Abstract
Salinomycin skapt håp for å være effektive i anti-kreft terapi på grunn av sin evne til å overvinne apoptose-resistens i flere typer kreftceller. Nylig, sin effektivitet mot menneskelige leverkreft (HCC) celler både
in vitro Hotell og
in vivo
ble demonstrert. Imidlertid er virkningsmekanismen forble uklar. Nyeste studiene innblandet interferens med degradering vei av autofagi. Denne studien hadde som mål å fastslå effekten av Salinomycin på HCC-autofagi og om primære humane hepatocytter (PHH) også er berørt. Etter eksponering av HCC cellelinjer HepG2 og Huh7 til varierende konsentrasjoner av Salinomycin (0-10 uM), omfattende analyse av autophagic aktivitet ved anvendelse av western-blotting og flow-cytometri ble utført. Virkninger av rusmidler ble analysert i innstillingene til autofagi stimulering av sult eller PP242-behandling og korrelert med celle levedyktighet, spredning, apoptose induksjon, mitokondrie masseakkumulering og reaktive oksygenforbindelser (ROS) formasjon. Innvirkning på apoptoseinduksjon og cellefunksjon PHH ble analysert.
Constitutive og stimulert autophagic aktiviteter både ble effektivt undertrykkes i HCC av Salinomycin. Denne inhibering var assosiert med dysfunksjonell mitokondrier opphopning, økt apoptose og redusert proliferasjon og cellelevedyktigheten. Effekter av Salinomycin var dose og tidsavhengige, og kan lett bli kopiert av farmakologisk og genetisk hemming av HCC-autophagy alene. Salinomycin eksponering for PHH førte til forbigående nedsatt syntese funksjon og celle levedyktighet uten apoptoseinduksjon. Som konklusjon, våre data at Salinomycin undertrykker sene stadier av HCC-autophagy, som fører til svekket resirkulering og akkumulering av dysfunksjonelle mitokondrier med økt ROS-produksjon som alle er forbundet med induksjon av apoptose
relasjon:. Klose J , Stankov MV, Kleine M, Ramackers W, Panayotova-Dimitrova D, Jäger MD, et al. (2014) Hemming av autophagic Flux av Salinomycin Resultater i Anti-kreft effekt i leverkreft celler. PLoS ONE 9 (5): e95970. doi: 10,1371 /journal.pone.0095970
Redaktør: Manlio Vinciguerra, University College London, Storbritannia
mottatt: 10 januar 2014; Godkjent: 01.04.2014; Publisert: 09.05.2014
Copyright: © 2014 Klose et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Heidel Stiftung Chirurgie og Gesellschaft der Freunde für Chirurgie (JK), KFO 250 (GB, MVS), Rebirth EXC 62/1 (GB), og Else Kröner-Fresenius-Stiftung (FWRV; 2010_A49). Forfatterne erkjenner økonomisk støtte av Deutsche Forschungsgemeinschaft og Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg i finansieringsprogram Open Access Publishing. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Salinomycin (Sal) er en polyeter antibiotika mye brukt som anticoccidial i fjørfe [1] og kosttilskudd hos drøvtyggere «og griser» rase [2], [3] på grunn av sin antimikrobiell aktivitet. Nylig, har potensialet for Sal som et anti-cancer middel blitt belyst [4]. Gupta et al. viste en mer enn 100-ganger effektiviteten av Sal sammenlignet med paclitaxel for å drepe brystkreft stamceller hos mus [5]. Senere ble effekten av Sal mot kreftceller bekreftet i flere kreftcellelinjer fra ulik opprinnelse, inkludert faste og ikke-faste malignitet [6] – [9]. Sal representerer også en lovende kandidat for behandling av lever og galle maligniteter som demonstrert for HCC
i
vitro og
in vivo product: [10]. Vi har også nylig vist at Sal er mulig å bryte apoptose-motstand i human kolangiokarsinom (CC) celler [11]. Ikke desto mindre, den nøyaktige virkningsmåte av Sal som et anti-cancer middel er fortsatt uklar. Flere mekanismer som blokkerer Vingeløse-type (Wnt) /β-catenin vei [12] eller aktivering av konvensjonell caspase drevet apoptotiske trasé [13] har blitt foreslått. Det siste, ble en ny mekanisme ansvarlig for den anti-kreft effekt av Sal involverer narkotika-mediert endring av kreftcelle autophagic aktivitet foreslått. Autophagy er en resirkulering vei for bevarte proteiner, organeller eller celleskader. I tumorceller antas autofagi å fremme overlevelse. Avhengig av forsøkssystemet, enten hemming [14] eller aktivisering [15] – [17] ved Sal av denne cellulære nedbrytningsveien er blitt rapportert
således Hensikten med denne studien var å bekrefte den anti-kreft. egenskaper av Sal vedrørende HCC og å klargjøre dens effekt på pro-overlevelse mekanisme av autophagy av disse kreftceller. Siden pro-apoptotiske effekter av Sal har blitt foreslått til overs godartede celler [9], vi videre var interessert i dens innvirkning på primære humane hepatocytter (PHH). Vi har vist at Salinomycin synes å undertrykke sene stadier av HCC-autophagy, som fører til svekket resirkulering og akkumulering av dysfunksjonelle mitokondrier med økt ROS-produksjon og induksjon av apoptose. Videre ble en midlertidig reduksjon av cellefunksjon i PHH etter eksponering for Salinomycin demonstrert.
Materialer og Metoder
Salinomycin
Sal ble kjøpt fra Sigma-Aldrich og oppløst i DMSO . Stamløsninger ble lagret ved -20 ° C. Medikamentkonsentrasjoner var i størrelsesorden tilsvarende
in vitro
eksperimenter [10], [11], [14].
hepatocytter isolert
Isolering av primære humane hepatocytter (PHH ) ble utført ved to-trinns kollagenase perfusjon teknikk som tidligere rapportert [18] (se saksdokumenter). Alle vev givere ga skriftlig informert samtykke for eksperimentell bruk av leverprøve. Protokollen ble godkjent av etikk provisjon av Hannover Medical School.
Cell kultur
Menneskelig HCC cellelinjer HepG2 (American Type Culture Collection (ATCC), bestillingsnummer HB-8065) og Huh7 [ ,,,0],19] ble dyrket i DMEM (PAA) supplert med 10% FCS, penicillin (50 U /ml) og streptomycin (50 mg /l) (Invitrogen). Mediet ble skiftet hver 48 timer. For Autophagy studier begge cellelinjer ble opprettholdt i supplert EMEM ATCC-formulert som tidligere beskrevet [20]. Etablerte hemmere og aktivatorer av autofagi ble brukt ved konsentrasjoner som tidligere er rapportert i analoge
in vitro
eksperimenter: 3 MA (0,4 til 10 mm), LY294002 (0,8 til 20 mm), vinblastin (0,5-10 mm), nocodazol (0,5-10 pM), PP242 (5 uM), klorokin (CQ) (5-100 pM) og ammoniumklorid (ACH) (1-20 mM) [21]. Fysiologisk induksjon av autophagy har blitt utført ved bruk av HBSS inneholdende 6 mM glukose (sultemedium)
nylig isolerte PHH med en levedyktighet . 90% ble sådd på kollagen-belagte 6- og 96-brønners plater ved 1.5 og 0,05 x 10
6 levedyktige celler /brønn, henholdsvis, og dyrket ved hjelp av Williams «medium E, som tidligere beskrevet [18]. Etter eksponering i varierende konsentrasjoner av Sal (0-10 mm) for 24/48 h, var de ytterligere dyrket med normal medium for ytterligere 5 dager. Medium ble endret daglig. Supernatanter og heft celler ble samlet inn for analyse på dager 1/3/5.
Celleviabilitet
PHH og menneske HCC celler ble undersøkt for
in vitro
celleviabilitet av CellTiter 96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega) som tidligere beskrevet [18]. Videre celledød ble også analysert ved bruk propidiumiodite (PI) eksklusjon analyse og flow-cytometri. Alternativt apoptose ble analysert ved hjelp av endringer i mobilnettet FSC versus SSC-prikkplott som tidligere beskrevet [20].
spredningsanalyse
HepG2 og Huh7 celler ble dyrket ved 1 × 10
3 /brønn i medium alene eller med 1-10 uM Sal i 96-brønners plater i 24 timer. For de siste 16 timer i kultur ble cellene pulset med 1 uCi
3H-tymidin inkorporering og detektert av en β-teller som tidligere beskrevet [11].
Annexin V-analyser
HepG2 og Huh7 celler ble analysert for apoptoseinduksjon etter eksponering for 1-10 mikrometer Sal i 24 timer påføre Annexin-V apoptose deteksjon kit (BD Biosciences) i henhold til produsentens instruksjoner som beskrevet tidligere [11].
konstruerer og retroviral infeksjon
plasmider pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B og pBABEpuro GFP-LC3 (N # 22418 og 22405), utviklet av Jayanta Debnath [21], ble hentet fra Addgene. Celle transduksjon og seleksjon ble utført som tidligere beskrevet [20], [22]. Genetisk hemming av autofagi ble oppnådd ved hjelp av
ATG7
shRNA-mediert slå ned (Santa Cruz). Ikke-spesifikk shRNA (kontroll) samt copGFP ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner (Santa Cruz). Transduksjon ble utført ved anvendelse av lentivirale partikler med opptil fem distinkte ekspresjonskonstruksjoner som beskrevet andre steder [20]. Transduksjon effektivitet ble kvantifisert med antall GFP-positive celler og generelt oversteg 94% ved slutten av puromycin utvalg.
Analyse av Salinomycin-medierte effekter på HCC autophagic aktivitet
autophagic kamrene ( pre-autophagosomes, autophagosomes og autophago-lysosomer) representerer mellomliggende komponentene i en dynamisk nedbrytingsprosessen og deres totale beløpet på et bestemt tidspunkt bestemmes av dynamikken i deres etablering og degradering [23]. Vi gjennomførte studier som måler autophagic flux ifølge nyere retningslinjer [23]. Autophagic flux refererer til hele prosessen med autofagi inkludert last levering og påfølgende autolysosomal degradering. Måling av autophagic fluks tillater diskriminering mellom induksjon og sent inhibering av autophagosome modning som begge er karakterisert med en økt tilstedeværelse av autophagosomes [23], [24]. Omdannelse av GFP-LC3-I til GFP-LC3-II ble bestemt ved Western-blotting ved anvendelse av anti-LC-3B-antistoff (Sigma-Aldrich) [23]. Autophagic fluks ble vurdert som opphopning av ikke nedbrutt GFP-LC3-II etter blokkering autophagosomal nedbrytning ved hjelp av ACH. Densitometry LC3-II bånd ble utført ved hjelp LabImage1D programvare (Kapelan Bio-Imaging Solutions) og normalisert til optisk tetthet (OD) av aktin [24]. I tillegg ble autophagic fluks i HCC cellelinjer analysert ved detektering av endringer i total cellulær GFP-LC3 eller mCherry-GFP-LC3 signal ved hjelp av flow-cytometri som tidligere beskrevet [20]. Kort, tilsvarer økt autophagic flux til en progressiv levering av GFP-LC3 å autolysosomes for nedbrytning og signal forsvinning. Videre betyr hemmet autophagic fluks inn i redusert GFP-LC3 forsvinning og på grunn av den konstitutive cellulære produksjon detekteres som en økt total cellulær signal [20]. Analysen ble foretatt på LSR-II (BD Biosciences). Autophagic flux også ble fastsatt ved hjelp Cyto-ID Autophagy Detection Kit (Enzo biovitenskap) i henhold til produsentens instruksjoner som beskrevet tidligere [25]. Denne analyse er basert på en spesifikk fargestoff som selektivt farger autophagic kammere. Autophagic fluks dermed kvantifiseres som opphopning av autophagic avdelinger i grunnleggende eller aktiverte tilstander (HBSS- eller PP242-inkubasjon) etter blokkering av autophagolysosomal nedbrytning av CQ eller ACH. Den beregnes ved å subtrahere Cyto-ID-MFI-verdien for prøven uten CQ /ACH fra den Cyto-ID-MFI-verdien for prøven med CQ /ACH for hver tilstand ved hjelp av formelen: ΔMFI Cyto-ID = MFI Cyto-ID (+ CQ /ACH) -. MFI Cyto-ID (-CQ /ACH)
Mitokondrie masse
Mitokondrie massen ble bestemt ved flow-cytometri hjelp MitoTracker grønn FM (MTR grønn) flekker i henhold til produsentens instruksjoner (molekylære prober) som tidligere beskrevet [26].
reaktive oksygenforbindelser (ROS)
ROS ble bestemt ved flow-cytometri anvende 5- (and-6) -chloromethyl-2 « , 7 «-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) flekker i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen) som tidligere beskrevet [20].
aspartat-aminotransferase lekkasje og ureadannelse
som en mål for graden av celle skade aktiviteten av aspartat-aminotransferase (AST) ble bestemt for PhH kulturer. Videre ble ureadannelse som en indikator for cellefunksjonen undersøkt. Begge parametre ble påvist i kultursupernatantene etter standardiserte enzymaktivitetsanalyser (Roche Molecular Diagnostics) utført av sentrallaboratoriet for Hannover Medical School.
Albumin syntese
Syntesen av albumin ved PHH ble vurdert ved hjelp human albumin ELISA Kvantitering Set (Bethyl Laboratories) som tidligere beskrevet [27].
In vitro
morfologi
den morfologi PHH festet til kollagen-belagte plater behandlet med /uten Sal ble vurdert daglig gjennom hele kulturen periode ved hjelp av fasekontrastmikroskopi.
immunfluorescens
PHH ble dyrket på kollagen-belagt kammer lysbilder på 5 × 10
4 celler /kammeret. Etter 24 h-inkubasjon med varierende konsentrasjoner av Sal (0-10 uM) eller Fas-ligand (Fasl) som en positiv kontroll (1 pg /ml), farging for apoptose ble utført ved anvendelse av M30 Cytodeath kit (TECOmedical GmbH) i henhold til produsentens instruksjoner.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS 20.0 og GraphPadPrism 4. Mann-Whitney-U test, studentens t-test og ANOVA med Dunnett post-hoc analyse var anvendt etter behov. Forskjeller ble betraktet statistisk signifikant med p 0,05. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter.
Resultater
Eksponering for Salinomycin reduserer celleviabilitet og spredning av HCC celler signifikant ved induksjon av apoptose
Å bekrefte den anti-kreft effekt av Sal på humane HCC celler, undersøkte vi cellenes levedyktighet etter medikament-behandling. For dette ble HepG2 og Huh7-celler eksponert for økende konsentrasjoner av Sal (1-10 uM) i 24 timer fulgt av analyse ved bruk av MTS-måling. Tumor celleviabilitet faktisk ble betydelig redusert på stoff konsentrasjoner over 2 mikrometer Sal (Fig. 1a). Deretter virkning på celleformering av HCC celler ble bestemt ved
3H-thymidin-innlemmelsen etter 24 h-inkubering med agent. Som vist i figur 1 B, ble celleformering betydelig svekket i begge cellelinjer på en doseavhengig måte. Denne effekten var påvisbar etter eksponering for en ganske moderat dose på 2 uM Sal. Høyere medikamentkonsentrasjoner nesten fullstendig redusert spredning av humane HCC celler.
HepG2 og Huh7-celler ble utsatt for økende konsentrasjoner av Salinomycin (1, 2, 5 og 10 uM) i 24 timer. (A) Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTS-assay; høye konsentrasjoner av Salinomycin førte til signifikant redusert levedyktighet av begge cellelinjene (n = 5). (B) HCC celler avslørte betydelig redusert spredning etter eksponering for Salinomycin som demonstrert ved redusert
3H-tymidin-opptak. (C) Lave konsentrasjoner av Salinomycin (venstre panel, heltrukket linje) førte til svak økning av apoptotiske celler sammenlignet med ubehandlede celler (prikket linje i overlay). Høye konsentrasjoner markert indusert apoptose (høyre panel, heltrukket linje). Resultatene er vist som representative scatter-g av Annexin V-
+ – celler eller oppsummert som gjennomsnitt ± SD av n = 4 uavhengige eksperimenter (D). * P 0,05, ** p. 0,01
Vi videre analysert, enten Sal indusert apoptose i disse cellelinjene. Som vist i figurene 1C + D, observerte vi en doseavhengig økning av Annexin V-
+ celler etter eksponering til Sal i HepG2-celler. I Huh7 celler betydelig apoptoseinduksjon ble funnet på Sal konsentrasjoner ved og over 2 mikrometer. Induksjon av apoptose av Sal var mer effektive i HepG2 enn i Huh7 celler (25,3% vs. 14,3%).
Salinomycin hemmer autophagic flux og fører til autophagic underlaget opphopning
For å vurdere effekten av Sal på autophagy i HCC celler, ble cellene dyrket i nærvær eller fravær av 10 pM Sal i 15 timer med og uten ACH for den siste 1 time. Semi-kvantitativ western blot-analyse viste Sal-indusert økning i LC3-II (fig. 2A), som taler mot et Sal-mediert inhibering av tidlige stadier av autophagosomal formasjonen. I stedet kan dette tilsvare enten forbedret autophagosome generasjon på grunn av økt autophagic aktivitet eller undertrykkes autophagosome modning [23]. For å løse dette spørsmålet, og for å vurdere autophagic flux av western blot vi anslått akkumulering av LC3-II bånd etter at ACH-mediert blokkering av autophagolysosomal degradering. Akkumulering av LC3-II-bånd ble beregnet ved å subtrahere den densitometrisk intensiteten av prøven uten ACH fra prøven med ACH for hver tilstand (kontroll 3,6 til 1,0 = 2,6; 3,7 til 1,6 Sal = 2,1). Redusert opphopning av LC3-II bånd etter tilsetting av ACH i Sal-behandlede kulturer (2,6 2,1) foreslo narkotika-mediert hemming av autophagic fluks (Fig 2A.). En lignende nedgang i fluks autophagic ble detektert som et resultat av vinblastine- og nocodazol-mediert undertrykkelse av autophagosome modning (
data ikke vist
).
HepG2 og Huh7-celler ble utsatt for forskjellige konsentrasjoner av salinomycin (0,5, 2 og 8 mm) til forskjellige tidspunkter og analysert med hensyn på aktivitet av autophagy. (A) Immunoblot-analyse av LC3-I og LC3-II-isoformer (opp) med densitometri kvantitativ analyse (ned) i HepG2-celler viste Sal-indusert LC3-II-akkumulering på grunn av hemming av autophagic fluks som vist ved redusert LC3-II -accumulation etter tilsetning av ACH. (B) Grunnleggende og PP242-aktivert autophagic flux i Huh7 celler (svarte striper). Behandling med inhibitorer Autophagy 3mA (2 og 10 mM), ACH (5 og 20 mM) eller CQ (5, 20 uM) i 24 timer motvirker PP242 aktivering av autophagic fluks. (C) Inhibering av autophagic fluksen i Huh7-celler etter at shRNA-mediert knockdown av ATG7. (D + E) redusert akkumulering av autophagic kamrene etter blokkering av autophagolysosomal nedbrytning av ACH indikerer redusert autophagic fluks i HepG2 (D) og Huh7 (E) celler behandlet med Sal i 24 timer. Ved siden av søylediagrammer representative histogrammer er avbildet. Alle eksperimenter er presentert som gjennomsnitt ± SD av n = 3 uavhengige eksperimenter * p . 0,05; ** P 0,01, *** p. 0,001
Før vi kunne vurdere effekten av Sal på HCC autophagic forandring, vi validert flow-cytometri overvåking av intracellulære omsetningen av autophagic avdelinger i HCC celler [25], [28]. Autophagy aktivering av PP242 ført til en klar økning i autophagic fluks (Fig. 2B). Tilsetting av autofagi hemmere som 3-MA, ACH, eller CQ resulterte i en reduksjon av autophagic forandring. Lignende resultater ble oppnådd ved anvendelse av rapamycin eller sult (
data ikke vist
) og bekreftet anvendbarheten av analysen i HCC celler. Til slutt utelukke pleiotropiske effekter fra de farmakologiske hemmere, verifisert vi autophagic fluks måling av Cyto-ID ved hjelp av autofagi-spesifikk shRNA-mediert knockdown av
ATG7 plakater (Fig. 2C).
Neste, vi ønsket å evaluere effekten av Sal på HCC er autophagic forandring. HepG2-celler ble dyrket i nærvær av Sal (0,5, 2 og 8 mm) i 24 timer og sammenlignet med ubehandlede celler. Sal merkbart redusert autophagic fluks tids- og doseavhengig måte, selv når autophagy ble indusert ved PP242 (fig. 2D). Lignende resultater ble observert ved hjelp HUH7 celler (Fig. 2E) og alternativ aktivering av rapamycin eller sult (
data ikke vist
).
Til slutt søkte vi overvåking av intracellulær LC3-omsetning [22] . For dette har vi brukt HepG2 celler som stabilt uttrykker LC3-GFP. Inkubasjon med 3 MA (2 og 10 mM), LY (2 og 10 mM), nocodazol (2 og 10 uM) eller ACH (0,8 og 4 mM) i 7 timer fører til opphopning av GFP-LC3 signal, som forventet (fig . 3A). Sult økte autophagic fluks som detekteres ved redusert LC3-GFP signal i kontrollcellene, hvilket indikerer mer degradering (fig. 3A), en effekt som ble tapt når farmakologiske Autophagy inhibitorer var til stede (fig. 3A). Neste HepG2-celler som konstitutivt uttrykker LC3-GFP-fusjonsprotein ble dyrket med og uten Sal i 24 timer. Sal merkbart hemmet autophagic fluksen som detekteres av akkumulering av total cellulær LC3-GFP-signal (fig. 3B). Igjen, sals effekter på autophagic flux var tids- og doseavhengig og lett merkbar ved konsentrasjoner som tidligere er rapportert å utøve anti-kreft effekt [10]. Undertrykkelse av autophagy har vært assosiert med dysfunksjonell mitokondrier opphopning med økt produksjon av ROS [29], [30], som kan utløse apoptose [29] – [32]. Således, analyserte vi hvorvidt Sal behandling ble ledsaget av akkumulering av mitokondriell masse. Faktisk, bekreftet våre resultater en doseavhengig akkumulering av mitokondriell masse (Fig. 3C). Videre akkumulerte mitokondrier vises tegn til dysfunksjon vist ved økt tilstedeværelse av ROS produksjon (Fig. 3D). Viktigere, farmakologiske og genetisk hemming av autofagi i HCC celler helt gjentok Sal effekter på dysfunksjonelle mitokondrier akkumulering, ROS produksjon og celle levedyktighet. Basert på dette konkluderer vi med at Sal effekter på HCC celler kan i det minste delvis medieres gjennom sin evne til å undertrykke autophagic fluks (se Fil S1 og S1 fig.).
(A) Hemming av grunnleggende og HBSS-aktivert autophagic fluksen i HepG2-celler som stabilt uttrykker LC3-GFP ble behandlet med 3-MA (2 og 10 mM), LY (2 og 10 mM), nocodazol (2 og 10 uM) eller ACH (0,8 og 4 mM) i 7 timer. (B) Inhibering av autophagic fluksen i HepG2 celler behandlet med Sal (0,5, 2 og 8 mm) i 24 timer (til venstre) med representative histogrammer (til høyre). (C) Flow-cytometri analyse av total mitokondriell masse hjelp MitoTracker Grønn (MTR grønn) viser opphopning av dysfunksjonelle mitokondrier. (D) Bevis for økt ROS-produksjon ved hjelp av CM-H2DCFDA (til venstre) med representative histogrammer (til høyre). Alle eksperimenter er presentert som gjennomsnitt ± SD av n = 3 uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** p 0,01
Eksponering av PHH til Salinomycin resulterer i forbigående reduksjon av cellefunksjon og
in vitro
morfologi, men fører ikke til apoptose
Basert på rapporter om at Sal utviser anti-kreft-effekter mot tumorceller, men forårsaket lite apoptose i ikke-tumorceller, og det faktum at leveren ville representere et målorgan for behandling av HCC, vi neste fokusert på Sal effekt på primære humane hepatocytter. Generelt, har behandling med lave konsentrasjoner av Sal (1-2 uM) i 24 timer ikke eksplisitt forandre PHH-utseende (fig. 4A). Sammenlignet med kontrollen, hepatocytter dukket opp litt berørte med uregelmessige cellemembraner. Høyere konsentrasjoner av Sal (5-10 mm) om delvis resultert i mer åpenbare endringer: PHH viste tegn på integritet ødeleggelse og med tap av samløpet. Ytterligere inkubering av disse kulturer i fravær av Sal førte til full gjenvinning av PHH utsettes for lave og middels doser opp til 5 uM. I motsetning til dette, etter stimulering med 10 uM Sal i 24 timer var det ikke noe lys mikroskopisk påvisning av en effektiv utvinning av de fleste tilfeller. Inkubasjon av PHH i 48 timer resulterte i tilsvarende mønstre: (Fig. 4A). Behandling med lave konsentrasjoner av midlet skyldes i stedet marginale morfologiske endringer, mens høyere doser igjen kan føre til cellulære forandringer
Etter en dags inkubering dyrket PHH ble utsatt for økende konsentrasjoner av Salinomycin (1, 2, 5 og 10 uM) ved forskjellige eksponeringstiden (24 og 48 timer, henholdsvis). (A) Nedskrivning av
in vitro
morfologi uten påfølgende oppgangen var bare påvises etter behandling med høye konsentrasjoner av Salinomycin (10 mm), mens behandling med opp til 5 mikrometer Salinomycin resulterte i morfologisk bedring etter bortfall av agenten. (B + C) Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTS-måling. Det ble ikke observert salinomycin behandling av 24 (B) og 48 (C) timer førte til signifikant nedsatt cellelevedyktighet på dag 1 og 3. Etter ytterligere inkubering utvinning av de celler som indikert ved å øke produksjonen av det fargede formazaan-produkt (n = 6) . (D + E) celleskade av PHH som representeres av AST frigivelse var bare påvisbar umiddelbart etter medikament eksponering (dag 1) til 10 uM Salinomycin for 24 (D) og 48 (E) timer, henholdsvis. Denne forskjellen var ikke statistisk signifikant (n = 3). Pågående inkubasjon ble ledsaget av knapt målbar AST utgivelse. * P 0,05, ** p. 0,005
Vi neste undersøkte
in vitro
celle levedyktighet PHH bruke MTS-analysen. Cellenes levedyktighet ble bestemt umiddelbart etter medikament-eksponering (dag 1) så vel som på dagene 3 og 5 etter Sal-behandling. Som vist i figur 4B, 24 h-eksponering signifikant nedsatt cellelevedyktighet på dagene 1 og 3 på en doseavhengig måte. Bortfall av stoffet og pågående inkubasjon førte til nesten fullstendig gjenoppretting av PHH etter dag 5 (Fig. 4B). Stimulering med Sal i 48 timer resulterte i en lignende doseavhengig reduksjon av cellenes levedyktighet og etterfølgende gjenvinning. Men den sistnevnte var ikke som tilstrekkelig som ble observert etter 24 timers eksponering (fig. 4C).
Gitt at inkubasjon av PHH med økende konsentrasjoner av Sal resulterte i en midlertidig reduksjon av cellenes levedyktighet og histomorphologic forandringer, vi undersøkt om andre markører for celleskade likeledes kunne påvises. Tall 4D + E viser at sammenlign lekkasje av AST ble funnet blant alle eksperimentelle grupper. En markert topp på AST-utgivelsen kun ble observert på dag 1 etter eksponering for 10 mikrometer Sal men nådde ikke statistisk signifikans. Pågående inkubasjon uten Sal ga moderat grunnleggende frigjøring av AST i alle grupper.
Neste vi analysert om Sal-behandling svekker funksjonen PHH. For dette ble urea-formasjon og albumin-syntese av narkotika eksponerte PHH bestemt. Som vist i figur 5A + B var der ingen relevant variasjon i ureadannelse etter 24 h-stimulering med Sal. I motsetning til dette, etter 48 timers eksponering en doseavhengig reduksjon av urea-dannelsen var detekterbar, spesielt på dag 3 og 5, men nådde ikke statistisk signifikans (Fig. 5 A + B). Albumin-syntese ved PHH utsettes for Sal i 24 timer er karakterisert ved doseavhengig reduksjon på dag 1 (fig. 5C + D). Bortfall av Sal forårsaket en langsom bedring av cellefunksjonalitet med en kontinuerlig økning av albumin-produksjon, men etter stimulering med høye medikamentkonsentrasjoner. En lignende, men enda mer uttalt effekt ble observert ved 48 h-eksponering. Igjen, etter bortfall av agenten en kontinuerlig – men mye tregere – innsamling av PHH ble funnet (figur 5C + D.)
Funksjonalitet av PHH etter behandling med Salinomycin ble analysert ved ureadannelse og albumin syntese.. (A) 24 timer etter Salinomycin eksponering ved varierende konsentrasjoner ble ikke ledsaget av nedsatt ureadannelse i det hele tatt. (B) I motsetning til dette, behandling i 48 timer resulterte i en doseavhengig reduksjon av ureadannelse på dag 1, 3 og 5 uten å nå statistisk signifikans. (C + D) Albumin-syntese ble alvorlig forringet ved dag en etter stimulering med Salinomycin i 24 og 48 timer henholdsvis. Videre inkubasjon ført til kontinuerlig bedring av albumin syntese i gruppene med 24 timer etter legemiddeleksponering. I motsetning til dette, behandling i 48 timer resulterte bare i moderat gjenvinning av albumin syntese (n = 3). * P 0,05, ** p. 0,005
Til slutt var vi interessert i å avgjøre om den forbigående svekkelse av PHH etter 24 timer eksponering for Sal korrelerer med apoptose induksjon. Som det fremgår av figur 6, har eksponering for Sal ikke provosere apoptose av disse godartede celler i motsetning til Fasl-behandling.
Cultured PHH ble utsatt for økende konsentrasjoner av Salinomycin (1, 2, 5 og 10 uM) for 24 timer. Apoptose ble oppdaget av M30 Cytodeath kit. Behandling med Fas ligand (Fasl) fungerte som en positiv kontroll. Farging av PHH med DAPI (blå) og M30 Cytodeath kit (rød) viste ingen tegn for induksjon av apoptose i PHH selv etter behandling med høye konsentrasjoner av Salinomycin. I kontrast, Fasl klart indusert apoptose i PHH.
Diskusjoner
Våre data støtter forestillingen om at Sal utøver en pro-apoptotisk effekt i HCC celler ved hemming av autophagic forandring som fører til opphopning av dysfunksjonelle mitokondrier og økt ROS-formasjon. Gitt at kreftceller antas å oppleve mer iboende stress og derfor er spådd til å være svært avhengig av autofagi for å overleve [33] vår studie kan bidra til å forstå hvorfor Sal selektivt dreper kreftceller mens sparsom godartede celler. Denne hypotesen er forsterket av den observasjon at eksponering av PHH til Sal bare resulterer i forbigående svekkelse av cellefunksjon uten betydelige skader.
Siden HCC er den tredje største årsaken til kreft [34] og den vanligste primær lever malignitet med begrensede behandlingsopsjoner spesielt på avansert stadium av sykdommen [34], [35], innovative terapeutiske tilnærminger er avgjørende. Potensialet av Sal for behandling av HCC ble først foreslått av arbeidet til Wang et al. som viste hemming av spredning og induksjon av apoptose i HCC
in vitro Hotell og
in vivo
etter legemiddeleksponering [10]. For å dissekere den nøyaktige virknings av Sal vi fokusert på den molekylære mekanismen for Sal i HCC. Bruke HepG2 og Huh7 celler og omfattende kvantitative analyser vi var i stand til å vise at Sal hemmer autophagic flux i menneskelige HCC celler. Følgende funn ledet oss til den konklusjon at Sal-mediert hemming av autophagic forandring kan være ansvarlig for apoptose i HCC celler. Først viste vi en doseavhengig akkumulering av dysfunksjonelle mitokondrier med økt ROS-produksjon. Eliminering av dysfunksjonelle mitokondrier og dermed reduksjon av pro-apoptotiske signaler som cytokrom
c
utgivelsen er ansett for å være en integrert del av den pro-overlevelse mekanisme av autofagi [36]. Av notatet, har autofagi gjentatte ganger blitt vist seg å være avgjørende for fjerning av dysfunksjonelle mitokondrier [31], [37]. Påvisbar endring av mitokondriell masse og ROS først bare etter betydelig hemming av autophagic fluks og ble etterfulgt av en massiv induksjon av apoptose og celledød. For det andre, i henhold til våre eksperimentelle forhold farmakologiske og genetisk hemming av autofagi helt gjentok disse hendelsene. Selv om man tar i betraktning at nesten alt av de farmakologiske inhibitorer liggende pleiotrope effekter på flere veier [23], det faktum at genetisk inhibering resulterte i analog endring argumenterer for muligheten for at våre observasjoner er i det minste delvis formidlet ved undertrykkelse av autophagic fluks. Virkningen av Sal på autofagi i kreftceller er for tiden diskutert kontroversielt. Jangamreddy et al.
