Abstract
Nylige fremskritt i sekvenseringsteknologi har gjort det mulig helhetlig profilering av genetiske forandringer i kreft. Vi har etablert en målrettet sekvense plattform ved hjelp av neste generasjons sekvensering (NGS) teknologi for klinisk bruk, noe som kan gi mutasjoner og kopiantall variasjon data. NGS ble utført med parvise end bibliotek beriket med eksoner av 183 kreftrelaterte gener. Normale og tumorvev par av 60 kolorektal adenokarsinomer ble brukt til å teste gjennomførbarhet. Somatisk mutasjon og kopi nummer endring ble analysert. Totalt 526 somatiske ikke-synonyme sekvensvariasjoner ble funnet i 113 gener. Blant disse 278 enkelt nukleotidvariasjoner var 232 ulike somatiske punktmutasjoner. 216 SNV var 79 kjente enkeltnukleotidpolymorfi i dbSNP. 32 indels var 28 ulike Indel mutasjoner. Median antall muterte genet per svulsten var 4 (0-23). Kopitallet gevinst ( X2 fold) ble funnet i 65 gener i 40 pasienter, mens kopitall tap ( X0.5 fold) ble funnet i 103 gener i 39 pasienter. De hyppigst endret gener (mutasjon og /eller kopi nummer endring) var
APC
på 35 pasienter (58%),
TP53
i 34 (57%), og
KRAS
i 24 (40%). Altered genet liste avslørte ErbB-signalreaksjonsveien som den hyppigst involverte reaksjonsveien (25 pasienter, 42%). Målrettet sekvense plattformen ved hjelp av NGS-teknologi er mulig for klinisk bruk og gir omfattende genetisk endring data
Citation:. Han S-W, Kim H-P, Shin J-Y, Jeong E-G, Lee W-C, Lee K-H, et al. (2013) Målrettet Sekvensering av kreft-relaterte gener i tykktarmskreft ved hjelp av Next-Generation Sequencing. PLoS ONE 8 (5): e64271. doi: 10,1371 /journal.pone.0064271
Redaktør: Noam Shomron, Tel Aviv University, Israel
mottatt: 18 februar 2013, Godkjent: 10 april 2013; Publisert: 21. mai, 2013
Copyright: © 2013 Han et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av en bevilgning fra den koreanske Healthcare Technology R D prosjekt, departementet for helse, velferd Familiedepartementet, Republikken Korea (A091081). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne ønsker å erklære at Jong-Yeon Shin og Jong-Il Kim er konsulenter for Psoma Therapeutics og Jeong-Sun Seo er konsulent for Macrogen. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Flere genetiske hendelser akkumuleres under utviklingen av kolorektal kreftutvikling [1]. Det finnes en rekke molekylære undergrupper av tykktarmskreft inkludert mikro ustabilitet og kromosom ustabilitet [2], [3]. Imidlertid har subtypene begrenset prediktiv eller prognostisk verdi og ikke påvirke behandlingen avgjørelse i metastatisk setting. I kontrast,
KRAS
mutasjon er den viktigste og mest brukte molekylære test i metastatisk kolorektalcancer. Mutasjonsstatus av
KRAS-støtteveiledninger behandling avgjørelse fordi tilstedeværelse av mutasjonen kan forutsi manglende utbytte av
EGFR
-targeted antistoffer [4].
Storskala sekvense analyser utnytte konvensjonelle sekvenseringsmetoder har gitt genetisk landskapet av tykktarmskreft som viser at det er noen gen «fjell» mutert i store deler av svulster og mange «hills» mutert sjelden [5], [6]. I tillegg genome-wide kopi nummer analyse viste at tykktarmskreft har færre kopiantall endringer sammenlignet med brystkreft [7]. Nylige fremskritt i teknologien ved hjelp av sekvenserings neste generasjons sekvensering (NGS) har muliggjort analyse av hele genomet i enkelte krefttyper og identifisering av nye genetiske endringer [8], [9]. I studier av kolorektal kreft, er nye vendende genetiske fusjoner har blitt identifisert [10], [11]. Men store brist av hele genomet eller exome sekvense tilnærming er identifisering av mange funksjonelt uklare, uvanlig, mulige «passasjer» mutasjoner med ukjent klinisk betydning. Videre har forholdsvis lav dekning av storskala tilnærmingen har begrensning i sensitivitet og spesifisitet, noe som er en viktig sak for anvendelse i klinisk sammenheng. Genetiske endringer som er identifisert ved lav dekning analyse må bekreftelse å bli brukt i klinisk beslutningstaking.
Målrettet sekvensering kan være et bedre alternativ for klinisk anvendelse av NGS-teknologi. Fordelen av målrettet tilnærming er økt dekning dybde i forhold til hele exome tilnærming ved å redusere antall gener analysert med tilsvarende antall basepar sekvensert. Dette muliggjør generering av pålitelige data med tilstrekkelig sekvense dybde i målrettede gener av interesse.
Vi har etablert en målrettet sekvense plattform ved hjelp av NGS-teknologi, som inkluderer 183 gener og gir mutasjon og kopiere antall variasjons data. Hensikten med denne studien var å teste muligheten for målrettet sekvense plattform for fremtidig klinisk program som bruker kolorektale svulstvevet.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Studiet protokollen ble gjennomgått og godkjent av Institutional Review Board of Seoul National University Hospital (SNUH). Alle pasienter ga skriftlig informert samtykke for vev bank og genetisk testing før operasjonen. Denne studien ble utført i samsvar med anbefalingene fra Helsinkideklarasjonen for biomedisinsk forskning som omfatter mennesker.
Study oversikt
Det er totalt 183 gener (Tabell S1) ble valgt med følgende kriterier : kjent for å forutsi respons, terapeutisk målrettes, involvert i store signalveier, og høy mutasjonsfrekvensen i Katalog av somatiske mutasjoner i kreft database (COSMIC). Dypfryst primærtumor og tilstøtende prøvene normale vev ble kjøpt fra SNUH Tumor Bank. Prøvene ble deidentified og klinisk-patologisk informasjon ble gitt av Tumor Bank. DNA ekstrahert fra vevet ble sendt til Genome Medicine Institute, Seoul National University. ble rapportert sekvense resultater innen 3 uker (Figur S1).
Target berikelse av genomisk DNA og sekvense
Genomisk DNA ble ekstrahert fra de parvise prøver ved hjelp av QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Tre mikrogram DNA ble oppdelt ved å bruke en Covaris S2 (Covaris, Inc., Massachusetts, USA) for å ~250 nt med 20% driftssyklus, nivå 5 intensitet og 200 sykluser per burst for 180 s. Bar-kodet fragmentsekvense bibliotekene ble gjort ved hjelp av en parvise end DNA prøveopparbeidelse kit (Illumina, California, USA) og Illumina multipleksing adapter (Illumina) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter ligering med Illumina adapter, bibliotekene ble fremstilt ved hjelp AMPure perle (Beckman Coulter, Inc., California, USA) snarere enn gel rensing. Bibliotek Kvaliteten ble vurdert ved hjelp av en Agilent 2100 Analyser og DNA 1000 chips (Agilent Technology, California, USA). Å designe RNA agn for fangst, vi utnyttet COSMIC (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic) og Agilent Technologies eArray hotellet (https://earray.chem.agilent.com/earray /). De målrettede regionene inkludert alle eksoner av 183 gener som er involvert i en rekke kreftformer og total lengde som er tatt var ~ 1 M. agn var 120 bp langt, og den gjennomsnittlige agn dekning av hver base i målområdet var 2X. Vi har unngått standard gjenta maskerte områder, men tillot hver agn for å overlappe med et repeterende region opptil 20 bp. Vi identifiserte også sekvenser innenfor repetitive regioner som var tilstrekkelig unik for å tjene som rimelig agn. En ekvimolar åtte-Plex bassenget ble produsert for berikelse ved hjelp av en atVelg Target Enrichment System Kit (Agilent Technology) og en modifisert protokoll. Fem hundre nanogram samlet DNA med 5 ul (100 ng) av tilpassede agn ble brukt til berikelse, med blokkering oligonukleotider spesifikke for parvise end sekvense biblioteker og 24-h hybridisering. Biotinylerte RNA bibliotek hybrider ble utvunnet med streptavidin perler. Den fanget bibliotekene ble forsterket og sekvensert på Illumina Genome Analyser IIx av 2 × 69 sykluser. Vi justert den resulterende kort sekvens leser til referanse genomet (NCBI menneskelige genom montering bygge 37) ved hjelp av Genomisk Kort lese nukleotid Alignment Program (GSNAP) justering program [12], med fradrag for 5% uoverensstemmelser etter regnskap for PCR duplikater og leser som ikke justere til fanget regioner av referansen genom. De sekvense data lastes opp til EBI europeiske nukleotid Archive (https://www.ebi.ac.uk/ena/home) under tiltredelse antall ERP002442.
Enkelt nucleotide variant (SNV) og Indel deteksjon
Vi ringte genomiske varianter av hver prøve (SNVs og korte indels) ved hjelp av modifiserte kriterier fra våre tidligere publikasjoner i hel-genomsekvensering [13], [14]. Kort fortalt ble SNVs og indels definert basert på tilfredsstillelse av følgende tre forhold: (1) antall entydig kartlagt leser på stillingen bør være to eller flere; (2) den gjennomsnittlige basen kvalitet (
Phred
Q score) til stillingen bør være 20; og (3) den lese-allelet frekvens ved posisjonen skal være 20%. For påvisning av de somatiske mutasjoner (SNVs og indels) i kreftvevet, brukte vi følgende vilkår: (1) nonsynonymous SNVs eller indels i kreftvevet; (2) SNV allel teller bør være null i målrettet sekvens av normalt vev; (3) villtype-allelet teller bør være 10 eller mer i målrettet sekvens av normalt vev; og (4) kandidatposisjonene bør ikke være polymorfismer i henhold til dbSNP132. De funksjonelle konsekvensene av de nye missense varianter ble beregnet med sortering Intolerant fra Tolerant (SIFT) [15]. Mutasjon i
KRAS
ble bekreftet ved hjelp av Sanger-sekvensering. Følgende primere ble benyttet: codon12 og 13, frem til 5′-CGTCTGCAGTCAACTGGAAT-3 «og 5′-revers GAGAGTGAACATCATGGACC-3′; kodon 61, frem til 5»-CAGACTGTGTTCTCCCTTCTCA-3 «og 5′-revers CTCATGTACTGGTCCCTCATTG-3′; og kodon 146, frem til 5»-TGGACAGGTTTTGAAAGATATTTG-3 «og 5′-revers ATTAAGAAGCAATGCCCTCTCAAG-3». Alle sekvenseringsreaksjoner ble gjort i både fremover og bakover, og alle mutasjoner ble bekreftet minst to ganger fra uavhengige PCR isolerer.
Kopier nummer endring
Vi beregnet dekning av gener ved hjelp av sekvensering leser kartlagt til målrettede regioner. For å detektere kopitall forandring for et gitt par av kreft og normale vev, dekning bretteforhold (svulst /normal) til 183 målgener ble beregnet. Etter at normaliseringstrinnet vurderer totalt Les baser oppnådd fra hvert vev, ble deknings fold forholdet justeres ved å beregnet tumorcelle renhet beskrevet nedenfor. Vi definerte som et gen viser kopiere nummer gevinst når dekningen sin fold ratio ≥2.0 og tap når ≤0.5.
For å estimere svulst renhet, brukte vi leser tellinger av somatiske SNVs identifisert. Gitt somatiske SNVs for hver kreftvev, antok vi at kreften består av en stor klone og SNVs er hentet fra klone. Videre anses vi SNVs som heterozygoter som allel frekvensen er 0,5. Med disse antagelser, ble tumor renhet estimeres som følger. De forventede antall av vill-type leser stammer fra klon kreft og normale celler ble beregnet. Da andelen av villtype plus SNP lese teller for kreft blant det totale antall lese tellinger ble ansett som den tilsvarende tumor renhet. I 3 prøver som ikke hadde noen svulst bestemt SNV, ble medianverdien av 57 prøver som brukes i analysen av kopinummervariasjoner.
Kopier nummer endring ble bekreftet ved hjelp av kvantitativ real-time PCR med iCycler IQ deteksjonssystem ( bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) med SYBR grønn jeg (Molecular Probe, Eugene, Oregon) i tre eksemplarer reaksjoner. Primerne anvendt i PCR-reaksjonen var som følger:
ErbB2
, frem til 5′-TGCTGGAGGACGATGACATG-3 «og 5′-revers CTGGACAGAAGAAGCCCTGC-3»;
SRC
, frem 5’CGGTTACTGCTCAATGCAGA-3 «og omvendt 5′-CAAGAGCGCTCGTACCTTTC-3»;
TP53
, frem 5′-CCCTTCCCAGAAAACCTACC-3 «og omvendt 5’ACTGACCGTGCAAGTCACAG-3»;
PTEN
, frem 5’TGGCACTGTTGTTTCACAAG-3 «og omvendt 5’TGTTCCAATACATGGAAGGATG-3»;
BRCA1
, frem 5’GTTTGCCAGAAAACACCACA-3 «og omvendt 5′-TTTATGCAGCAGATGCAAGG -3»;
BRCA2
, frem 5′-TGCCTGGCCTGATACAATTA-3 «og omvendt 5’TTGCTGCTTCCTTTTCTTCC-3»; og
ACTB
, frem 5′- AGAGCTACGAGCTGCCTGAC og omvendt 5’GGATGCCACAGGACTCCA-3 «. Fluorescens
in situ
hybridisering (FISH) analyse av
ErbB2 Twitter /CEP17 ble utført ved hjelp av PathVysion kit (Vysis, Downers Grove, IL) i henhold til produsentens instruksjoner.
mikro status
Den mikro status for hver tumor ble bestemt ved å undersøke 5 mikro markører (D2S123, D5S346, D17S250, BAT25, og BAT26) som tidligere beskrevet [16]. Enten forover eller bakover primer for hver markør ble merket med fluorescens, og PCR-produkter ble elektroforese og analysert. Vi klassifisert MSI status som følger:. MSI-high, ustabilitet ved to eller flere mikro markører, MSI-lav, ustabilitet på en markør, og MSS, ingen ustabilitet markør
Pathway analyse
Pathway analysen ble utført for gener som har mutasjon eller kopiantall endring i hver svulst som bruker Database for kommentering, visualisering og integrert Discovery (DAVID) Bioinformatikk Resources versjon 6.7 benytte veien databaser BBID, Biocarta og Kyoto Encyclopedia of gener og genomer (KEGG) [17 ]. Funksjonell merknad diagram i DAVID ble opprettet ved hjelp av det menneskelige genom som bakgrunn, og terskler for teller som to og brukervennlighet scorer så 0,1.
Resultater
Pasient egenskaper og sekvense profil
pasientens egenskaper er som beskrevet i tabell 1. koblede prøvestykker av primær kolorektal tumor og tilstøtende normal slimhinne fjernes under drift ble anvendt for analyse.
Gjennomsnittlig dekning av de 120 prøvene analysert was175X (range 99X-435X) (tabell S2). Det var 181X (100X-435X) for svulst og 170X (99X-312X) for normal slimhinne. Tumorcelle prosentandel i tumorprøven kan beregnes ved å bruke tumorspesifikke SNVs i 57 prøver. Median Prosenten var 71% (range 42-100).
Mutasjoner
Det er totalt 532 somatiske nonsynonymous variasjoner i 113 gener ble funnet (figur 1). 494 single nucleotide variasjoner ble observert i 106 gener fra 60 pasienter og 38 Indel mutasjoner (11 innsettinger og 27 strykninger) på 19 gener fra 21 pasienter (Tabell S3)
SNV, single nucleotide variasjon.; SNP, enkeltnukleotidpolymorfi; NMD, non-sense mediert forfall.
Blant de 494 SNVs, 278 variasjoner var 232 ulike punktmutasjoner (67 tidligere rapporterte mutasjoner og 166 nye mutasjoner) og 216 ble tidligere rapportert 79 ulike polymorfismer i dbSNP .
Point mutasjoner består av 43 nonsense mutasjoner og 189 missense mutasjoner. Vi fant 2 tilbakevendende nye mutasjoner,
JAK1
c.1595C T (p.R532H) hos 2 pasienter og
EWSR1
c.1769A C (p.Q590P) i 2. Point mutasjoner ble hyppigst observert i
APC plakater (32 mutasjoner i 29 pasienter), etterfulgt av
TP53 product: (27 i 27),
KRAS product: (24 i 24),
TTN product: (36 i 21), og
FBXW7 product: (15 i 14) (tabell 2).
32 Indel mutasjoner ble 3 kjente mutasjoner og 25 nye mutasjoner , som var 2 enkle delesjoner av en aminosyre, 26 rammeskift mutasjoner. Blant de rammeskiftmutasjoner, er 14 forutsagt å resultere i tull mediert nedbrytning. 3 nye Indel mutasjoner ble recurrently observert:
ACVR2A
c.1303delA (p.K435fs) i tre,
TGFBR2
c.449_450delAA (p.E150fs) i to, og
BLM
c.1536delA (p.G512fs) i 2.
Median antall mutasjon og muterte genet per svulst var 4,5 (spredning 0-32) og 4,0 (0-23), henholdsvis. Oftest muterte gener var
APC
(35 pasienter),
TP53 product: (27), og
KRAS plakater (24). Vi utførte Sanger-sekvensering for validering av
KRAS
mutasjon og alle identifiserte mutasjoner av NGS ble bekreftet.
Kopier nummer endringer
Kopier nummer endring ble observert i 132 gener og 51 svulster (85%) (figur 2 og tabell S4). Kopier nummer gevinst ( X2 fold) ble funnet i 65 gener fra 40 svulster og kopiere antall tap ( X0.5 fold) i 103 gener fra 39 svulster. Blant de svulster som viser kopiantall endring, median antall gener som er involvert var 6 (range 1-44). Gener oftest viser kopiantall gevinst var
SRC product: (15 pasienter),
MAFB product: (15),
Top1 product: (14),
RECQL4 product: ( 13), og
Gnas plakater (13). Med unntak av
RECQL4
plassert på kromosom 8q24, de andre 4 gener ble plassert på 20Q 11-13. Gener som viser hyppig tap var
TP53 product: (13 pasienter),
SMAD2 product: (12),
SMAD4 product: (12),
MAP2K4 product: (11),
BCL2 product: (11),
WRN product: (10), og
DCC plakater (10).
TP53 Hotell og
MAP2K4
ble plassert på 17p12-13, mens
SMAD2
,
SMAD4
,
BCL2
, og
DCC
ble plassert på 18q21, og
WRN
ligger på 8p12. Kvantitativ RT-PCR ble brukt til validering av kopiantall endring av
SRC
,
ErbB2
,
TP53
,
PTEN Hotell og
BRCA2
i representative utvalg og viste sammenlignbare verdier.
ErbB2
ble ytterligere validert ved hjelp av FISH (figur 3).
Prøver er justert i henhold til prøveidentifikasjonsnummer i Y-aksen og gener er justert i henhold til kromosom plassering i X-aksen.
* Verdier er dekning fold forholdstall som ikke er justert for svulst renhet. Representant bilde av FISH analyse av
ErbB2 plakater (rød) og CEP17 (grønn) viser forsterkning av
ErbB2
.
Kombin genetiske endringer
kombinere mutasjon og kopiere talldata,
APC
var genet hyppigste genetiske endringer (35 pasienter). Tre pasienter hadde kopi antall tap av
APC
, men de 3 svulstene hadde også Indel mutasjoner. Ved
TP53
, 6 pasienter som samtidig hadde punktmutasjon og kopiere antall tap og 7 pasienter hadde kopiantall tap som eneste genetiske mekanismen for
TP53
inaktivering. Det var ingen kopi nummer endring i
KRAS
. Men kopiere antall gevinst på
HRAS
ble funnet i 6 pasienter.
MSI-H-tumorer tendens til å ha høyere antall gener med mutasjoner sammenlignet med MSS /MSI-L (gjennomsnitt 10,8
vs
3.9, henholdsvis;
p
= 0,11 ved t-test) og lavere antall gener med kopi nummer endring (gjennomsnittlig 3,2
vs
8.6, henholdsvis.
p
= 0,22 ved t-test). MSI-H-tumorer hadde høyere frekvens av genetiske endringer i
ACVR2A plakater (1,9% i MSS /MSI-L
vs.
50,0% i MSI-H,
p
= 0,002),
MLH1 plakater (3,7%
vs.
33,3%,
p
= 0,046),
MSH6 plakater (1,9%
vs.
33,3%,
p
= 0,024),
SPTAN1 product: (0%
vs.
33,3%,
p
= 0,008), og
TGFBR2 plakater (1,9%
vs.
33,3%,
p
= 0,024). I motsetning til genetiske endringer av
TP53 plakater (63.0%
vs.
0%,
p
= 0,005) ble oftere observert i MSS /MSI-L svulster.
Vi kan også identifisere genetiske endringer som kan ha potensielle terapeutiske implikasjoner (Tabell 3).
ErbB2
kopiere nummer gevinst ble identifisert hos 4 pasienter (range x2.0-X71.5) og
ErbB2
punktmutasjon hos 5 pasienter (en pasient hadde kopiantall gevinst og punktmutasjon). Genetiske endringer i
BRCA1 Hotell og
BRCA2
ble observert hos 4 pasienter:
BRCA1
tap (X0.49),
BRCA1
punktmutasjon,
BRCA2
tap (X0), og
BRCA2
sletting mutasjon i en pasient hver.
EGFR
kopiere nummer gevinst ble funnet hos 4 pasienter (range X2.0-8.2).
PIK3CA
punktmutasjon ble observert hos 4 pasienter og
PTEN
tap og punktmutasjon hos 4 pasienter (range X0-X0.49) og en pasient, henholdsvis.
pathway analyse
totalt 33 pasienter (55%) hadde mulig gevinst-of-funksjon endring i
RAS Twitter /
RAF
vei: 20 pasienter med
KRAS
mutasjon bare, tre med
KRAS
mutasjon og gevinst på
HRAS
, en med
KRAS
mutasjon og
BRAF
mutasjon, 3 med
NRAS
mutasjon, to med
HRAS
gevinst, to med
BRAF
mutasjon, en med
BRAF
mutasjon og
HRAS
gevinst, og en med
RAF1
gevinst.
Analysere liste over endrede gener (mutasjon og kopiere nummer endring) med David funksjonell merknadsverktøy, var relatert vei identifisert i 53 pasienter (tabell S5) . Median antall sti per pasient var 19 (intervall 3-70). Eksklusive sykdomsrelaterte pathways (f.eks kolorektal kreft), ErbB signalveien (KEGG hsa04012) var den hyppigst involvert pathway (25 pasienter, 42%).
Diskusjoner
I den kommende tidsalder av personlig medisin for behandling av kreft, er det viktig å ha nøyaktig genetisk informasjon for de enkelte kreft. Antall genetisk informasjon guider allerede behandling beslutninger i daglig praksis. Eksempler på behandling av solide svulster inkluderer
ErbB2 plakater (HER2) genamplifisering i bryst og magekreft,
EGFR
mutasjon i ikke-småcellet lungekreft, og
KRAS
mutasjon i kolorektal cancer [18], [19], [20], [21]. Personlig kreftbehandling foregår fra tidlig stadium av narkotika utvikling når det er et kjent mål [22]. Men mange av de målrettede midler under utvikling ikke har en prediktiv genetisk biomarkør. Grundig informasjon om genetisk status for pasienter inkludert i tidlig fase kliniske studier og analyser av samarbeid med responsen kan akselerere mål pasientidentifikasjon.
Vi har etablert en målrettet sekvense plattform ved hjelp av NGS-teknologi for å gi omfattende genetisk informasjon for den enkelte pasient. I den foreliggende undersøkelse, viser vi at NGS-baserte målrettet sekvense plattform er mulig for klinisk bruk. Selv om vi ikke bekrefte hver genetisk endring identifisert, validering eksperiment
KRAS
mutasjon og representant kopinummer endringer (figur 3) viser at resultatene av plattformen er pålitelig. I tillegg til profil over vanlig muterte gener og mønster av genkopitallet endring (gevinst av 8q og 20Q og tap av 8p, 17p og 18q) er i samsvar med tidligere kjennskap til genetiske endringer i tykk- og endetarmskreft [23].
Major fordel av NGS-baserte målrettet sekvense plattformen er at data vedrørende multiple gener og flere genetiske endringer (punktmutasjon, Indel mutasjon, og kopinummer endring) blir generert med et enkelt eksperiment. Sekvenseringsplattform som gir mutasjon og kopiantall endring av data krever mindre mengde av DNA eller vev og kostnader sammenlignet med testing av individ genetisk endring ved sekvensering, eller fisk som er vanlig brukt i nåværende daglig praksis. Videre kan overlegen følsomhet med Sanger-sekvensering oppnås ved å øke dekningen dybde, spesielt i tilfeller med lav svulst renhet.
I tillegg til
KRAS
mutasjon, mutasjon av andre gener i veien (
BRAF
,
NRAS
, og
PIK3CA
) har også negativ effekt på respons på cetuximab [24]. Det er sannsynlig at undersøke flere gener i veien kan også forbedre respons prediksjon i andre målrettede behandlinger. Målrettet sekvense plattformen er en ideell mulighet for å evaluere flere gener samtidig. I tillegg til
KRAS
mutasjon, genetiske endringer i
NRAS
,
HRAS
,
BRAF
, og
RAF1
ble funnet i kolorektal kreft prøver analysert i denne studien.
Finne uvanlig genetisk endring kan gi nye behandlingsalternativ for enkelte pasient. For eksempel pasienter med svulster har
ErbB2
kopiere nummer gevinst kan ha nytte av
ErbB2
-targeted agenter og svulster som har mutasjon eller tap av
BRCA1
eller
BRCA2
fra PARP-inhibitorer. Videre kan genetiske endringer eller involvert vei veilede utvalg av tidlig fase klinisk studie for pasienter å bli registrert. Pasienter med endring av
RAS /RAF
veien kan ha større sjanse til nytte ved å delta i en klinisk studie av inhibitorer rettet mot veien.
For å oppdage flere mutasjoner med forbedret sensitivitet, massespektrometri basert mutasjonsdeteksjon plattformen er i bruk [25]. Men bare begrenset antall forhåndsdefinerte mutasjoner bli oppdaget og kopi nummer endring ikke kan påvises med plattformen. Derfor målrettet sekvense plattformen ved hjelp av NGS er overlegen når det gjelder den genetiske informasjonen produsert og fleksibilitet utgjør gensettene for analyse. Nyere studier har også vist nytten av målrettet sekvense tilnærming eller NGS i klinisk setting [9], [26], [27].
Major begrensning med denne studien er at plattformen ikke er i stand til å oppdage fusjonsgener og bare friskt frosset vev ble benyttet for analyse. Påvisning av fusion gener kan bli aktivert ved tilsetting av lav dekning RNA sekvensering. Vi har endret eksperimentell prosedyre for å utnytte formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) vev og har fått tilsvarende følsomhet. Vi er for tiden studerer nytten av målrettet sekvense plattformen i en prospektiv måte i klinisk praksis. Studien benytter enten fersk eller FFPE vev og vi har endret genet listen for å bedre representere druggable trasé og økt dekning dybde ( X500).
I konklusjonen, målrettet sekvense plattformen ved hjelp av NGS teknologien var i stand til å gi omfattende genetiske endring av data i kolorektal kreftprøver og kan brukes i klinisk setting.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1. .
Study disposisjon
doi: 10,1371 /journal.pone.0064271.s001 plakater (TIF)
Tabell S1.
Gene liste
doi:. 10,1371 /journal.pone.0064271.s002 plakater (XLSX)
Tabell S2. .
Dekning informasjon
doi: 10,1371 /journal.pone.0064271.s003 plakater (XLSX)
tabell S3.
Genetiske endringer pr pasienter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0064271.s004 plakater (XLSX)
Tabell S4.
Kopier nummer endring
doi:. 10,1371 /journal.pone.0064271.s005 plakater (XLSX)
Tabell S5.
DAVID trasé
doi:. 10,1371 /journal.pone.0064271.s006 plakater (XLSX)
