Abstract
dicer er abnormt uttrykt i flere typer kreftformer. Spaltes ved hjelp av dicer, blir de små ikke-kodende microRNAs (mirnas) betraktes som potensielle verktøy for diagnose og prognose av kreft. Denne studien undersøkte uttrykk for miRNAs tenkt å målrette dicer. Uttrykk av 1.205 mennesker miRNAs og miRNA * s ble undersøkt i fire pasienter med prostatakreft (PCA) av miRNA matrise der terskelen ble satt som todelt. Syttitre mirnas og miRNA * s signifikant nedregulert mens 10 var oppregulert i PCA vev sammenlignet med matchede histologisk normale kjertler. Av disse MIR-29b-1, MIR-200A, MIR-370, og MIR-31, som var de mest ned /opp-regulert og tett potensielt målrette til dicer 3 «UTR, ble undersøkt videre. Vev av primære svulster og matchet normale prostata kjertler fra 185 pasienter med PCa ble samlet inn for videre undersøkelser. Dicer mRNA nivåer ble negativt korrelert med Mir-29b-1 (ps = -0,177, p = 0,017), MIR-200a (ps = -0,489, p 0,0001) og Mir-31 (ps = -0,314, p 0,0001) uttrykk. Sammenlignet med tilstøtende normale kjertler, PCA vev viste signifikant lavere MIR-200A og MIR-31 expression nivåer. Videre i metastatisk PCA uttrykket nivåer av MIR-200A, MIR-370, og MIR-31 var dramatisk høyere enn i lokaliserte PCa. I tillegg forhøyede uttrykk nivåer av MIR-200A og MIR-31 så ut til å være forbundet med kastrering-resistente PCa. Disse funnene tyder på mulighetene som MIR-200A og MIR-31 target dicer og er involvert i kreftutvikling, migrasjon, og oppførselen til kastrering-resistente PCA indikerer at de kunne være potensielle biomarkører for overvåking PCa progresjon.
Citation : Bian X, Shen Y, Zhang G, Gu C, Cai Y, Wang C, et al. (2015) Uttrykk for dicer og relaterte mirnas i utviklingen av prostatakreft. PLoS ONE 10 (3): e0120159. doi: 10,1371 /journal.pone.0120159
Academic Redaktør: Ajay Pratap Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, USA
mottatt: 10 juli 2014; Godkjent: 03.02.2015; Publisert: 13 mars 2015
Copyright: © 2015 Bian et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering: Denne studien ble støttet delvis med tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (nr 81272837) og Technology Foundation Advanced av Shanghai (SHDC12013122). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne erklærer at de ikke har noen økonomiske eller kommersielle interesser knyttet til denne studien
Innledning
Prostatakreft (PCA) er i dag den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis, og PCa spesifikk dødelighet er økende i mange asiatiske land [1]. Avansert eller metastatisk PCa fortsatt uhelbredelig og androgen ablasjon bare tilbyr berørte pasienter en median progresjonsfri gang på 2 år [2].
Mange genetiske faktorer som polymorfismer og epigenetiske forandringer er tenkt å bidra til kreftutvikling og progresjon av prostata adenokarsinom. Videre har flere studier undersøkt rollene microRNAs (miRNA) i initiering og progresjon av kreft hos mennesker, som fører til utforskning av nye mekanismer for tumorutvikling [3]. I romanen synteseveien er lang mirnas forløpere transkribert av RNA polymerase II og deretter behandlet i modne mirnas ved sekvensiell virkning av dicer og drosha endonukleaser. Argo2, et medlem av familien av proteiner som argonaute, binder miRNA og danner en RNA-indusert stanse komplekse gjennom komplementære med målstedet på den 3′-ikke-translaterte region (UTR) av mål-mRNA for å utløse enten translasjonell undertrykkelse eller mRNA degradering [4, 5]. Tap av miRNA biosyntese, som sett i dicer knockouts, regnes som dødelig. Nylig har en dicer uavhengig miRNA biogenesis vei blitt avslørt, viser en ny rolle siden protein i genet Slå [6]. Videre kan noen eldre mirnas omvendt regulere dicer uttrykk ved å kombinere med dicer 3’UTR [7].
Flere studier har vist prognostiske verdiene av abnormt uttrykt dicer i eggstokkene, brystkreft, tykktarms, og blære kreft [ ,,,0],8-11]. Dicer har tidligere vist seg å være oppregulert i PCa, selv om en lavere ekspresjon av dicer bidratt til en kortere tid gjentakelse [12]. De økte dicer nivåer ved PCA korrelert med klinisk stadium, lymfeknute status, og Gleason score. Det er opp-regulering kan også forklare den globale økningen av miRNAs uttrykk observert ved PCA [12, 13]. I en
PTEN
null musemodell for PCA fullstendig ablasjon av dicer aktivitet betydelig stanset tumorvekst og progresjon, noe som viser at mirnas har viktige roller i å opprettholde kreftcelle trenings [14].
Å bedre forstå forholdet mellom mirnas og dicer ved PCA utvikling og progresjon, er nødvendig omfattende analyse av uttrykk for miRNAs. Denne studien utforsket derfor forskjellig uttrykt mirnas som har potensial til å målrette dicer 3 «UTR med sikte på å undersøke forholdet mellom mirnas og dicer i kontinuerlig utvikling av PCa.
Materialer og Metoder
pasient~~POS=TRUNC kohort
Denne studien ble godkjent av gjennomgangen styret i Fudan University i Shanghai Cancer Center og en godkjent og signert vurdering styret informert samtykkeskjema ble oppnådd for hver deltaker. Vev av primære svulster og matchet normale prostatakjertler ble samlet inn fra 185 pasienter med PCa ved Fudan University i Shanghai Cancer Center mellom 2007 og 2011. Av disse 144 pasientene gjennomgikk radikal prostatektomi, mens 41 ble administrert transuretral reseksjon av prostata. Kliniske karakteristika som alder, patologisk stadium, Gleason score, androgen-avhengige tilstand, og første prostataspesifikt antigen (PSA) nivåer er blitt nevnt i vår tidligere arbeid [15].
RNA ekstraksjon og miRNA microarray
Total RNA ble ekstrahert fra frosset vev lagres ved -80 ° C under anvendelse av total-RNA ekstraksjon sett (Ambion Inc., Austin, TX) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA-konsentrasjonen og integritet ble målt ved bruk av Nanodrop spektrofotometer (ND-1000, Nanodrop Technologies, Wilmington, DE) og elektroforese, respektivt. Like mengder (300 ng) av RNA fra hver pasient og kontroll ble slått sammen og presentert som to grupper (primær tumor og tilsvarende normale prostatakjertler). Mirna signatur profiler ble samlet inn over to gruppene. Agilent mikroRNA arrays (v16.0, 8 × 60k, Agilent Technologies, Santa Clara, CA), som inneholder 1,205 fange prober, ble brukt til å kvantifisere genom-wide mirnas uttrykk i fire par primærtumor og matchet normale prostata kjertler. Den microarray arbeidet ble utført ved hjelp av en Agilent mikroRNA matrise som ble skannet av en Agilent Scanner G2505B (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) og de oppkjøpte array-bildene ble analysert ved Agilent Feature Extraction (versjon 10.7.3.1, Agilent Technologies, Santa Clara , CA). I stedet for å bruke en global median metode, normalisering og etterfølgende dataprosessering ble utført ved anvendelse av GeneSpring GX v11.5.1 programvarepakke (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), i hvilken terskelen ble satt til to-fold. Computational miRNA mål prediksjon algoritmer TargetScan (https://www.targetscan.org) og DIANA-mikrotiterplater (https://diana.imis.athena-innovation.gr/) ble brukt for å undersøke serie mirnas potensielt rettet mot dicer.
revers transkripsjon-PCR og sanntids kvantitativ PCR
Total RNA (2 mikrogram) ble revers transkribert ved hjelp av RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, Lafayette, CA) i henhold til produsentens instruksjoner uten en RNase-inhibitor i et sluttvolum på 20 ul ved 25 ° C i 10 min, deretter 37 ° C i 60 minutter, etterfulgt av 70 ° C i 5 minutter. For miRNA analyse ble mikroRNA Reverse Transcription Kit (Haoqinbio Inc., Shanghai, Kina) med spesialiserte primere brukes i henhold til produsentens protokoll ved 25 ° C i 5 min, deretter 42 ° C i 45 min, etterfulgt av 85 ° C i 5 min.
Sanntids kvantitativ (q) PCR ble utført ved hjelp av ABI PRISM 7900 system (Applied Biosystems, Foster City, California). TaqMan prober og primere (Roche, Basel, Sveits) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. Total RNA (2 pg) ble omdannet til cDNA i henhold til produsentens protokoll, og PCR ble utført i et totalt reaksjonsvolum på 10 ul, inkludert 5 ul TaqMan Premiks Ex Taq (2 x), 0,5 ul probe og primer premiks (20 x ), 1 ul cDNA templat, og 3,5 ul dobbeltdestillert vann. Reaksjonsbetingelsene inkluderte en innledende denatureringstrinn ved 95 ° C i 10 minutter etterfulgt av 40 sykluser av 95 ° C i 10 s og 60 ° C i 60 sek. Alle forsøk ble utført in triplo. For normalisering ble β-aktin og U6 brukes til henholdsvis dicer og miRNAs,. Gjennomsnittet av hvert tre eksemplarer ble brukt til å beregne relative konsentrasjoner (dicer ΔCt = Ct bety dicer-Ct bety β-aktin; miRNAsΔCt = Ct bety mirnas-Ct bety U6). Expression fold endringer ble beregnet ved hjelp av 2
-ΔΔCt metoder.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av IBM SPSS versjon 20.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Normaliserte uttrykk nivåer av dicer og mirnas gikk en normalfordeling test. Forskjeller i kontinuerlige variabler ble vurdert ved hjelp av
t-
test. Spearmans rang korrelasjonskoeffisient ρ
s ble brukt til å vurdere sammenhengen mellom normaliserte nivåer av dicer og mirnas eller Gleason score. Alle testene var tosidig med et signifikansnivå 0,05.
Resultater
Mirna matrise og real-time qPCR validering
Vi identifiserte 73 mirnas og miRNA * s som var betydelig nedregulert og 10 som ble oppregulert i PCA pasienter, som har potensiale til å bli brukt til å diskriminere prostata adenokarsinom fra matchede normale kjertler. MiR-29b-1, MIR-200A, MIR-370, og MIR-31were valgt for ytterligere validering av microarray resultater ved hjelp av sanntids qPCR fordi de var ikke bare den mest ned /opp-regulert, men også tett potensielt målrette til dicer 3 «UTR. Dataanalyse viste at Mir-29b-1, MIR-200A, MIR-370, og MIR-31 ble nedregulert i prostatakreft prøvene sammenlignet med matchede normalt vev. De sanntid qPCR resultatene var konsistente med de av microarray (Fig. 1).
For sammenligningen mellom miRNA array-data og sanntids qPCR resultatene, Mir-29b-1, MIR-200a, speil 370 og MIR-31determined å være forskjellig uttrykt i prostata adenokarsinom i forhold til matchede histologisk normale kjertler i fire pasienter ved miRNA utvalg ble validert ved hjelp real-Time qPCR. Lengden av søylene i diagrammet representerer log2-transformert median fold endringer (tumor /normal) i uttrykk på tvers av de fire pasientene for hver av de fire mirnas validerte.
dicer mRNA nivåer ved PCA
dicer mRNA nivåer signifikant forskjellig mellom primære PCA vev og matchet normalt vev fra 185 PCA pasienter (fig. 2A). Videre, sammenlignet med androgen-avhengige PCa, ekspresjonen av dicer var signifikant lavere i kastrering-resistente PCa (Fig. 2B), og i metastatisk PCa sammenlignet med den lokaliserte gruppe (Fig. 2C). Imidlertid ble det ikke observert noen signifikante sammenhenger mellom dicer uttrykket og den totale Gleason score (ρ
s = -0,082, p = 0,267) eller hoved Gleason score (ρ
s = -0,054, p = 0,468).
En, Expression of dicer i prostata adenokarsinom og dens matchet normale kjertler, etter normalisering p-aktin; B, Expression of dicer i androgen avhengige og androgen uavhengig PCA fold endringer av dicer mRNA nivåer i prostata adenokarsinom versus matchet normale kjertler ble log2 forvandlet på Y-aksen; C, Expression of dicer i lokaliserte og metastatisk PCA fold endringer av dicer mRNA nivåer i prostata adenokarsinom versus matchet normale kjertler ble log2 rangert på Y-aksen.
Differensiert uttrykk for miRNAs i valideringen kohort
de uttrykk nivåer av MIR-200A og MIR-31 var signifikant nedregulert i PCA vev sammenlignet med matchede normale kjertler (fig. 3B og 3D), mens det var ingen signifikant forskjell i uttrykket nivåer av Mir-29b -1 eller MIR-370 (fig. 3A og 3C).
Expression of Mir-29b-1 (A), MIR-200a (B), MIR-370 (C) og Mir-31 (D ) i prostata adenokarsinom og matchet normale kjertler, etter normalisering til U6.
etter log2-transformasjon av miRNA fold endringer i prostata adenokarsinom versus matchet normale kjertler, de relative uttrykk nivåer av MIR-200A, MIR -370, og MIR-31 var høyere i metastatisk PCa sammenlignet med lokaliserte PCa (fig. 4).
Expression of Mir-29b-1 (A), MIR-200a (B), MIR-370 ( C) og Mir-31 (D) i lokalisert og metastatisk PCA fold endringer av mirnas nivåer i prostata adenokarsinom versus matchet normale kjertler ble log2 forvandlet på Y-aksen.
Kohorter ble også delt inn i to undergrupper i henhold til deres androgen-avhengighet, med 166 pasienter som androgen-avhengige og 19 kastrering-resistente. Etter log2 transformasjon av fold endringer i prostata adenokarsinom versus matchet normale kjertler, de relative uttrykk nivåer av MIR-200A og MIR-31 var signifikant lavere i androgen-avhengige undergruppe sammenlignet med kastrering-resistente ett (Fig. 5).
Expression of Mir-29b-1 (A), MIR-200a (B), MIR-370 (C) og Mir-31 (D) i androgen avhengige og kastrering motstandsdyktig PCA fold endringer av mirnas nivåer i prostata adenokarsinom versus matchet normale kjertler ble log2 forvandlet på Y-aksen.
dicer mRNA i forhold til miRNA uttrykket
korrelasjonsstudier mellom dicer og Mir-29b-1, MIR-200A, MIR -370, og MIR-31 uttrykk i PCas viste at uttrykket av dicer mRNA var moderat og negativt korrelert med den av MIR-200A og MIR-31 (ρ
s = -0,489, p 0,0001, ρ
s = -0,314, p 0,0001, henholdsvis). Dessuten nivå dicer mRNA ble funnet mildt og negativt korrelert med Mir-29b-1 (ps = -0,177, p = 0,017) uttrykk. Men det var ingen statistisk sammenheng med uttrykk for dicer til MIR-31 uttrykk nivåer (ρ
s = -0,057, p = 0,458) (tabell 1).
Diskusjoner
PCa er en av de viktigste årsakene til kreft-relaterte dødsfall, og ulike mekanismer for PCa kreftutvikling og progresjon er undersøkt. Flere studier har vist at mirnas spiller viktige roller i programmet ved å fremme nedbrytning av målgenet. Selv om mange mirnas er kjent for å bli deregulert i kreft, er det uklart hvilke har en patogen rolle i sin utvikling. Endringer i mirnas uttrykk i kreftcellelinjer direkte regulerer deres atferd, som for eksempel spredning og apoptose [3], samt påvirke svulst undertrykkelse og metastasering. I denne studien undersøkte vi uttrykket nivåer av Mir-29b-1, MIR-200A, MIR-370, og MIR-31 i matchet PCA vev fra 185 pasienter.
Tidligere studier har påvist forhøyede nivåer av dicer i primær PCa. Vi fant at dicer mRNA-nivåer ble betydelig redusert i metastatisk og kastrering bestandig PCa, som er assosiert med dårlig prognose. Dempe dicer kunne bidra til aktivering av
p
-Akt og økt ekspresjon av cellesyklus-assosierte molekyler og proteiner som er involvert i tumorcelle-invasjon. Omvendt, knock-down av dicer ble også vist å hemme celleproliferasjon og fremme apoptose i leukemicellelinjer [16]. Disse avvikene kan forklares med den observerte heterogenitet og genetisk mangfold i ulike PCA vev [17].
Vår miRNA korrelasjon studie viste at den relative uttrykk for MIR-200A og MIR-31 var moderat og negativt assosiert med dicer mRNA nivåer ved PCA. Dette resultat tyder på en sannsynlighet for en direkte korrelasjon mellom mirnas og dicer fordi mirnas hemme proteinsyntese for å bevare stabiliteten av deres mRNA-target [4]. Sammenligning uttrykket nivåer av MIR-200A og MIR-31 mellom primærtumor og tilstøtende normale kjertler i denne studien, observerte vi en betydelig uttrykk nedgang i primærsvulster, noe som tyder på at MIR-200A og MIR-31 kan være involvert i prostata kreftutvikling. Tidligere studier viste at den MIR-200-familien er en avgjørende modulator av epitelial til mesenchymale overgang, og at det er nedregulert og utviser tumor undertrykkende egenskaper i nyre, prostata, bryst, blære, bukspyttkjertel og gastrisk kreft [3, 18] . I tillegg ble det MIR-200 familien vist seg å modulere oksidativt stress respons, og dermed påvirke tumorigenesis og kjemosensitivitet [19]. Vi fant at MIR-31 ekspresjon nivået ble redusert i tumorvev sammenlignet med normalt kjertler, som indikerer at MIR-31 kan fungere som en tumor supressoren genet. Imidlertid gjenstår rollen MIR-31 kontroversielle [20-22]. Chan et al. tidligere funnet at bare en av tre MIR-31 isoformer, som skilte seg bare svakt i sin 5′- og /eller 3′-endesekvenser, direkte fortrengt dicer uttrykk både mRNA og translasjons-nivåer i MCF-7 brystkreftceller og A549 lunge kreftceller. Dette resulterte i forbedret cellulær følsomhet for cisplatin, en kjent egenskap av dicer knockdown [23].
I løpet av sykdomsutvikling, er mirnas antatt å være prognostiske faktorer for metastasering. Vi viste at MIR-200A, MIR-31, og Mir-370 uttrykk nivåene ble økt i metastatisk PCa snarere enn i lokaliserte kreft.
In vitro
, transient transfeksjon av MIR-200a ble tidligere vist å signifikant redusere PCa-cellelinje spredning, men har ingen effekt på invasivitet [24]. I eggstokkreft stamceller, ble tapet av MIR-200a uttrykk tenkt å spille en avgjørende rolle i E-cadherin undertrykkelse, og dermed styrke migrasjons og invasive evner CD133 /1
+ celler [25]. Videre MIR-200a nedregulering i meningeomer fremmet tumorvekst ved å redusere E-cadherin uttrykk og aktivering av Wnt /β-catenin signalveien [26].
På samme måte en rolle for MIR-370 i spredning av humane PCA-celler har tidligere blitt demonstrert. Ektopisk uttrykk for MIR-370 forfremmet celleproliferasjon og økt ankeruavhengig vekst og kolonidannelse evne DU145 og LNCaP PCA celler [27]. Høyere uttrykk av MIR-370 i mage kreft vev var også assosiert med mer avansert nodal metastase og en høyere klinisk stadium sammenlignet med kontroller, mens pasienter med mer avanserte eller invasive svulster viste høyere serum Mir-370 uttrykk nivåer.
In vitro
analyser indikerte at eksogene Mir-370 uttrykk forbedret onkogene potensial av magekreft celler, målrettet spådd områder i transformerende vekstfaktor-b reseptor II genet 3’UTR, og økt abdominal spres metastaser i hårløse mus [28]. I vår studie ble MIR-31 forhøyet i metastatisk PCa. Hemming av MIR-31 kan fremme
in vivo
metastaser gjennom direkte regulering av en kohort av prometastatic gener i bryst og eggstokkreft [29, 30]. Selv om MIR-31 overekspresjon i en rekke ovarie cancer cellelinjer med en dysfunksjonell TP53 sti inhibert proliferasjon og apoptose [30], dens overekspresjon i kolon kreftcellelinje HT29, som bærer en TP53 mutasjon, resulterte i en sterk anti-apoptotiske virkning . Den anti-apoptotiske virkning av MIR-31 over-ekspresjon var lavere eller fraværende i celler med en funksjonell TP53 sti [31]. Tatt sammen, både for ekspresjon og funksjon av MIR-31 synes å være kreftspesifikke og muligens celle kontekstavhengige.
Kastrering motstand er et bestemt stadium av avansert PCa forbundet med svikt i hormonbehandling og en dårlig prognose. I vår kohort, uttrykket nivåer av MIR-200A og MIR-31 var høyere i primære svulster i kastrering-resistente PCa sammenlignet med androgen-avhengige PCA og høyere i primære svulster sammenlignet med sammenkoblede normale kjertler. Dette antyder en mulighet for at den opp-regulert ekspresjon av MIR-200A og MIR-31 i løpet av karsinogenese spiller en viktig rolle i utviklingen av PCa ved å fremme cellen inn i kastrering trinnet. Flere studier har allerede vist at androgen reseptor signalisering spiller en avgjørende rolle ved PCA patogenesen. Nylig, mirnas ble funnet å være mediatorer av androgen aktivitet i prostata og muskel, noe som indikerer at de kan være viktig i utviklingen av PCa [32]. Lin et al. fant at MIR-31 uttrykk ble redusert som følge av arrangøren hypermethylation i grunnskolen og metastatisk PCA og at det var omvendt korrelert med aggressivitet av sykdommen. Det ble vist til direkte rettet mot androgen reseptoren på et nettsted i koderegionen ofte mutert ved PCA [33]. Dermed kan oppregulering av MIR-31 være en årsak til svikt i androgen deprivasjon terapi. I tillegg oppregulert MIR-31 kunne undertrykke cellesyklus regulatorer og hindre cytotoksiske midler indusere apoptose i PCA celler, noe som gjør kastrering-resistente PCa terapi vanskelig [33, 34].
Rollen forhøyede dicer nivåer i endringen fra primær til metastatiske og kastreringsbestandig PCA tumorer, så vel som i forhold til mirnas, må videre undersøkt i en større kohort av pasienter. Vår studie hadde ikke kontinuerlig overvåke disse endringene i hver årsklasse, og metastatisk og kastreringsresistent prøvene var uavhengig av de lokaliserte primære kreft vev, slik at våre funn er begrenset. Likevel mener vi at denne pilotstudien var viktig å få innsikt i hvordan mirnas kan reguleres med metastatisk og kastreringsresistent PCA pasienter. Mirnas er fremstår som en roman sett av molekyler som kan til slutt føre til kreft dannelse når deregulert. De er også sannsynlig å samarbeide med andre klassiske onkogener og /eller ned-regulere tumorsuppressorgener å påvirke tumor atferd. Disse ikke-kodende klasser av RNA kan tjene som nyttige biomarkører og kan forbedre kliniske behandlingen ved å la oss til å velge mer passende behandlingstilbud for pasienter [35]. Selv om store gjennombrudd i translasjonell onkologi har blitt gjort de siste årene, mange spørsmål fortsatt tas opp i behandlingen av pasienten. Videre dødeligheten nedgang i «PSA era «er omstridt på grunn av PSA-basert screening-programmer som også fører til overdiagnostikk og overbehandling. Dermed er nye og allsidige molekyler i stand til å drive beslutningsprosessen gjennom hele sykdomsforløpet sterkt behov.
I konklusjonen, våre funn viste at dicer kan være et mulig mål for MIR-200A og speil 31. Videre kan disse mirnas involvere i kreftutvikling, migrasjon, og oppførselen til kastrering-resistente PCA og kan brukes som potensielle biomarkører i å overvåke sykdomsutvikling av PCa.
