Abstract
TMPRSS2-ERG genet fusjon er funnet i omtrent halvparten av all prostatakreft. Den funksjonelle og prognostisk betydning TMPRSS2-ERG er imidlertid ikke fullt ut forstått. Basert på en historisk vaktsom venter kohorten, ble en sammenheng mellom TMPRSS2-ERG, vurderes som positiv immunfarging, og kortere overlevelse av prostatakreftpasienter identifisert. Uttrykk av ERG var også assosiert med kliniske markører som avansert tumor stadium, høy Gleason score, tilstedeværelse av metastase og prognostisk tumorcellemarkører som høy Ki67, pEGFR og Pakt. Nye forbindelser mellom TMPRSS2-ERG og endringer i tumoren stroma, for eksempel, øket vaskulær tetthet, hyaluronan og PDGFRp og redusert Caveolin-1, alle kjent for å være assosiert med en aggressiv sykdom, ble funnet. Denne studien antyder at TMPRSS2-ERG fusjon genet er assosiert med en mer aggressiv prostatakreft fenotype, støttet av endringer i svulsten stroma
Citation. Hägglöf C, Hammarsten P, Strömvall K, Egevad L, Josefsson A, Stattin P, et al. (2014) TMPRSS2-ERG Expression Spår prostatakreft Survival and Associates med stromal biomarkers. PLoS ONE 9 (2): e86824. doi: 10,1371 /journal.pone.0086824
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østerrike
mottatt: 27 september 2013; Godkjent: 15 desember 2013; Publisert: 05.02.2014
Copyright: © 2014 Hägglöf et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Den svenske Forskningsrådet og svenske Kreftforeningen støttet arbeidet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Regelmessig genet fusjon mellom androgen-regulert gen TMPRSS2 og medlemmer av ETS transkripsjonsfaktor familie, oftest ERG, er til stede i ca 50% av prostata kreft tilfeller [1]. Nærvær av dette fusjonsgenet er en kritisk hendelse i utviklingen av prostatakreft [2] – [4]. Transgen ekspresjon av fusjonsgenet imidlertid bare resulterer i PIN-lesjoner og ytterligere genetiske endringer, for eksempel tap av PTEN og aktivering av PI3K reaksjonsveien, er nødvendig for å fremkalle kreft [5] – [8]. Eksperimentelle studier overekspresjon eller undertrykket fusjonsgenet tyder på at det fremmer tumorcelle invasivitet og celleproliferasjon [1]. Tallrike studier har evaluert assosiasjonen av TMPRSS2-ERG og utfallet av prostatakreftpasienter med varierende resultater [1]. En fersk stor cohort- og metaanalyse viser imidlertid at fusjonsgenet status ikke er en viktig prediktor for prostatakreft dødelighet eller tilbakefall hos pasienter behandlet med radikal prostatektomi [9]. Så vidt vi vet, har bare to studier undersøkte fusion-gener status i forhold til det naturlige forløpet av sykdommen i en vaktsom venter kohort. I begge studiene nærvær av TMPRSS2-ERG fusjon var forbundet med en økt risiko for prostatakreft død [10], [11].
Fusion genet status er generelt bestemt av fluorescens in situ hybridisering (FISH). Positive epitelial ERG immunfarging ved hjelp av en nylig utviklet antistoff, er imidlertid sterkt korrelert (95,7% sensitivitet og 96,5% spesifisitet) av tilstedeværelse av TMPRSS2-ERG fusjonsgenet [12] – [15] som tyder på at immunfarging kan være en praktisk måte for å bestemme tilstedeværelsen av den TMPRSS2-ERG fusjonsgenet.
Nylige studier tyder på at tumor aggressivitet er relatert til endringer i tumormikromiljøet [16]. I prostata tumorer stroma er endret i forhold til tumor aggressivitet [17]. I løpet av prostatatumorprogresjon, kreft epitelceller sender signaler til den omkringliggende stroma, som derved tilpasning til behovene til den voksende tumor. De tumor stromaceller i sin tur sender vekstfremmende signaler til epitelet [17]. Når forskjellige prostata kreftceller blir inkubert sammen med normale fibroblaster induserer endringer hos fibroblaster som er tumorcellelinje-spesifikk [18]. Hvis dette skjer også
in vivo
det kan tyde på at fusjonsgenet positive og negative svulster kan vise forskjeller i svulsten stroma. Dette har imidlertid så vidt vi vet aldri blitt undersøkt. Hvis dette var tilfelle det kan hjelpe oss å identifisere de stort sett ukjente signaler som bestemmer utviklingen av en tumor stroma assosiert med aggressiv sykdom.
I denne studien undersøkte vi derfor et stort historisk kohort av TURP-diagnosen prostatakreft greid av vaktsom venter ved ERG farging for å undersøke om ERG farging ble assosiert med andre kreft egenskaper og langsiktig utfall, og særlig hvis det er forbundet med forskjeller i tumor stroma morfologi.
Resultater
Heterogene uttrykk for TMPRSS2-ERG i vev samplet fra forskjellige tumor foci
for å klargjøre hvilken rolle TMPRSS2-ERG i prostatakreft, en TMA inneholder materiale fra 350 prostatakreftpasienter hvorav 256 ble behandlet med vaktsom venter, ble analysert med ERG immunhistokjemi (IHC). Den TMA inneholdt 5-8 prøver av tumorvev og 4 prøver av ikke-ondartet vev fra forskjellige steder i prostata av den samme pasient. Nuclear tumor ERG farging ble observert i 34% av pasientene. Som tidligere vist, ERG uttrykk noen ganger varieres ved sammenligning av forskjellig tumor foci fra den samme pasient. Heterogene ERG farging ble observert i 18% av pasientene. I noen få pasienter (6%) cytoplasma ERG uttrykk ble funnet i epitel ikke-ondartet vev. Hos alle pasienter endotelceller farget positivt for ERG og dette fungerte som en intern positiv kontroll.
TMPRSS2-ERG er assosiert med prognostiske markører
Forholdet mellom TMPRSS2-ERG uttrykk for allerede etablerte histologiske og kliniske prognostiske markører ble analysert. Ekspresjon av ERG i minst en tumor kjerne var signifikant positivt korrelert med avansert stadium tumor, høy Gleason score og tilstedeværelse av metastasering. I tillegg ble ERG uttrykk også assosiert med tumor epitelial cellemarkører slik som høy-celleproliferasjon (Ki67) [19], pakt [20] og pEGFR uttrykk [21], som alle er kjent for å være relatert til dårlig resultat (tabell 1 og 2) . Disse eksperimentene tyder på at TMPRSS2-ERG er knyttet til faktorer som er kjent for å indikere dårlig prognose for av prostatakreftpasienter.
TMPRSS2-ERG korrelerer med kreft spesifikk overlevelse
For å evaluere den kliniske betydningen av TMPRSS2-ERG i denne kohort av pasienter fulgt med vaktsom venter, ble overlevelsesanalyse med Kaplan-Meier utført. Analysen viste at pasienter med tumorer som uttrykker ERG hadde en signifikant redusert overlevelse sammenlignet med pasienter med tumorer som mangler ERG-farging (figur 1 A). I tillegg svulster uttrykker ERG hos pasienter med Gleason scorer 6 eller 7 svulster hadde signifikant kortere kreft spesifikk overlevelse enn de med svulster mangler ERG uttrykk (figur 1 B). En forskjell i overlevelse mellom grupper med svulster som uttrykker ERG ble også sett hos pasienter med Gleason score 8-10 tumorer (figur 1 C). Svulster uttrykker ERG var forbundet med en økt relativ risiko for prostatakreft bestemt død i en univariat Cox regresjonsanalyse (tabell 3). I multivariat Cox regresjonsanalyse herunder etablert prognostisk markør Gleason ballen og lokal tumorstadium, tilstedeværelse av TMPRSS2-ERG i svulsten var signifikant assosiert med dårlig prognose, og ga ytterligere prognostisk informasjon (tabell 4).
Pasienter blir separert i to grupper avhengig av tilstedeværelsen av ERG uttrykket (stiplet linje) eller fravær av ERG uttrykket (heltrukket linje) i alle pasienter (A), pasienter med Gleason ballen 6 (B), og pasienter med Gleason ballen 8-10 (C).
Når pasienter ble analysert i 3 grupper, ERG-, ERG + og ERG heterogen (h) i Kaplan- Meier plot, ERG- hadde mest gunstig prognose, bedre enn ergh og ERG +, som hadde lignende prognose (data ikke vist).
TMPRSS2-ERG er tilknyttet stromale endringer
TMA har tidligere vært ansatt for å identifisere en rekke prognostiske markører. Stromale faktorer i prostatakreft som vi tidligere identifisert som assosiert med overlevelse av pasienter med prostatakreft i denne TMA er PDGFRp [22], hyaluronan [23], Caveolin-en (Scherdin et al, upublisert) androgen reseptor [24], mastceller [ ,,,0],25] og von Willebrand faktor [19]. Interessant nok var TMPRSS2-ERG funnet å være forbundet med alle disse faktorene, unntatt AR og mastceller. I disse studier rapporterer vi at høy stromal ekspresjon av PDGFRp og hyaluronan, både i tumoren stroma og i stroma av den omgivende ikke-ondartet vev, var assosiert med en dårlig resultat av prostata kreftpasienter. I tillegg er høy kar tetthet (målt ved ekspresjon av von Willebrand-faktor) og redusert tumor stromal ekspresjon av Caveolin-1 var knyttet til dårlig prognose. TMPRSS2-ERG ble funnet å assosiere med disse forholdene på en måte forutsi et dårlig resultat av pasienten (høy tumor stromal ekspresjon av PDGFRp, hyaluronan, von Willebrand-faktor og lav stromal ekspresjon av Caveolin-1) (Tabell 5 og 6). Disse resultatene indikerer at tilstedeværelse av TMPRSS2-ERG er relatert til stromal fenotyper assosiert med dårlig prognose for pasienter med prostatakreft.
Diskusjoner
I denne studien, TMPRSS2-ERG ble funnet å være assosiert med en rekke kliniske parametere, inkludert overlevelse, i en pasient kohort administrert med WW. I tillegg til dette, assosiasjoner mellom fusjonsgenet status og stromal gener som tidligere ble identifisert som biomarkører med prognostisk informasjon på prostatakreft ble også identifisert.
Nåværende biomarkører for å diagnostisere prostatakreft og forutsi prostatakreft utfallet ikke har tilstrekkelig spesifisitet og sensitivitet og genererer problemer med overbehandling og overdetection [26]. Ny og bedre prognostiske markører for å sortere ut pasienter med behov for prostatakreft behandling er sterkt garantert. Nytten av TMPRSS2-ERG som en prognostisk markør for prostatakreft har vært tungt studert med forskjellige resultater. Det er imidlertid stadig mer klart at hos pasienter behandlet med radikal prostatektomi, betyr TMPRSS2-ERG fusjon ikke har en stor innvirkning på pasientenes prognose [9]. Spesielt alle studier, undersøke utfallet etter vaktsom venter (den naturlige årsaken til sykdommen) finner ut at TMPRSS2-ERG er assosiert med et dårlig resultat. Prostatakreft er generelt multifokal og i ca 30% av menn med prostatakreft deres prostates båtplass både fusjon genet positive og fusion genet negative svulster [27], [28]. I slike tilfeller er det vanligvis fusjonsgenet positivt fokus som danner lymfeknutemetastaser, og i denne studien var det forbundet med nærværet av benmetastaser ved diagnose [27]. Hypotetisk nærvær av fusjonsgenet gir en mer aggressiv cancer bare når pasienten forblir ubehandlet, muligens fordi tumor trenger tid til å anskaffe ytterligere genetiske endringer, for eksempel tap av PTEN [7], for å være i stand til å danne makroskopiske metastaser.
Tissue materialer generert med TURP kan inneholde en overrepresentasjon av overgangssone svulster og siden prostatakreft stammer fra overgangssonen er kjent for å være biologisk forskjellig fra randsonen svulster dette kan påvirke effekten av ERG overekspresjon [29], [30 ]. Den lavere frekvens av TMPRSS2-ERG i denne studien (34%) sammenlignet med ca 50% i radikal prostatektomi kohorter kan også forklares med pasienten kohort (fusjonsgenet er sjeldnere i overgangssonen svulster) og er i tråd med hva andre har sett i TURP materialer [9].
Oppdagelsen av at ekspresjon av fusjons-genet TMPRSS2-ERG i epitelceller er relatert til stromale endringer er ny og interessant. Svulsten mikromiljøet, som er formet av toveis kommunikasjon mellom kreft epitelceller og deres omkringliggende stroma, er involvert i alle faser av kreft progresjon, har prognostisk informasjon og påvirke responsen på behandlingen [31] – [33]. Interessant, og i samsvar med de foreliggende funn i prostatakreft, brystkreft forskjellige subtyper, basert på deres ekspresjon av østrogen- progesterone- og HER2-reseptorer i epitelet, gir opphav til stromale celler med forskjellige genuttrykksmønster og variabel evne til å støtte kreft celle migrasjon [34]. Alle stromal endringene som ble funnet å assosiere med epitelial ERG uttrykk er knyttet til mer aggressiv kreft. Lav stromal Caveolin-en korrelerer med redusert tilbakefall overlevelse i prostatakreftpasienter og Akt aktivisering [35]. Tilsvarende økte nivåer av PDGFRp og hyaluronan i prostata svulst stroma og omkringliggende ikke-maligne stroma forbinder med dårlig resultat av prostatakreftpasienter og injeksjon av hyaluronan i prostata øke prostata kreft vekst i en orthotopic rottemodellen [22], [23]. Angiogenese er kritisk for utviklingen av prostatakreft, og nærværet av fusjonsgenet var forbundet med øket vaskulær tetthet. For ytterligere å undersøke om og på hvilken måte celler som uttrykker TMPRSS2-ERG fusjonsgenet er i stand til å endre svulsten mikromiljøet og gjøre det mer gjestfrie til kreftceller, vil legge til viktig informasjon om hvordan TMPRSS2-ERG bidrar til sykdomsutviklingen. Spesielt er det også endringer i svulsten stroma relatert til tumor aggressivitet (for eksempel redusert androgen reseptor uttrykk og mast celle tall) som er tilsynelatende urelatert til epitelial ERG status. Celler som bærer fusjonsgenet er kjent for å ha en spesifikk genekspresjon mønster [36] og det kan være mulig å finne viktige faktorer å endre stroma i en svulst fremme måte, en effekt som tilsynelatende gir aggressiviteten til tumorer i alle Gleason karakterer.
Konklusjoner
i denne kohorten ble TMPRSS2-ERG funnet å assosiere med en rekke kliniske parametere, inkludert overlevelse, relatert til dårlig resultat. Dette bekrefter tidligere resultater som viser at nærværet av fusjonsgenet gir en mer aggressiv sykdom hos pasienter som ikke behandles. Videre har denne studien identifisert assosiasjoner mellom TMPRSS2-ERG og stromal endringer, tidligere identifisert som biomarkører forutsi en dårligere prognose for pasienter med prostatakreft. Dette kan tyde på at mer aggressive fenotype som oppstår med tilstedeværelse av TMPRSS2-ERG i hvert fall delvis skyldes endringer i svulsten stroma.
Materialer og metoder
Tissue microarray
Vevsprøver ble samlet fra pasienter som gjennomgikk transurethral reseksjon av prostata (TURP) ved sykehuset i Västerås, Sverige, mellom 1975 og 1991. prostatakreft ble oppdaget av histologisk analyse. Median alder ved diagnosetidspunktet var 74 år (spredning 51-95 år). Informasjon om tilstedeværelse av benign prostata hyperplasi var ikke tilgjengelig. Vevsprøver ble formalinfiksert, parafin forankret og regraded henhold til Gleason system av en patolog i tråd med ISUP anbefalinger [37]. Vevsprøvene ble brukt til å konstruere en vev micro array (TMA) med en Beecher Instrument (Sun Prairie, WI, USA). Kantene av vevsfragmentene ble unngått for å hindre at effekter på grunn av kjemikalier og kirurgiske anordninger som brukes under TURP prosedyren. Den TMA: s inneholdt 5-8 prøver av svulstvev som representerer både primære og sekundære Gleason grad og 4 prøver av ikke-ondartet vev fra hver pasient. Pasientene hadde ikke fått anti-kreft terapi før TURP. Radionuklide bone scan ble oppnådd etter diagnose for deteksjon av metastaser. 350 pasienter ble inkludert i studien, hvorav 256 pasienter ble fulgt med vaktsom venter etter TURP. Ved symptomer fra metastaser pasienter fikk palliativ behandling med androgen ablasjon og i noen tilfeller strålebehandling eller østrogenbehandling, i henhold til terapitradisjoner i Sverige i løpet av den tiden. Dessuten ble 94 pasienter som ble behandlet med palliativ behandling umiddelbart etter diagnose med i analysen. Behandlede pasienter var ikke inkludert i overlevelsesanalyse. Median total overlevelse for pasientgruppen følges med vaktsom venter var 5,9 år. 80 av de vevsprøver ble gradert som Gleason scorer 4-5, 71 pasienter som Gleason score 6, 44 pasienter hadde Gleason score 7, og 61 pasienter Gleason score 8-10. 1 pasient (0,4%) med Gleason score 7, og 8 pasienter (3,1%) med Gleason score 8-10 hadde skjelettmetastaser ved diagnose. I august 2003 26 pasienter (10,2%) var fortsatt i live, 65 pasienter (25,4%) hadde dødd av prostatakreft og 165 pasienter (64,5%) hadde dødd av andre årsaker.
Faktorer av potensialet prognostisk betydning slik som Gleason score, tumorvolumet, tumor stadium, tumorcelle Ki67, Pakt og Perg uttrykk samt stromale faktorer som androgen reseptor, mastceller, PDGFRp, hyaluronan, hadde Caveolin-en og von Willebrand faktor allerede blitt analysert i materialet og kunne brukes i denne studien (for referanser se ovenfor).
Etikk uttalelse
materialet ble samlet inn i henhold til svensk lov i en tid da informert samtykke ikke var nødvendig. Den forskningsetiske komité ved Umeå universitet sykehus (Regional Etisk Review Board i Umeå) godkjent av studien og fravikes behovet for samtykke.
Immunohistochemistry
Tissue seksjoner ble deparaffinized og rehydrert i xylen, 99 % etanol, 96% etanol, 70% etanol (3 x 5 min i meget trinn), og deretter vasket i destillert vann. Antigenet ble hentet i Tris /EDTA (pH 9) i 1 time i en trykkoker. Seksjoner ble deretter avkjøles i 5 minutter i et vannbad før de vaskes i første destillert vann og deretter TBS i 20 min. Resten av immunhistokjemiske prosedyren ble utført i et intelliPATH FLX instrument (Biocare Medical, Concord, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. ERG antistoff (CM421A, Biocare Medical) ble fortynnet i Renoir Red (01:50). MACH 3 Mouse HRP-Polymer (Biocare Medical) ble brukt for deteksjon. I korrelasjonsanalyse prøvene ble bedømt som positive for TMPRSS2-ERG hvis farging ble påvist i minst én av de tumor kjernene.
statistikker og
Korrelasjon mellom nominelle størrelser og kontinuerlige variabler ble analysert under anvendelse av Kendall er tau b korrelasjon test. Data som brukes i korrelasjonsanalysen ble oppsamlet på tidspunktet for prostata kreftdiagnose. Pasienter inkludert i overlevelse analyser med Kaplan-Meier og Cox regresjon ble fulgt med vaktsom venter. Varigheten av overlevelse (EFS) er definert som tiden fra TURP frem til dato for prostatakreft død, død av andre årsaker, eller hvis ingen dødsfallet fant sted, frem til dato for siste oppfølging. Forskjeller i utfall mellom gruppene ble testet med log-rank test. Den prognostiske relevans TMPRSS2-ERG immunoreaktivitets ble undersøkt av Cox regresjonsanalyse alene og sammen med Gleason score og og lokal tumorstadium. Nivået av statistisk signifikans ble definert som
P
0,05 (tosidig). Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS 21.0.0 programvare for Os X (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
bekreftelser
Forfatterne takker Pernilla Andersson og Birgitta Ekblom ved Institutt of Medical biovitenskap, Umeå universitet for dyktig teknisk assistanse.
