NA555 uttrykte DRB1 * 01 og DRB1 * 13 alleler. For å bestemme hvilke av disse molekylene var det å begrense allelet, stimulert vi CD4
+ T-cellekloner i nærvær av LDR1 celler (muse-fibroblaster transfektert med HLA-DR1) eller EBV-transformerte B-cellelinjer (EBV 149, EBV 156) som uttrykker DR13 allelet. Vi pre-inkubert APC med de reaktive peptider og vurderte deres evne til å gi det tilsvarende XAGE-1b peptidet til de CD4 T-cellekloner. Responser ble bestemt ved å måle mengden av IFN-γ i 24-timers kultur-supernatanter, ved hjelp av ELISA. For alle kloner, vi har oppdaget peptid anerkjennelse i nærvær av de EBV-B-cellelinjer (EBV 149, EBV 156) som uttrykker DRB1 * 13, men ikke i nærvær av LDR1-celler (figur 4B).
(A ) XAGE-1b spesifikke CD4
+ T-celler ble isolert ved hjelp av IFN-γ fange analysen. Tallene som er angitt i det øvre høyre område av dot plots viser prosentandelen av IFN-γ produserende celler blant CD4
+ T-celler etter stimulering i fravær eller i nærvær av peptidet bassenget. IFN-y-produserende celler ble sortert og klonet i henhold begrensende fortynningsbetingelser. (B) CD4
+ T-cellekloner ble oppnådd og undersøkt for å bedømme reaktiviteten til XAGE-1b. Kloner ble stimulert i nærvær eller fravær av peptidet bassenget og spesifisitet til XAGE-1b ble bestemt ved hjelp av ELISA. Responser ble betraktet som signifikant når mengden av IFN-γ detektert i nærvær av peptidet var minst 3 ganger høyere enn det som oppdages i fravær av peptid. (C) Porsjoner av XAGE-1b spesifikke CD4
+ T-cellekloner ble stimulert i fravær eller nærvær av peptidet bassenget eller av individuelle enkelt peptider og mengden av IFN-γ ble målt i 24-timers kultur-supernatanter etter ELISA. (D) Reaktivitet til XAGE-1b enkle peptider ble vurdert i 14 kloner og 4 flotte særegen ble identifisert.
(A) Identifisering av MHC II begrenser molekyler. Det venstre panelet viser et eksempel på en HLA-II begrensning analysen klone, B2F8. Peptid gjenkjennelse ble bestemt ved ELISA, inkubering XAGE-1b spesifikke CD4
+ T-cellekloner som oppviser hver av de 4 fine særegenheter, enten i fravær eller i nærvær av αDP, αDQ, αDR og αDR52b spesifikke antistoffer. Peptid gjenkjennelse ble begrenset av HLA-DR i alle tilfeller, som oppsummert i B. HLA-DR begrensende allelet ble identifisert ved inkubering XAGE-1b spesifikke CD4
+ T-cellekloner med forskjellig APC inkludert utransfekterte (3T3) eller DR1 -transfected mus fibroblast (LDR1) og DR13-uttrykker EBV-cellelinjer (EBV149, EBV 156). Hver APC ble pre-inkubert med de reaktive peptider og begrense allelet ble bestemt ved å vurdere deres evne til å presentere peptidene til det tilsvarende CD4
+ T-cellekloner. Peptid gjenkjennelse ble vurdert ved måling av IFN-γ sekresjon i kultursupernatanter, i nærvær av hver enkelt APC. Som oppsummert fant vi at peptid anerkjennelse ble begrenset av HLA-DR13 i alle tilfeller.
Diskusjoner
I denne studien undersøkte vi spontan antistoff og T-celle responser til CTA XAGE -1b i en kohort av 141 kaukasisk NSCLC pasienter. Våre funn viser at serologisk respons til XAGE-1b er i stor grad begrenset til adenokarsinomer som de finnes i omtrent 13% av dem, men er ikke påvist i SCC. Tatt i betraktning at XAGE-1b har blitt rapportert å være uttrykt i ca 45% av adenokarsinomer [18] (men bare 7% av SCC), serologisk respons virke ganske hyppig i denne gruppen av pasienter, blir funnet i omtrent en tredjedel av dem . Disse resultatene er i tråd med tidligere publiserte data i den japanske befolkningen, rapportering serologisk respons til XAGE-1b i 14% av adenokarsinomer, men i bare 2% av SCC pasientene [19]. Våre data indikerer også at serologisk respons på NY-ESO-1 er i stedet mer hyppig i SCC enn i adenokarsinom, slik de finnes i 13% av SCC, men bare i 3% adenocarcinomer fra hvite. Igjen er dette i tråd med resultater fra tidligere studier som har rapportert hyppigere spontan serologiske reaksjoner på NY-ESO-1 i SCC enn i adenokarsinom [21]. I likhet med NY-ESO-1, har vi nylig rapportert at MAGE-A antigener, som også tilhører CTA gruppen, ble oftere uttrykt i SCC, sammenlignet med adenokarsinom [22]. Sammen våre funn bekrefter XAGE-1b immunogenisitet i lunge adenokarsinom, fremhever viktigheten av dette CTA som et lovende mål for immunterapi mot denne svulsten subtype.
I vår studie, vi har oppdaget betydelige XAGE-1b-spesifikke CD4
+ T-celle responser i alle seropositive pasienter, igjen i tråd med tidligere data i den japanske befolkningen [19]. Vi etablerte klonale populasjoner fra en høy responder, fastslått at reaktiviteten av klonene var til sekvenser lokalisert i peptider C3-C5, som samsvarer med 9-32 aminosyre region av proteinet, og identifisert 4 fine spesifisiteten av antigen gjenkjennelse. Vi har vist at, for alle gode spesifisiteter, ble peptidet gjenkjennelse begrenset av HLA-DR. Ved å vurdere antigen presentasjon ved hjelp av APC som deler én HLA-DR lene med de av pasienten, fant vi ut at antigen anerkjennelse av kloner ble begrenset av DRB1 * 13 allel. Det er bemerkelsesverdig at, mens andre XAGE-1b MHC klasse II-epitoper som er begrenset av andre alleler er blitt rapportert [19,23,24], DRB1 * 13 begrenset epitop som er beskrevet her har ikke tidligere blitt rapportert.
Blant våre resultater er i strid med det som er rapportert i litteraturen [19,25]. På den ene siden, både i vårt studium og i tidligere studier i litteraturen [19] XAGE-1b spesifikke CD4
+ T-celler responser ble detektert i praktisk talt alle NSCLC XAGE-1b-seropositive pasienter. Men i strid med resultatene av en nylig rapportert studie [25] i vår studie, XAGE-1b spesifikke CD4
+ T-celler produsert IFN-γ men ikke IL-17, og dermed viste en klar Th1-profil. I tillegg har vi oppdaget en betydelig CD8
+ T-cellerespons i bare en av de 12 seropositive pasienter, noe som er mye mindre hyppig enn frekvensen til 6/9 seropositive pasienter som tidligere er rapportert i den japanske kullet [19]. Dette avviket kan være minst delvis forklares med de ulike metoder som brukes som kan avvike signifikant i form av sensitivitet og spesifisitet for deteksjon. Faktisk, mens vi vurdert CD8
+ T celle responser i en 4 timers standard intracellulær cytokin farging (ICS) analyse, i den japanske studien, CD8
+ T celle responser til XAGE-1b ble vurdert av IFN-γ sekresjon fangst analyse [19]. Således, enten frekvensen av XAGE-1b spesifikke CD8
+ -T-celleresponser i seropositive pasienter som har vært undervurdert i vårt studium, på grunn av den lavere følsomhet av metoden som brukes, eller overvurdert i studien fra Ohue Y et al. på grunn av den nedre spesifisiteten av IFN-γ fangst assay to hypoteser som ikke er gjensidig utelukkende. Imidlertid, i favør av en over-estimering av antall virkelige XAGE-1b CD8
+ T-celleresponser i japansk studie, er det faktum at IFN-γ sekresjons-nivåene oppnådd på denne studie i de fleste av CD8
+ T cellekulturer ved stimulering med XAGE-1b peptider var svært lav, nær bakgrunnsnivå [19].
i konklusjonen, helt, våre resultater støtte relevansen av XAGE-1b antigen i kaukasiske pasienter med lunge-adenocarcinoma og oppmuntre til gjennomføring av fremtidige immunterapier som utnytter den høye immunogene av dette antigenet i denne pasientpopulasjonen.
i tillegg er det verdt å merke seg at, fordi uttrykket XAGE1b er kjent for å bli regulert av DNA-metylering, DNA-metyltransferase-inhibitorer kunne øke den potensielle pasientpopulasjon kvalifisert for XAGE-1b rettet immunterapier, som tidligere rapportert i tilfellet med NY-ESO-1 [26]. Utforske denne muligheten kan være gjenstand for fremtidige studier.
