Abstract
Mekaniske egenskaper til celler har blitt anerkjent som en biomarkør for cellulær cytoskeletal organisasjon. Som kjemiske behandlinger føre til celle cytoskeletal rearrangements, og dermed, modifikasjoner av cellulære mekaniske egenskaper, undersøke cellulære mekanisk eiendoms variasjoner gir innsiktsfull kunnskap til effekter av kjemiske behandlinger på kreftceller. I denne studien blir effekten av åtte forskjellige kreft narkotika på de mekaniske egenskapene til human prostata kreft celle (PC-3) undersøkt ved hjelp av en nylig utviklet kontroll-baserte nanoindentation måling (CNM) protokollen på atommikroskop (AFM). Den CNM protokollen seirer grensene for andre eksisterende metoder for å in-væske nanoindentation måling av levende celler på AFM, særlig for måling av mekaniske egenskaper av levende celler. Den Youngs modul av PC-3-celler behandlet med de åtte stoffene ble målt ved å variere kraftbelastningsgrader over tre størrelsesordener, og sammenlignet med verdiene for kontroll. Resultatene viste at Youngs modulus av PC-3-celler økte betydelig ved de åtte stoffene som ble testet, og ble mye mer uttalt som den kraft lasten hastigheten økes. Videre to forskjellige trender ble klart uttrykt, hvor under behandling av Disulfiram, paclitaxel, og MK-2206, eksponenten koeffisient av frekvens- modulus funksjon tilnærmet uendret, mens med Celebrex, BAY, Totamine, TPA, og Vaproic syre, den eksponentielle hastighet ble betydelig økt
Citation. Ren J, Huang H, Liu Y, Zheng X, Zou Q (2015) An Atomic Force Microscope Study avslørt to mekanismer i effekten av kreftmedisiner på Rate-Dependent Youngs modul av menneskelige prostata kreft celler. PLoS ONE 10 (5): e0126107. doi: 10,1371 /journal.pone.0126107
Academic Redaktør: Etienne Dague, Laas-CNRS, FRANCE
mottatt: 03.10.2014; Godkjent: 30 mars 2015; Publisert: 01.05.2015
Copyright: © 2015 Ren et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NSF KARRIERE pris stipend CMMI-1066055 (https://www.nsf.gov/awardsearch/showAward?AWD_ID=1066055) og IDBR stipend (DBI- 1353890) (https://www.nsf.gov/awards/award_visualization_noscript.jsp?org=CMMI®ion=US-NJ instId=0026294000).
Competing interesser: Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mekaniske egenskaper av levende celler er kjent for å være nært knyttet til cellenes vekst scenen og funksjonalitet.. Endringer i mekaniske egenskaper har blitt anerkjent som en indikator på patologiske endringer av celler [1-3] og dermed kan tjene som en biomarkør for cellulære fenotypiske hendelser, for eksempel de som er forbundet med celle adhesjon og cytoskeletal organisasjon [4-6]. Spesielt, som en respons på miljø- og /eller mekanisk tilstand variasjoner, gjennomgår celle cytoskjelettet dynamiske rearrangementer, som i retur, induserer endringer i den cellulære mekaniske egenskapene [7] lenger. Derfor studier av mekaniske egenskaper av celler bidrar til en bedre forståelse av cellenes respons på kjemiske behandlinger, inkludert medikamentell behandling av kreftceller. Det har blitt rapportert at sykdommer så som kreft forandre de mekaniske egenskaper av de celler [1, 8, 9], og omvendt, variasjoner av mekaniske egenskaper av kreftceller forårsaket av kreft medikamenter kan bli anvendt for å evaluere effekten av disse kjemikaliene [10 , 11]. Undersøkelser av mekaniske egenskaper av kreftceller kan videre bidra til å løse de fysiske mekanismene som er involvert i kreftutvikling, progresjon og metastasering. Derfor blir studie av mobilnettet mekaniske egenskaper en uunnværlig og viktig komponent i utviklingen av nye strategier for kreft forebygging og diagnostisering.
Atomic force mikroskop (AFM) har blitt et kraftig verktøy for å studere mekaniske egenskaper enkelt levende celle på grunn av sin unike evne til å søke kraft stimuli og deretter måle responsen på bestemte steder i en fysiologisk vennlig miljø med piconewton kraft og nanometer romlig oppløsning [8, 12]. Nærmere bestemt, AFM har vært benyttet for å undersøke utviklingen av celle mekaniske egenskaper forårsaket av celle abnormiteter (f.eks kreft) og kjemiske behandlinger på kreftceller [7, 8]. For eksempel er det blitt funnet at Youngs modulus av cancerøse humane epitelceller tendens til å være betydelig lavere enn normalt de [3], er Youngs modulus av brystkreftceller øker monotont med økningen av kraften som belastningshastigheten [8] og etter F-aktin-forstyrre behandling, den gjennomsnittlige elastisitetsmodul av fibroblastceller ble redusert utpreget [10]. Men disse studiene [3, 8, 10] har vært begrenset til måling av statisk cellulær mekaniske oppførsel i regioner med lav frekvens (med kraft belastning hastighet under 5 Hz) og liten styrke amplituder (under 2 nn). De dynamiske mekaniske oppførsel av kreftceller i høyere frekvensområdene, og effekten av kjemiske behandlinger på frekvensavhengig viskoelastisk oppførsel av kreftceller er stort sett ukjent. Som kjemiske behandlinger føre til dynamiske rearrangements av celle cytoskjelettet, og dermed, dynamiske utviklingen av mekaniske egenskaper av celler [7, 10], utviklingen av dynamiske mekaniske oppførsel av kreftceller gir viktig informasjon til kreft narkotika utvikling.
Studier av frekvensavhengige biomekaniske egenskapene til levende celler har vært begrenset av evnen til dagens AFM-mekanisk måleteknikk. Konkret oppstår grensen i stor grad skyldes den aktuelle metoden for å innrykk måling på AFM, ved å trekke cantilever nedbøyning fra cantilever basen forskyvning [8, 13]. Vesentlige feil og usikkerheter blir indusert i innskjæringen målt som probe akselerasjon (i forhold til den faste ende av braket festet til den piezoelektriske skanner) ignoreres og det første kontaktpunkt er i stor grad usikkert [8, 13-15]. Spesielt er sondeakselerasjonseffekten uttalt og øker vesentlig når målefrekvensen øker. Selv om den kraft-modulasjonsmetoden er blitt anvendt for å måle frekvensavhengig viskoelastisiteten til levende celler [16, 17], ved å forsterke en sinusformet svingning på lasten /losse kraft profil med konstant hastighet, blir sondeakselerasjonseffekten fullstendig ignorert, og store usikkerheter finnes i søkket målt i den relativt høye frekvens region [14, 18]. Videre er en slik fremgangsmåte videre begrenset av den ganske liten amplitude av den dynamiske kraften som påføres (titalls Peco newton) anvendt-, mens for å avhøre en rekke biologiske responser i cellen, eksitasjon kraft av mye større amplitude må brukes som mekaniske egenskapene til levende celler er amplitude avhengig [19, 20]. Endelig krever den kraft som modulasjonsmetoden den oscillerende kraft som må påføres gjentatte ganger på samme sted ved hver av de valgte målefrekvens i den målte frekvensområde. Imidlertid, for levende celler slik fremgangsmåte er uheldig, da den repeterende, samme sted kraft anstrengelse har en tendens til å deformere og med skade cellemembranen. Det ble også foreslått å undersøke mekaniske egenskaper til levende celle ved å kvantifisere den effektive stivhet ved hjelp av en magnetisk kraft moduleringsteknikk på AFM [15]. En slik fremgangsmåte er imidlertid ikke bare krever ekstra prøve /utstyr preparat (for eksempel bruk av en hjemme-bygget i aluminium holder med vakuumfett for å montere prøven), men også ikke kvantifisere celle stivhet (dvs. den Youngs modulus) direkte [15] -Quantification av Youngs modul krever nøyaktig måling av fordypningen. Siden kraft stimuli tilføres og tilsvarende innrykk generert fungere som henholdsvis inngang og utgang til cantilever sonde-prøve interaksjon modell, feil i innrykk målingen fører direkte til at i den mekaniske eiendom kvantifisert-uavhengig sonden-prøven samhandlingsmodell ansatt . Således er det viktig å måle nøyaktig skår i mekaniske studier av levende celle.
I denne studie ble effekten av anticancer kjemiske forbindelser på de dynamiske mekaniske egenskaper for human prostata cancer celle (PC-3) blir undersøkt ved hjelp av en nyutviklet kontroll basert nanoindentation måling (CNM) protokollen [14]. Åtte forskjellige stoffer, inkludert Disulfiram (DSF), paclitaxel (Taxol), Tomatine, BAY 11-7082 (BAY), vaproic syre (VPA), 12-tetradekanoylforbol-13-acetat (TPA), Celecoxib, og MK-2206 (MK) testes. Selv om studier har vist anticancer virkningene av disse legemidlene, f.eks proteasomhemmingen og apoptose prosess av brystkreftceller indusert ved DSF-et velkjent medikament for alkoholisme behandling [21], eksperimentelle undersøkelser av disse kjemiske forbindelser som anticancer legemidler er kontinuerlig , og mange spørsmål fortsatt er ubesvart. Derfor studerer de dynamiske mekaniske egenskapsforandringer av PC-3 celler behandlet med disse åtte stoffene kan gi innsiktsfulle svar på kreft aktivitetene til disse kjemiske forbindelser.
CNM protokollen [14] vinner grensene for eksisterende metoder for i-væske innrykk måling av myke prøvene på AFM. Ved CNM protokollen, er hakket på levende celle målt ved relativ
samme
eksitasjon kraft profil (dvs. samme cantilever nedbøyning) på både levende celle og en hard referanse, og deretter kvantifisert fra forskyvning forskjellen av braket faste ende på disse to prøver. Den største fordelen med den CNM-protokollen er det ved hjelp av en hard referanse og mer kritisk, nøyaktig sporing av den samme kraft profil på begge prøvene, blir den dominerende negativ effekt av braket akselerasjon fjernes fullstendig uten behov for parameter kalibrering [14, 18 ]. Dessuten er den hydrodynamiske kraftpåvirkning vesentlig redusert, særlig ved høye styrkebelastningsrater (f.eks, redusert med over 50% når den kraft som lasten er høyere enn 100 Hz). I denne studien ble den hastighetsavhengige Youngs modulus av PC-3-celler kvantifiseres ved hjelp av CNM-protokollen ved å variere den belastning /losse, beregnes etter eksitasjon kraft over tre størrelsesordener fra 0,2 Hz til 100 Hz, med den målte fordypningen amplitude over 2 ordrer større enn svinge amplitude i [16].
Materialer og metoder
Cellekultur kultur~~POS=HEADCOMP og behandling
PC-3 celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC , Rockville, MD, USA), og dyrket i RPMI-1640 dyrkningsmedium inneholdende 10% FBS som var supplert med penicillin (100 enheter /ml) -streptomycin (100
μ
g /ml) og L-glutamin (300
μ
g /ml). Celler ble dyrket ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator og passert to ganger i uken. For å imøtekomme de AFM-målingene, ble PC-3-celler sådd med en tetthet på 2,0 x 10
4 celler /ml i 60 mm vevskulturskåler (5 ml /skål) og inkubert i 24 hpurs. Deretter ble cellene i hver tallerken ble deretter behandlet med oppløsningsmiddel DMSO (2
μ
l /ml) eller med hver av de åtte stoffene oppløst i DMSO i 24 timer før AFM-målingene.
MTT analyse~~POS=TRUNC
PC-3-celler ble sådd ut ved en tetthet på 2,0 x 10
4 celler /ml medium i 96-brønners plater (0,2 ml /brønn) og inkubert i 24 timer. Cellene ble deretter behandlet med de forskjellige anticancermidler i 72 timer. Etter behandling 200
μ
l 3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyl tetrazoliumbromide (5 mg /ml i PBS) ble tilsatt til hver brønn av platen og inkubert i 2 timer. Etter nøye fjerning av medium, ble 0,1 ml DMSO tilsatt til hver brønn. Absorbansen ble spilt inn på en mikroplateleser ved 540 nm. Effekten av forskjellige anticancermidler på cellelevedyktigheten ble bestemt som levedyktighet prosent i forhold til DMSO-behandlede celler
Immunofluorescence
Immunofluorescence farging ble anvendt for å bestemme
β
. – aktin i PC-3 celler. Kort sagt ble PC-3-celler sådd med en tetthet på 2,0 x 10
4 celler /ml medium i 60 mm kulturskåler og inkubert i 24 timer. Cellene ble deretter behandlet med MK eller Celebrex i 24 timer. Deretter ble cellene fiksert i aceton /metanol (1: 1) i 10 minutter ved romtemperatur og deretter inkubert med
β
p-aktin-antistoff (SC-47778, Santa Cruz Biotech Inc, Dallas, TX) over natten ved 4 ° C. Neste ble cellene vasket og inkubert med Texas Red-konjugert geit-antimus-antistoff (115-075-003, Jackson Lab ImmunoRsearch Inc, West Grove, PA) i 60 minutter ved romtemperatur. Immunfluorescens farging ble undersøkt ved hjelp av en fluorescens mikroskop (Nikon Eclipse TE200, Nikon Inc.).
Kjemi
RPMI-1640 vevsdyrkingsmedium, penicillin-streptomycin, L-glutamin og føtalt bovint serum (FBS) ble kjøpt fra Gibco (Grand Island, New York). Blant de åtte forskjellige medikamenter testet i denne studien, Disulfiram (DSF), paclitaxel (Taxol), tomatine, BAY 11-7082 (BAY), vaproic syre (VPA), og 12-tetradekanoylforbol-13-acetat (TPA) var kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), og Celecoxib og MK-2206 (MK) ble levert av National Cancer Institute Repository.
Kontroll-basert Elastisitet Målinger
det nylig -developed CNM-protokollen [14, 18, 22] ble anvendt for å måle den hastighetsavhengige Youngs modulus og frekvensavhengig kompleks modul på EA.hy926 celler. Det sentrale er å måle innrykk i levende celle nøyaktig, spesielt i høy hastighet og /eller bredbånd Nanomechanical målinger. Basert på analyse av cantilever dynamikk under nanoindentation måling, henter CNM protokollen innrykk i levende celle, Δ
z product: (
t
), som forskjellen på forskyvning av cantilever base (dvs. den faste enden av cantilever) på cellen,
z
bs product: (
t
), og som på en hard referanseprøve (for eksempel en silisium prøve),
z
bh product: (
t
) [14], (1)
ovenfor innrykk kvantifisering krever at
samme
eksitasjon kraft profil (dvs. samme cantilever nedbøyning bane) spores nøyaktig på begge prøvene. Leserne blir henvist til Ref. [16] for detaljer om CNM-protokollen.
For å sikre nøyaktig sporing av den samme eksitasjon kraft profil både på den levende celle og det harde referanse, benytter CNM-protokollen iterative læring kontrollteknikker, for eksempel, modellering -fri inversjon basert iterativ lærings kontroll (MIIC) teknikk [23]. Spesielt styreinngangen brukes til å drive AFM
z
-aksen piezo aktuator oppnås gjennom iterasjon som følger: (2) hvor «
jco
«betegner Fourier transform.
d
d plakater (⋅) er ønsket cantilever nedbøyning,
α
er en konstant, og
u
k product: (⋅) og
d
k plakater (⋅) er den nåværende inngangsspenningen til AFM piezo aktuator og cantilever nedbøyning i
k
th
køyring, henholdsvis. Styreinngangen
u
k plakater (
t
) blir oppnådd ved å ta Fourier-transformasjonen av inngangs- og utgangssignalene og påføre MIIC algoritmen Eq 2, og deretter den inverse Fourier-transformasjonen etterpå. Den MIIC algoritmen har også blitt benyttet for å oppnå raske bredbånd nanomechanical måling på polymerer i luften nylig [24, 25].
Atomic force mikroskop
Youngs modulus av PC-3 celler ble målt i cellekulturmedium med en dimensjon ikon AFM (Bruker, Santa Barbara, CA) utstyrt med en fluidcelle. En myk cantilever (MLCT-C, Bruker, USA) med nominell fjærkonstant 0,01 N /m ble valgt for målingene. Sonden radius på 28 nm og cantilever fjærkonstant 0,012 N /m ble kalibrert, henholdsvis med CCD-en tip-radius kalibrering prøve (PA-01, Mikromasch, NanoAndMore USA Corp.) og den termiske tuning prosessen. En silisiumprøve ble valgt som den harde referanseprøve. Både celler og bommene ble termisk likevekt ved ~ 37 ° C i 40-60 minutter før alle målinger for å minimalisere de utkragende fonner. Alle kontroll- og sensorsignalene til /og fra AFM-systemet ble kjøpt gjennom et datainnsamlingssystem (NI PCI-6259, National Instruments Corporation, Austin, TX) under Matlab XPC-mål (De MathWorks, Natick, MA) miljø .
A trekant drivspenning med en konstant belastning og losse hastighet (som anvendes ved vanlig kraft-kurve avstand måling) ble påført på
z -aksen
piezo-aktuator av AFM-systemet, og følgende ni lasterater over tre størrelsesordener ble brukt: 0,2 Hz, 0,5 Hz, 1 Hz, 5 Hz, 10 Hz, 20 Hz, 50 Hz og 100 Hz. Amplituden av stasjonen spenningen ble holdt den samme for alle de ovennevnte last priser, noe som resulterer i samme cantilever basen forskyvning på 250 nm (som for de ovennevnte last priser, dynamikken av verken
z
-aksen piezoelektrisk aktuator eller cantilever ligaen mekanismen ble begeistret [18]). For å minimere cellemembranen skade, ble trekanten stasjonen søkt om bare én periode når kraften belastningen var lavere enn 50 Hz og to perioder på høyere belastning priser. Driv inngangene ble påført suksessivt fra lav til høy belastning priser, adskilt med en oppholdstid på 3 min mellom hver sats-til å tillate cellen å fullstendig gjenvinne fra de foregående kraft stimuli. For hver last rate, eksitasjon kraften som utøves (dvs. cantilever nedbøyning) ble på levende celle måles og regnes som ønsket eksitasjon makt profil, og MIIC algoritmen ble anvendt i kraft-avstand kurve måling på referanseprøve for å sikre presisjon sporing av den ønskede styrke profilen (RMS relativ volatilitet ble opprettholdt under 1,5%).
for å studere effekten av hvert legemiddel på Youngs modul av PC-3 celler, målingene ble utført på den tilsvarende kontrollen først da på de behandlede celler. For hvert medikament, ble disse målingene gjentas på fem forskjellige celler for både kontroll og stoffet behandles de.
Ranger avhengig Elastiske Modulus Kvantifisering
Ved hver kraft belastning rente, Youngs modulus av cellen ble kvantifisert ved hjelp av sfæriske Hertzian kontakt modell sammen med den målte sonde-prøve interaksjon kraft og innrykk [12], (3) hvor
R
er radien sonden, og
E
og
ν
er Youngs modulus og Poisson forholdet mellom levende celle (
ν
= 0,5 [7, 12]), henholdsvis. Sonden-sample interaksjon kraft er kvantifisert som
F
z
=
k
c
d
s plakater (med cantilever fjærkonstant (
k
c
)) [12]. Vi merker oss at andre Hertizan innrykk kontakt modell som den koniske modell [12] kan brukes. Den sfæriske kontakt modell som velges som i dette arbeidet innrykks dypet genererte ikke var vesentlig større (over 10 ganger) enn men har en tendens til å være sammenlignbart med radius sonde [26, 27].
Diskusjon
Resultater og br >
kraften (dvs. cantilever nedbøyning) tidsprofil på lastprisene på 0,2 Hz og 50 Hz på TPA behandlet PC-3 celler ved høy dosering (20
μ
M) er vist i figur 1 , som et eksempel-force-time plott av lav dosering og /eller andre rusmidler viste lignende trend. De tvangsinnrykks kurver målt fra samme behandling på alle ni last priser er vist i figur 2 for alle de ni lastprisene (kraft-skår kurver for andre målinger ikke er vist å spare sapce). Den Youngs modul av kontrollen (dvs. ubehandlet) og de legemiddelbehandlede PC-3-celler blir sammenlignet i figurene 3-5 for de åtte testede stoffene, henholdsvis, hvor elastisitetsmodul sammenlignet med den kraft som belastningen satsen er plottet i logaritmisk skala, og kurvetilpasning av data til følgende kraft loven er også vist, (4) der
E
0 er kraften loven konstant elastisitet skala faktor på celler, og
α
er det power law eksponenten som fanger viskositeten av cellemembranen [13, 28]. Videre
E
0 og
α
av montert Youngs modulus vs frekvens kurve er også sammenlignet i figur 6 for de åtte narkotika testet for kontroll og behandlet PC-3 celler under både lave og høye doser.
de resultatene fra eksperimentet viste at de viskoelastiske atferd av PC-3 celler var godt fanges opp i dette arbeidet. Som vist i figur 1 (b), ble sonden akselerasjon effekt på kraft innrykk bane uttalt og trengte å bli regnskapsført i innrykk kvantifisering, og for samme drevet amplitude, innrykk generert redusert monotont med økning av styrken belastningsfrekvens (se figur 2), noe som reflekterer viskoelastisiteten arten av cellemembranen [8, 12]. Innrykk generert på PC-3 celler varierte fra 80 nm til 230 nm blant alle de åtte testede stoffer (for alle de testede doser). Som
z -aksen
drevet drevet amplitude ble holdt det samme ved 250 nm, for eksempel en variasjon av fordypningen nøyaktig reflekterte viskoelastisiteten av cellene og legemiddeleffekter på det, henholdsvis.
den målte Youngs modul i forhold til frekvens forhold fulgt, ganske godt, kraftlovindeksen-allment observerte universell viskoelastisk oppførsel av levende humane celler [13, 28, 29]. Variasjonene av elastisiteten skaleringsfaktor
E
0 og kraften loven eksponent
α
var liten blant alle kontrollene-med standardavvik på 5,8% og 4,2%, henholdsvis ( se figur 6), henholdsvis. En så liten variant av
E
0 og
α
derfor kan serveres som grunnlinjen for å undersøke effekten av de ni testede narkotika på de mekaniske egenskapene til PC- 3 celler. Videre er området for styrkelov eksponent
α
stemmer godt overens med det rapporterte området (0,1-0,3) for levende celler i litteraturen [29].
Som vist i figurene 3-5, alle de legemiddelbehandlede celler presentert en mye høyere Youngs modul, og jo høyere medikamentdosen var, jo større økningen av Youngs modulus var. Som Youngs modul endring i celler er direkte relatert til ombygging av cytoskeletal struktur [4, 5, 10], kan en mulig forklaring av modulen økningen være aggregering av aktin filamenter under legemiddeleffekter siden det har blitt vist at aggregering av . aktin filamenter resulterer i en klar økning i den gjennomsnittlige Youngs modulus av celler [10]
en rask sammenligning av figurene 3-5 avdekket to store trender kan eksistere i de åtte test narkotika effekter på Youngs modulus: Under effekten av DSF, ble MK, og Taxol, Youngs modulus av PC-3 celler økes uten vesentlige endringer i frekvens-avhengighet, dvs. elastisiteten skaleringsfaktor
E
0 økt betydelig (med 55% til 78%), mens strømmen loven eksponent
α
tilnærmet uendret (se ligning 4) -for disse stoffene variasjonen av
α
var bare ca 6% til 14%. Mens under påvirkning av Celebrex, BAY, Totamine, TPA, og VPA, den frekvensavhengigheten av den forhøyede elastisitetsmodul vesentlig endret, dvs.
E
0 økt med 78% til 260%, mens
α
også økt med 22% til 75% (se figur 6)
DSF, MK og Taxol. Forhøyede Youngs modul uten vesentlig endring av frekvens-avhengighet
for DSF, MK, og Taxol, prosenter av Youngs modulus mellom de behandlede PC-3 celler og kontrollen ble nesten det samme korset alle ni målte frekvenser ved hver behandling dosering (vist som økningen av
E
0, se figur 3). Dette innebærer at viskositeten av de behandlede celler ikke ble vesentlig endret sammenlignet med kontroll seg som verdien av
α
endret seg ikke vesentlig. Det kan konkluderes med at under behandlingen av DSF, MK og Taxol kan cellen cytoskjelettet nettverket rekonstruksjon føre til en samlet avstivning av membranproteinstruktur (f.eks filament forkorting og fortykning), men kan ikke forårsake mye forandring av graden av polymerisering av aktin filamenter inne i cellene-den generelle årsaken til viskositet endring [30, 31].
Selv om MK, Taxol og DSF kan ha forskjellige molekylære mål og virkningsmekanismer, tilsvarende utviklingen av celle Youngs modulus endring kan forklare likheten av disse tre stoffene «effekter i cellen mekanisk oppførsel. MK kan inaktivere ezrin som fungerer som bindeledd mellom plasmamembranen og cytoskjelettet [32]. Taxol forstyrrer normal nedbrytning av mikrotubuli [33], og DSF hemmer tubulinpolymerisering [34]. Det er rimelig å postulere at konflikt med forbindelsesledd mellom plasmamembranen og cytoskjelettet, forstyrrer mikrotubuli sammenbrudd og hemme tubulinpolymerisering kan føre til celle stivne uten endring av viskositet.
Men Youngs modulus økning på MK og Taxol behandlet cellene var mer signifikant (til og med for en lav dose av 2
μ
M) enn den for DSF behandlede celler (ved samme dose). En mulig forklaring kan være den jernchelaterende effekten av DSF. Tidligere studie viste at DSF tilrettelagt intracellulært Cu opptak [35]. Det ble funnet at MK og Taxol sterkt inhibert aktivering av Akt [36, 37] mens DSF ikke hadde noen hemmende virkning på aktivering av dette protein [38]. Inaktivering av Akt kan bidra til sterkere effekt av MK og Taxol i forhold til DSF. Påvirkningen av DSF på jern homeostase kan være en annen mulig forklaring på den svakere effekt av DSF (på økningen i Youngs modulus) enn MK og Taxol.
Forhøyet Youngs modul Akkompagnert av Dramatisk Frekvens-avhengighet Endre
annerledes fra de ovennevnte tre medikamenter, de fem andre legemidler (Celebrex, BAY, Totamine, TPA, og VPA) tendens til å påvirke ikke bare elastisk, men også den viskøse oppførselen til PC-3 celler som både elastisitet skala faktor,
E
0 og kraften loven eksponent,
α
, ble økt betydelig. Dette fenomenet indikerer at celle cytoskjelettet endringer som følge av behandlingen av disse fem stoffene består ikke bare cytoskjelettet avstivning, men også skifte av graden av polymerisering, som kan innebære en øket konsentrasjon av aktin monomerer og en reorganisering av actin filamenter. Videre skal det bemerkes at standardavviket for den Youngs modulus av PC-3-celler behandlet med disse fem stoffer er større enn for de som ble behandlet med de tre andre legemidler (DSF, Taxol og MK). Ettersom standardavviket til Youngs modul for alle kontroll forblir mye mindre for alle de åtte narkotika, en mulig forklaring for den større avviket er at den dynamiske mekaniske oppførsel av cellene behandlet med de fem legemidler (Celebrex, BAY, Totamine, TPA, og VPA) var mer aktiv.
Det var kjent at celebrex, TPA og valproinsyre indusert celledifferensiering [39-41]. Som undersøkelser har vist at celledifferensiering fører til en økning av celle stivhet [26], økning i stivhet og viskositet av PC-3-celler behandlet med celebrex, kan TPA og valproinsyre være relatert til differensiering av cellene. Selv BAY11-7082 og Tomatine ikke har vist seg å indusere differensiering i epitelceller, disse stoffene hemme aktivering av NF-
κ
B [42], og hemming av NF-
κ
B i noen celler resulterte i en mer differensiert fenotype [43]. Således kan effekten av BAY11-7082 og Tomatine på stivhet og viskositet av PC-3-celler i forhold til deres inhiberende virkning på aktivering av NF-KB
κ
B.
Blant måleresultatene, endringen av Youngs modulus var mest betydningsfulle på Celebrex behandlede celler. Siden Celebrex fører til tap av filopodia og lamellipodia i cellene, og endringer i aktin nettverk [44], disse aktivitetene i tillegg til differensieringsinduserende effekter kan føre til en sterkere effekt på økt stivhet og viskositet av PC-3 i forhold til de andre fire medikamenter.
Vi utførte ytterligere MTT test for å undersøke sammenhengen mellom endringer av mekaniske egenskaper og hemming av cellevekst. Som vist ved de cellelevedyktighet testresultater fra MTT-analysen i figur 6, behandling av PC-3-celler med de åtte anticancermedikamenter redusert antall av levedyktige celler, særlig ved høy dosering, dvs. var effekten doseavhengig. En slik effekt av legemidler (på mink celleviabilitet) korrelert godt med deres effekt på å endre celle mekaniske egenskaper avdekket i de ovennevnte AFM tester, for alle åtte forskjellige medikamenter undersøkt. Selv om de ovennevnte AFM studier som klart viste de to distinkte mønstre blant de åtte ulike stoffer i å endre de mekaniske egenskapene til PC-3 celler (DSF, MK og Taxol som en gruppe, og Celebrex, Bay, Tomatine, TPA og Vaproic syre som den andre gruppe), MTT-analysen ble det ikke tydelig forskjell i celleviabilitet endringer mellom disse to gruppene. Dette resultatet tyder på at den foreslåtte AFM-studier kan ha avdekket nye trekk ved biologisk respons av kreftceller til anticancermedikamentelle behandlinger, og dermed tilveiebringe mer informasjon enn den konvensjonelle MTT-analysen i responsene til PC-3-celler til anticancermedikamentbehandling. En mulig forklaring er at endringene i cytoskjelettet og cellemembran kan korrelere med evnen til kreftceller til å metastasere. Fremtidige studier med aktuelle kreftcelle metastase modell kan bidra til å utforske sammenhengen mellom endringer i mekaniske egenskaper og metastaserende evne til kreftceller.
For ytterligere å undersøke mekanismene bak de to mønstrene avslørt av AFM studier, immunfluorescens farging av
β
aktin ble gjennomført for å søke innsikt i de ulike svarene i PC-3 celler til medikamentell behandling. MK og Feire ble valgt til å representere den første og den andre gruppen av de åtte legemidler (som avslørt av AFM studier), henholdsvis. De fluorescens bilde oppnådde resultater er vist i figur 7. morfologi
β
p-aktin-immunofluorescens-farging var lik i celler behandlet med MK og de som ble behandlet med Celebrex. Dette resultatet tyder på at de forskjellige reaksjoner i PC-3-celler til de to gruppene av medikamenter kan omfatte mer kompliserte mekanismer i tillegg til modifisering av cellen aktin. Videre studier på modifisering av andre cytoskjelett komponenter er nødvendig for å fastslå mekanismene bak de to forskjellige typer respons på de to gruppene av narkotika testet.
Betydningen av de ovennevnte studiene er understreket av betydningen av identifisere nye mål for å hemme vekst og indusere apoptose i kreftceller, som har blitt et stort fokus på utvikling av ny generasjon av kreft narkotika. Fysiske egenskaper av kreftceller, slik som elastisitet og viskositet som er forbundet med modifikasjon av cytoskjelett og plasmamembranen kan representere en unik klasse av nye mål for utvikling av anticancer legemidler.
