Abstract
epigenetisk genet stanse, formidlet av avvikende promoter DNA hypermethylation og undertrykkende histonmodifikasjonene, er et kjennetegn på kreft. Selv om arvelig, dynamikken og potensielle reversibilitet gjennom farmakologiske intervensjoner gjøre slike avvik attraktive mål. Siden kreft inneholde flere epigenetiske forandringer, kunne kombinere behandlinger som er rettet mot ulike defekter potensielt forbedre sine individuelle efficacies. 5-aza-2′-deoksycytidin (5-Aza-CDR), FDA-godkjent legemiddel for behandling av myelodysplastisk syndrom, kan hemme DNA-metyltransferaser (DNMTs) ved inkorporering i DNA til delende celler, noe som resulterer i global demetylering. Flere nylig, den første histon demetylase, lysin bestemt demetylase 1 (LSD1), som demethylates både histon og ikke-histone underlag, har blitt et nytt mål for epigenetisk terapi. Ved hjelp, Klorgylin, en LSD1 inhibitor (LSD1i) for å behandle kreftcellelinjer, viser vi at Klorgylin benytter to virkningsmekanismer, avhengig av celletype: det kan enten forårsake global DNA demetylering eller inhibere LSD1 drevet H3K4me2 og H3K4me1 demetylering for å etablere en aktive kromatin konfigurasjonen. Vi undersøker også den terapeutiske effekten av å kombinere 5-Aza-CDR med Klorgylin og fastslår at dette kombinatorisk behandling har synergieffekter på reaktivere abnormt forstummet gener ved berikende H3K4me2 og H3K4me1. Mange av de reaktivert genene er kategorisert som kreft testis antigener eller tilhører den interferon-signalveien, noe som tyder på mulige konsekvenser for immunterapi. Sammen våre resultater viser at kombinatorisk behandling som består av en DNMT inhibitor (DNMTi) og en LSD1i har forbedret terapeutiske verdier og kan forbedre effekten av epigenetisk terapi
Citation. Han H, Yang X, Pandiyan K, Liang G (2013) Synergistic Re-aktivering av epigenetiske forstummet gener ved kombi Hemming av DNMTs og LSD1 i kreftceller. PLoS ONE 8 (9): e75136. doi: 10,1371 /journal.pone.0075136
Redaktør: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, Kina
mottatt: 7 mai 2013; Akseptert: 10. august 2013, Publisert: 06.09.2013
Copyright: © 2013 Han et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. National Institutes of Health (NIH) [RO1CA124518 og CA138794] til gl. XY og KP støttes sjenerøst av Stand Up to Cancer [2000901485]. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Gene stanse formidlet av avvikende promoter DNA hypermethylation og histonmodifikasjonene er en av kjennetegnene til kreft. Selv om slike modifikasjoner er arvelig, deres dynamiske natur og reversibilitet gjennom farmakologiske intervensjoner gjøre dem attraktive terapeutiske mål [1]. I løpet av de siste tiårene, har ulike medikamenter som er rettet mot ulike typer epigenetiske forandringer er utviklet med mål om å reaktivere abnormt forstummet gener, inkludert DNMTi og histone deacetylases hemmere (HDACi) [2], [3]. Mange av dem har vist lovende terapeutisk verdi i behandling av ulike kreftformer, både som enkeltmidler og i kombinasjon med andre behandlingsformer og flere har blitt godkjent av FDA.
N-termini av histoner gjennomgå en rekke post- translasjonelle modifikasjoner for å generere transcriptionally givende eller ildfaste kromatin conformations avhengig av type og plassering av modifikasjon [4], [5]. For eksempel er transcriptionally aktive arrangører preget av enrichments av dimetylering og trimethylation av H3K4 og acetylering av H3 [6]. Transcriptionally inaktive arrangører er preget av enrichments enten trimethylation av H3K9 eller trimethylation av H3K27 [5]. Den balanserte aktivitet av histone modifisering enzymer som legge til eller fjerne spesifikke endringer er avgjørende for normal cellefysiologi [2]. Kreftceller mangler ofte denne balansen og oppviser en global reduksjon i acetylering og promoter-spesifikk reduksjon av di- og trimethylation av H3K4, noe som resulterer i avvikende genet Slå [1], [7]. Histone lysin metylering ble ansett som en relativt permanent endring til oppdagelsen av den første histone demetylase -lysin bestemt demetylase 1 (LSD1 /KDM1 /BHC10 /AOF2) [8], [9]. Etter det har blitt investert mange forsøk på å utvikle hemmere mot histone demethylases.
LSD1 demethylates mono- og dimetylering av H3K4 gjennom en Flavin adenindinukleotid (FAD) avhengig mekanisme [9], og dermed har potensial til å undertrykke genekspresjon [10]. Før oppdagelsen av dets evne demethylating, ble LSD1 kjent for å assosiere med et antall ko-repressor-komplekser, inkludert CoREST [11], CtBP [12] og en undergruppe av HDAC komplekser [13]. Under demetylering prosessen blir et imin mellomprodukt som dannes som videre er hydrolysert for å generere en unmethylated lysin og formaldehyd som et biprodukt [9], [14], [15]. LSD1 kan også demethylate et antall ikke-histon underlag, som DNMT1, hvilket er rapportert som gjør det mer stabilt [16], [17], og dermed potensielt bidrar til økt global DNA-metylering. Til sammen LSD1 har to mulige virkningsmekanismer for å undertrykke genekspresjon: det kan demethylate mono- og dimethylated H3K4 samt stabil DNMT1
Overuttrykte LSD1 har blitt rapportert i en rekke kreftformer, inkludert akutt myelogen. leukemi (AML) [18], neuroblastom [19], brystkreft [20], blære karsinom, småcellet lungekreft og kolorektal karsinom [21], som tyder på at LSD1 hemmere kan ha viktig terapeutisk fordel i mange tumorer. LSD1 har blitt identifisert til å blokkere differensiering i MLL [22] og regulere epitel-mesenchymale overganger (EMT) for å aktivere motilitet gener [23]. LSD1 hemmere kan fremme differensiering av høy klasse prostata kreft celler [24], undertrykke blærekreft celleproliferasjon [25], og reaktivere abnormt forstummet gener [26]. De katalytiske domener av LSD1 og MAO oksidase dele strukturell homologi og gjøre bruk av den samme katalytiske mekanismen [9]. Derfor er det mange monoaminoksidasehemmere er også LSDi. En slik monoaminoksidase-inhibitor, Klorgylin, kan også hemme lysin spesifikke demethylases [19], [20], [27], [28].
På grunn av tilstedeværelsen av flere epigenetiske unormalt i kreftcellene, vi undersøkt den kombinerte terapeutiske verdien av fem-Aza-CDR og Klorgylin å hemme DNMTs og LSD1, i blærekreft (T24), leukemi (HL60) og tykktarmskreft (HCT116) cellelinjer. Vi observerer at Klorgylin benytter to forskjellige virkningsmekanismer i de tre cellelinjene vi studerte. I T24 og HL60-celler, Klorgylin alene frembringer minimale virkninger på reaktivering av abnorme dempede gener sammenlignet med den ubehandlede kontroll. Men induserer kombi behandling synergieffekter på reaktivering av epigenetiske forstummet gener. Videre bare kombinatoriske behandlingsresultater i enrichments av H3K4me2, H3K4me1 og H3K9 /14 acetylering på arrangører av oppregulert gener. På den annen side, i HCT116-celler, Klorgylin alene induserer global DNA demetylering og gen-aktivering. Men den kombinatoriske behandling ikke lokke fram synergieffekter på genet reaktivering. Til tross for viser ulike mekanismer for handlinger i cellelinjene, kollektivt, vår studie viser at kombinatorisk behandling har forbedret terapeutiske verdier, og introduserer en ny tilnærming i kreft ledelse.
Materialer og metoder
Medikamentell behandling og kultur vilkår
T24, HCT116 og HL60 celler, kjøpt fra ATCC, ble belagt på 2 × 10
5 celler /100-mm fatet, 3 × 10
5 celler /100-mm fatet og 5 × 10
5/25 cm
2 kolbe, henholdsvis. De ble behandlet den neste dag med 1 uM, 0,3 uM og 0,1 uM av 5-Aza-CDR (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), henholdsvis i 24 timer. Etter fjernelse av 5-Aza-CDR, ble cellene behandlet med 10 uM Klorgylin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) hver dag i 21 dager. Flere doser Klorgylin ble testet: 1 mikrometer, 10 og 100 um. Klorgylin nedsatt cellevekst på en doseavhengig måte, og den optimale dose for Klorgylin (10 uM) ble bestemt ved å overvåke doseresponskurven.
kolonidannelse
Celler ble sådd ut i 6-brønns plater på 1000 celler per brønn med eller med angitte behandling. Dyrkningsmediet ble endret etter 3 dager. Etter 10 dagers inkubering ved 37 ° C ble cellene vasket med PBS, fiksert med metanol og farget med 0,5% krystallfiolett. Kolonier som inneholder mer enn 50 celler ble talt under et mikroskop.
Chromatin Immunpresipitasjon (chip) Analyse
chip analysene ble utført som beskrevet tidligere bruker 4 × 10
6 celler per IP [6 ]. Ti ug av de følgende antistoffer ble brukt: H3 og H3K4me2antibodies ble anskaffet fra Abcam (Cambridge, MA). Acetylert H3, og IgG-antistoffer ble anskaffet fra Millipore (Billerica, Massachusetts). H3K4me3 og H3K4me1 antistoffer ble kjøpt fra Active Motif (Carlsbad, California). PCR primere er tilgjengelig på forespørsel.
Real-time RT-PCR
Total RNA ble isolert fra celler med Trizol reagens (Invitrogen) på angitte tidspunkter. En mikrogram av RNA ble revers transkribert ved hjelp av M-MLV (Invitrogen) og tilfeldige heksamer (Invitrogen). PCR reaksjoner ble utført ved hjelp av KAPA SYBR® FAST Universal 2X qPCR Master Mix og på Bio-Rad CFX
© 96 Real time PCR deteksjon systerm. Sekvensene av genet spesifikke primere er tilgjengelig på forespørsel. Med hvert sett av PCR-primere, ble titreringer av kjente mengder av DNA inkludert som en standard for kvantifisering.
infinium
infinium DNA metylering Analysen ble utført ved USC epigenome senteret i henhold til produsentens spesifikasjoner (Illumina, San Diego, California). Den Illumina infinium DNA metylering analyse (infinium HumanMethylation450 BeadChip) undersøker DNA metylering status for 485.000 CpG områder, som dekker 99% av RefSeq Gener og intergeniske regioner valgt av metylering eksperter. Nedstrøms prosessering og beta verdiberegninger ble gjort som beskrevet tidligere [29].
Expression Microarray
Expression analyse ble utført ved Sanford-Burnham Medical Institution (La Jolla, CA) ved hjelp av Illumina genome- bredt uttrykk BeadChip (HumanHT-12_V4_0_R1) (Illumina). Genuttrykk data ble behandlet med lumi pakken i R. Dataene ble log2 transformert og normalisert ved hjelp av Robust Spline Normalisering (RSN) som implementert i lumi pakken. Sammenligninger mellom kontroll og behandlede prøver for alle tre cellelinjer ble utført ved anvendelse av R-pakken limma. Gener (transkripsjonene) med en p-verdi under 0,01, og en fold-endring som er større enn 2 i forhold til kontrollgruppen ble betraktet som signifikant. Oncomine ™ (Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI) ble benyttet for analyse og visualisering av offentlig tilgjengelige genuttrykk data. Nedstrøms nettverk og ontologi analyse ble utført ved hjelp MetaCore fra GeneGo Inc.
Statistical Analysis
Alle statistiske tester ble gjort ved hjelp av R-programvare (R versjon 2.15.2, R Development Core-Team, 2012). «Lumi «pakken ble brukt til å normalisere og behandle genuttrykk data. Stempler og visualisering av DNA-metylering prober ble gjort ved hjelp av pakker tilgjengelig gjennom Bioconductor ( «TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene», «rtracklayer», «Gviz» og «IlluminaHumanMethylation450kprobe»). De følgende CRAN pakkene ble brukt til å generere plott: «ggplot2», «gplots» og «venn-diagram». Gene ontologi analyser ble gjort ved hjelp av DAVID Functional Annotation Tool (Huang da et al. 2009). Chip data ble analysert ved hjelp av student t-tester på GraphPad Prism versjon 5 (GraphPad Software).
GEO-tilgangsnummeret
Alle genom-wide data som brukes i studien har blitt deponert i GEO under tiltredelse antall GSE41754.
resultater
kombi~~POS=TRUNC behandling av en DNMTi og en LSDi resulterer i mer hemming av cellevekst og kolonidannelse enn noen av de enkle midler
på analyse av gen uttrykk data tilgjengelig gjennom Oncomine ™ (Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI), observerte vi at LSD1 er over-uttrykt i blærekreft, leukemi og tykktarm adenokarsinomer i forhold til sine normale kolleger (Figur 1a), noe som tyder på at overekspresjon av LSD1 kan spille en rolle i tumorgenese. I tillegg er det blitt vel etablert at avvikende DNA-metylering er involvert i initiering, så vel som utviklingen av forskjellige maligniteter, inkludert i de tre cancere som er nevnt ovenfor [30]. Derfor er en blærekreft cellelinje, T-24, er en leukemicellelinje, HL60 og en tykktarmskreft cellelinje, HCT116 ble valgt for å undersøke effekten av å inhibere LSD1, så vel som for å bedømme den terapeutiske effekt av et kombinatorisk behandling som består av en LSD1i og en DNMTi.
A. Uttrykket nivåer av LSD1 i blærekreft, T-celle akutt lymfatisk leukemi, tykktarm adenom og deres normale kolleger ble hentet fra ONCOMINE. Tall i parentes angir antall prøver som brukes til å generere boksplott. B-D. Befolknings dobling tider for kontroll (svarte), Klorgylin behandlet (gul), 5-Aza-CDR behandlet (rød) og kombinatorisk behandling behandlet (grønn) i T24, HL60 og HCT116-celler. De tilsvarende tallene for timer er oppført i tabellen nedenfor hver graf. E. Kvantifisering av antall kolonier produsert av kolonidannelse forsøk i T24 og HCT116-celler etter behandling er angitt
Alle cellelinjer ble behandlet som følger:. Klorgylin alene, 5-Aza-CDR alene, og kombinatorisk behandling av Klorgylin og 5-Aza-CDR. Cellene ble behandlet med 5-Aza-CDR i 24 timer før du bytter media. I kontrast, celler som har mottatt en ny dose av Klorgylin hver dag i 21 dager. I alle tre celletyper som ble undersøkt, både 5-Aza-CDR og Klorgylin behandling alene utvidet cellepopulasjon doblingstiden mellom 3 og 10 timer, med den kombinatorisk behandling ytterligere økning doblingstiden, opptil 16 timer (figur 1 B, C, D).
for å vurdere den terapeutiske effekten av Klorgylin, 5-Aza-CDR og kombinatorisk behandling på overlevelse og spredning av celler, utførte vi kolonidannelse analyser på de to heftcellelinjer, T-24 og HCT116-celler. Klorgylin viste en moderat effekt i å undertrykke muligheten for T24 og HCT116-celler til å danne kolonier. 5-Aza-CDR i det vesentlige undertrykkes kolonidannelse og den kombinatoriske behandling ytterligere redusert antall kolonier (fig S1 og 1E). Våre data viser at både Klorgylin og 5-Aza-CDR hemme cellevekst og undertrykke kolonidannelse. I tillegg er det kombinatoriske behandlingen videre bremser befolkning doblingstiden og reduserer muligheten for celler til å proliferere.
Combinatorial behandling av en DNMTi og en LSDi oppregulerer flere gener enn hver av de enkelte stoffer i T24 og HL60-celler i betydelig grad
For å undersøke globale endringer i genuttrykk profil etter Klorgylin, 5-Aza-CDR og kombinatorisk behandling, gjennomførte vi genom-wide uttrykk studier på dag 18 etter behandling (D18), ved hjelp av Illumina HumanHT-12 V4 BeadChip i T24 og HL60 celler. Det er godt dokumentert at 5-Aza-CDR induserer umiddelbar demetylering og påfølgende gen reaktivering [31], [32]. Det har også blitt etablert som metylering returer og gener blitt re-forstummet etter seponering [33], siden DNMT nivåer få opp igjen. Derfor valgte vi et relativt sent tidspunkt å vurdere om kombinatorisk behandling kan indusere vedvarende genet reaktivering. Genuttrykk endringer av alle vitnemål etter angitt behandlinger er vist som vulkan plott (figur 2A). På dag 18, i T24 celler, Klorgylin alene gjorde ikke signifikant up-regulere eventuelle vitnemål, mens 5-Aza-CDR behandling økt uttrykk av 30 transkripsjoner. Bemerkelsesverdig, den kombinatoriske behandling indusert vesentlig mer transkripsjoner (108 transkripsjoner) som var signifikant oppregulert (figur 2A). For å studere overlapping mellom oppregulert transkripsjoner på de forskjellige behandlingene vi generert et Venn-diagram, som viser at alle utskrifter indusert av 5-Aza-CDR ble også indusert av kombinatorisk behandling (figur 2B). Deretter sammenligne den globale genuttrykk induksjon forskjellen mellom 5-Aza-CDR og kombinatorisk behandling, vi plottet den observerte log2 ganger endring for alle avhørt transkripsjoner på plattformen. De fleste av disse transkripsjoner er synergi oppregulert ved kombinatorisk behandling (figur S2), som viser at Klorgylin supplerer evnen til 5-Aza-CDR å aktivere gener i T24 celler. I tillegg til å supplere 5-Aza-CDR, kan kombinatorisk behandling også aktivere gener som ikke klarte å være oppregulert med 5-Aza-CDR alene. Syttiåtte gener ble bare oppregulert ved kombinatorisk behandling (figur 2B), hvilket antyder at det kombinatoriske behandling kan anvende en annen virkningsmekanisme enn ved behandling av 5-Aza-CDR alene. Interessant nok er de gener som er synergistisk oppregulert ved kombinatorisk behandling anriket for spesifikke funksjoner, slik som immunrespons, cytoskjelettet ombygging og cellesyklusregulering (figur 2C, fig S3). En detaljert analyse ble utført på gener som er en del av IFN-alfa og IFN beta signalveien. Analysen viste at den kombinatorisk behandling stimulerer ekspresjonen av flere gener som er viktige for en effektiv immunrespons overfor virale infeksjoner (figur 2C).
. A. Gene uttrykk log2 forskjellen er plottet på x-aksen, og -log10 (p-verdi) plottes på y-aksen. Sonder som er identifisert som signifikant forskjellig mellom to grupper er farget i rødt. B. Venn skjærer av antall gener som er oppregulert ved den angitte behandling. C. Network berikelse diagram som inneholder gener som er synergi oppregulert ved kombinatorisk behandling. Synergi oppregulert gener er merket med røde streker. De andre symboler som brukes er sett på Metacore nettstedet.
Vi har også gjennomført genom-wide uttrykk studier i HL60 celler. Genuttrykk endringer av alle vitnemål etter den indikerte behandling er vist som vulkan plott. Ved hjelp av tidligere etablerte tidsavgrensninger, identifiserte vi forskjellig uttrykt transkripsjoner, som er uthevet i rødt (figur 3A). Vi fant at mens alle tre behandlinger induserer genet oppregulering av kombinatorisk behandling induserer uttrykk for flere vitnemål, viser en lignende uttrykk profil til T24 celler. Klorgylin, 5-Aza-CDR og kombinatorisk behandling oppregulert 43, 200 og 346 utskrifter, henholdsvis (figur 3B). Selv om det var en betydelig overlapping mellom 5-Aza-CDR og kombinatorisk behandling, kombinatorisk behandling var mer effektiv på genet induksjon i at det oppregulert 180 transkripsjoner som ikke ble oppregulert med 5-Aza-CDR (figur 3B) .
A. Genekspresjon log2 forskjell er plottet på x-aksen og den -log10 (p-verdi) er plottet på y-aksen. Sonder som er identifisert som signifikant forskjellig mellom to grupper er farget i rødt. B. Venn skjærer av antall gener som er oppregulert på den indikerte behandling. C. Expression status hentet fra ONCOMINE av 20 gener, hvis uttrykk ble synergi reaktivert i HL60 celler i perifert blod mononukleære og kronisk lymfatisk leukemi.
For å vurdere den funksjonelle betydningen av genene synergi oppregulert av kombi behandling vi kartlagt Oncomine ™ database (Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI). På studere genuttrykk for kronisk lymfatisk leukemi prøvene sammenlignet med normale perifere mononukleære blodprøver, la vi merke til at mange gener i disse kategoriene ble nedregulert i leukemi i forhold til de normale cellene (Figur 3C), noe som tyder på at disse genene er potensielle kreftdempere i leukemi. Samlet våre data viser at endringer i genuttrykk er knyttet til endringer i celleveksthemming og at kombinatorisk behandling har mer en mer dyptgripende innvirkning på å hemme cellevekst sammenlignet med behandling med enkle midler, resultater som er i tråd med våre globale uttrykk studier . I tillegg, kombinatorisk behandling frembringer en synergistisk effekt i opp-regulering av gen-ekspresjon i både T24 og HL60-celler. Videre er mange av disse gener har potensiell betydning for immunterapi, slik som kreft testikler antigen-gener, og gener i interferon veien, noe som tyder på muligheten av å kombinere epigenetisk terapi og immunterapi i behandling av maligniteter. Spesielt, våre data indikerer også at endringer i genekspresjon er forenlige med cellevekst inhibering; de kombinatoriske behandlinger up-regulerer vesentlig flere gener, som er potensielt svulst undertrykkende, noe som resulterer i størst betydning for cellevekst blant alle behandlinger.
Gene oppregulering indusert av kombi behandling skyldes endret histon modifikasjoner som ikke demetylering i T24 celler
for å undersøke om DNA demetylering var ansvarlig for oppregulering av flere gener ved kombinatorisk behandling, utført vi global DNA-metylering studier med Illumina infinium HumanMethylation450 plattformen, som omfatter mer enn 450.000 CpG sider dekker promoter regioner, 5’UTR, 3’UTR, gen kropp og første eksoner. Siden både T24 og HL60 viste synergistisk gen oppregulering på grunn av kombinasjonsbehandlingen, valgte vi T24 som representant cellelinjen for å undersøke årsaken til geninduksjon. DNA metylering nivået for hver avhørt CpG nettstedet er rapportert som en betaverdi, som strekker seg fra 0 (ikke metylert) til 1 (fullt denaturert). En tetthet tomt, som omfatter alle sondene på tabellen, ble generert vise de globale DNA metylering profiler for hver behandling (Figur 4A). Probene kan grovt deles inn i to grupper i kontroll basert på den bimodale fordelingen av beta-verdier: en hypomethylated gruppe (P-verdi 0,2) og en hypermethylated gruppe (P-verdi 0,8) (figur 4A). Styre- og Klorgylin behandlede celler oppviste svært lignende profiler metylering. Etter, 5-Aza-CDR behandling, ble den topp som representerer hypermethylated prober forskjøvet mot lavere betaverdier, som viser at 5-Aza-CDR induserer global demetylering. T24-celler eksponert for 5-Aza-CDR behandling viste en svært lik metylering profil som cellene eksponert for kombinatorisk behandling (figur 4A). Selv DNMT1 har blitt rapportert som en potensiell substrat for LSD1 [16], våre data viser at Klorgylin ikke induserer demetylering i T24 celler.
A. Tetthet tomter for hver behandling på tvers av alle 450.000 CpG nettsteder. X-aksen representerer beta-verdier i området fra 0 (ikke denaturert) til 1 (sterkt metylert). B. Heatmap av CpG sonder som tilhører gener som er synergi oppregulert ved kombinatorisk behandling. Graden av DNA-metylering for hver sonde i hver prøve er representert ved hjelp av fargeskalaen er vist i tegnforklaringen. C. ChIP resulterer av histonmodifikasjonene etter normalisering til innspill. Feilfelt representerer standardavvik fra 3 uavhengige eksperimenter.
Deretter undersøkte vi de metylering nivåer av gener som var signifikant oppregulert ved kombinatorisk behandling. En heatmap ble generert for å illustrere de metylering nivåer av prober, som er plassert innenfor promotorområdene (prober som befinner seg innenfor 1500 bp fra transkripsjonsstartsetet) av de signifikant endrede gener etter hver behandling (figur 4B). Kontroll- og Klorgylin behandlede celler viste svært like metylering profiler med noen sonder som enten vunnet eller tapt metylering etter Klorgylin behandling (delta betaverdi 0,2). Imidlertid gjorde kombi behandling ikke forårsake ytterligere demetylering av disse probene som ble hypermethylated opprinnelig. Sammenligning 5-Aza-CDR behandling med kombinatorisk behandling, 0 prober hadde en delta beta-verdi større enn 0,2, noe som bekrefter at det ikke var noen vesentlig forandring i metylering på grunn av kombinatorisk behandling (figur 4B). På en objektiv måte valgte vi to gener, IFI27 og PAGE2B, som ble synergi reaktivert av kombinatorisk behandling, for å studere endringer i DNA metylering etter hver behandling (figur S4 A og B). Begge genene har flere sonder på infinium plattformen. Arrangøren av IFI27 er unmethylated; på den annen side, er promotoren av PAGE2B metylert. Som dataene viser, er disse to genene viste lignende DNA-metylering nivåer etter enten kombinatorisk behandling eller 5-aza-CDR behandling. Tatt sammen, våre data viser at gener som er signifikant oppregulert ved kombinatorisk behandling mangler den tilsvarende demetyleringen endring sammenlignet med celler behandlet med 5-Aza-CDR alene, noe som antyder den aktiverer gener uavhengig av DNA-metylering forandringer i T24-celler.
for å utforske andre potensielle mekanisme for videre genet reaktivering indusert av kombinatorisk behandling, bestemte vi oss for å undersøke endringer i histone merker som kan være forbundet med de observerte uttrykk endringer. Vi først tilfeldig valgt 8 gener, uavhengig av metylering status i kontrollen, (CT45A4, GTSF1, TKTL1, PAGE2B, IFI6, IFI27, IFIT1 og HIST1H2BK) fra bassenget av 92 gener, som var signifikant oppregulert ved kombinatorisk behandling, og . validert våre uttrykk array-resultater ved RT-PCR på angitte dager (figur S5)
ved bekreftelse av tabellen resultater, valgte vi 6 av de 8 genene og undersøkt endringer i bestemte histone merkene: H3K4me1, H3K4me2 og H3K4me3 ved å utføre chip analyser på arrangører av disse genene. Både H3K4me1 og H3K4me2 har blitt rapportert som direkte underlag av LSD1 [9]. Blant de genene vi valgte, arrangører av tre av disse genene, CT45A4, GTSF1 og PAGE2B, er metylert i T-24 celler og resten er unmethylated. Sammenlignet med kontrollen ble det ikke anrikninger av H3K4me1 og H3K4me2, LSD1 mål, observert ved promoterene fra alle utvalgte gener ved Klorgylin behandling (figur 4C). Både behandling 5-Aza-CDR og kombinatorisk behandling indusert enrichments av H3K4me1 og H3K4me2 på arrangører av denaturert gener (Figur 4C). De berikelse nivåene var betydelig høyere på kombi behandling, noe som tyder Klorgylin kosttilskudd 5-Aza-CDR å etablere en aktiv kromatinstruktur på denaturert gener.
På arrangører av unmethylated gener, verken 5-Aza-CDR eller Klorgylin alene økt berikelse av aktive kromatin merkene; imidlertid kombi behandlingen videre indusert de enrichments av H3K4me2 og H3K4me1. Vi undersøkte også nivået av H3K4me3, som ikke er et direkte mål for LSD1, men er en aktiv histon mark, anriket på promotorer av unmethylated gener. Klorgylin indusert mest dramatisk anrikning av H3K4me3 for IFI27 sammenlignet med kontrollen. 5-Aza-CDR behandling og kombinatorisk behandling viste sammenlign enrichments av H3K4me3 for alle utvalgte gener, forsterkende at genet reaktive ble indusert av enrichments av H3K4me2 og H3K4me1, de to direkte mål for LSD1. I tillegg undersøkte vi de enrichments av H3K9 /14 acetylering fordi de tett korrelert med genuttrykk [34]. Vi har observert at Klorgylin behandling ikke forandre graden av acetylering som vist i kontrollen, i overensstemmelse med observerte ekspresjonsnivåer. 5-Aza-CDR indusert berikelse av acetylering og kombinatorisk behandling ytterligere økt berikelse nivå på arrangører av denaturert gener samt IFI27 (Figur 4C). Samlet våre resultater viser at i T-24 celler, induserer kombi behandlingen videre genet reaktive ikke gjennom DNA demetylering. Av interesse, det enrichments av H3K4me2 og H3K4me1 er de viktigste aktiverings endringer som resulterer i genet reaktivering.
Klorgylin induserer DNA demetylering i HCT116 cellene
Vi har utført genom-wide uttrykk analyse på dag 20 post behandling i HCT116-celler for å undersøke endringene i global genekspresjon etter hver behandling. Interessant, alle tre behandlinger: Klorgylin, 5-Aza-CDR og kombinatorisk behandling, fremkalt betydelig genet oppregulering samt nedregulering (figur S6). Det er en betydelig overlapping (348 transkripsjoner) blant alle tre behandlinger (figur 5A), noe som tyder på at alle behandlinger kan ansette lignende virkningsmekanismer i reaktivere forstummet gener. Dette kan også forklare mangelen på synergistisk respons i HCT116 cellene.
A. Venn skjærer av genene som er oppregulert på angitte behandling. B. Tetthet tomter for hver behandling på tvers av alle 450.000 CpG nettsteder. X-aksen representerer beta-verdier i området fra 0 (ikke denaturert) til 1 (sterkt metylert). C. Venn skjærer av sondene som er demetylerte av den angitte behandling. Overlappingen av to sirkler representerer de vanligste sonder som er metylert ved begge behandlingene.
Selv om Klorgylin ikke induserer DNA demetylering i T24 celler, vi undersøkt om den betydelige genet oppregulering observert på alle tre behandlinger i HCT116 ble tilskrevet DNA demetylering ved å gjennomføre global DNA metylering analyse på dag 20 etter behandling. Tettheten plottet viser at både 5-Aza-CDR behandling og kombinatorisk behandling indusert betydelig demetylering, viser lignende globale metylering profiler (figur 5B). I motsetning til T24 celler, Klorgylin induserte moderate DNA-demetylering i HCT116. På dag 20, ble 21,049 prober metylert ved Klorgylin behandling, mens 59,834 sonder forble demetylert etter 5-Aza-CDR behandling. Det er en betydelig overlapping mellom demetylerte prober mellom disse to behandlinger (figur 5C). Klorgylin demethylates primært ikke-CpG island regioner (figur S7A). Siden HCT116 cellene har høyere metylering nivåer i ikke-CpG island regioner enn i T24 celler (Figur S7b), kan dette gi en forklaring på sin effekt i HCT116. Det har blitt vist at DNMT1 er et substrat for LSD1 og LSD1 inhibitorer har potensial til å destabilisere DNMT1, noe som resulterer i global demetylering [16]. Vårt laboratorium har tidligere vist at DNMT1 er mer fremtredende i å opprettholde ikke-CpG island metylering [35], styrke vår hypotese om at Klorgylin induserer demetylering av destabiliserende DNMT1.
