Abstract
endotel (E-) og platelet (P-) selectin mediert adhesjon av kreftceller til vaskulærendotelet er en sentral trinn i hematogenous metastasedannelse. Nyere studier har vist at selectin mangel reduserer metastasedannelse
in vivo
. Vi valgte en E- og P
S
electin bestemt
D hoteller, NA
A
ptamer (SDA) via SELEX (
S
ystematic
E
volution av
L
igands av
EX
ponential berikelse) med en
K
d verdi på ca 100 nM og evnen til å hemme interaksjonen mellom selectin og dets ligander. Ansette human kolorektal kreft (HT29) og leukemi (EOL-1) cellelinjer vi kunne demonstrere en anti-klebende effekt for SDA
in vitro
. Under fysiologiske skjærspenningsforhold i en laminær strømning adhesjonsassayet, SDA hemmet dynamisk tumor celle adhesjon til immobilisert E- eller P-selektin. Stabiliteten av SDA i mer enn to timer, tillates dens anvendelse i celle-celle adhesjon assays i cellekulturmedium. Når adhesjon av HT29-celler til TNFa-stimulerte E-selektin som presenterer humane pulmonære mikrovaskulære endotelceller ble analysert, kunne hemming via SDA bli demonstrert i tillegg. I konklusjonen, er SDA en potensiell ny terapeutisk middel som motvirker selektin-mediert adhesjon under metastasedannelse i menneske maligniteter
Citation. Faryammanesh R, Lange T, Magbanua E, Haas S, Meyer C, Wicklein D, et al. (2014) SDA, en DNA Aptamer hemme E- og P-selektinuttrykk mediert adhesjon av kreft og leukemiceller, den første og Pivotal Step i Transendothelial Migration under Metastase formasjonen. PLoS ONE 9 (4): e93173. doi: 10,1371 /journal.pone.0093173
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 9 januar 2014; Godkjent: 03.03.2014; Publisert: 03.04.2014
Copyright: © 2014 Faryammanesh et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forschungs- und Wissenschaftsstiftung Hamburg i Forschungsverbund «Celleoverflate- targeting». Grant av Fazit-Stiftung til R.F. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser: Den aptamer har patentsøkt,. navnet «DNA-Aptamere, dø E- und P-Selektine spezifisch binden», antall 2013112212485800DE. Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Til tross for alle fremskritt innen molekylær medisin, er behandling av metastatisk sykdom fortsatt et uløst problem således dødeligheten av kreft er fremdeles høy. I 2013 ble om lag 1.600.000 tilfeller av kreft og 580.000 kreftdødsfall registrert alene i USA [1]. Denne høye dødeligheten er hovedsakelig på grunn av det faktum at metastasert kreft kan ikke behandles curatively. Således, mer enn 90% av kreft ofre dø på grunn av metastatisk spredning av de maligne celler [2]. Derfor fremme i kreftbehandlingen i hovedsak avhenger av den terapeutiske manipulering av metastatisk prosess.
I løpet haematogeneous metastasedannelse kreftceller har å forholde seg til og transmigrere endotelet i målområde for fremtiden metastasering. Ved å gjøre dette, de etterligner oppførselen til normale leukocytter som de bruker selektin-medierte vandringsveien av leukocytter i inflammasjon [3], [4]. Kalsiumavhengig selectins er sammensatt av et lektin domene, som er ansvarlig for den ligand binding, en epidermal vekstfaktor-lignende domene og et fleksibelt rekke konsensus gjentatte enheter [5], [6]. Kreftceller holder seg på endotelet ved å samhandle med endothelial (E-) og blodplater (P-) selectins [3], [4] Følgende sjelevandring i det underliggende vev og påfølgende spredning (figur 1). I en xenograft modell for human pankreatisk adenokarsinom, fravær av E- og P-selectins førte til 85% reduksjon av peritoneal karsinomatose [7]. En tilsvarende reduksjon av metastase ble iakttatt i en eosinofil og kronisk myelogeneous xenograft modell [8] og en kolorektal karsinom modell i fravær av både selectins [4]. Således blokkerer selektin-medierte adhesjonsmekanismen i hematogenous så vel som i intraperitoneal metastaser er av klinisk betydning, og kan være en potensiell terapeutisk tilnærming mot patofysiologiske hendelser (figur 1). Så langt, monoklonale antistoffer, glycomimetic antagonister [9], og ulike modifiserte aptamerer [10] – [12] har blitt testet som selektinuttrykk hemmere i pre-kliniske studier
metastatisk spredning av kreft skjer via en sekvensiell prosess. som begynner med invasjon av primære tumorceller. Etter å ha krysset basalmembran og migrere gjennom tilstøtende bindevev, visse kreftceller intravasate til kreft microvessels og sirkulere med blodet til fjerne organer. At fremtiden metastatisk nettstedet, er disse sirkulerende tumorceller (CTC) bremset ned fra blodet og holder seg til vaskulær endotel. Dette trinn er avgjørende initiert av interaksjoner mellom endoteliale selektiner og visse karbohydrat-ligander såsom sialyserte Lewis-strukturer ble presentert på tumorcelleoverflaten. Adhesjon er en forutsetning for ekstravasasjon og påfølgende kolonisering av metastatisk vev. Selektin-bindende aptamerer som svekker samspillet mellom selektin ligander og endotelceller selectins ville derfor være en lovende ny anti-metastatisk terapeutisk.
aptamerer er DNA eller RNA oligonukleotider med definerte tredimensjonale strukturer som viser høy affinitet og spesifisitet for målmolekylene. Med hensyn til sine bindende egenskaper, de er sammenlignbare med antistoffer. Fordelene med aptamerer enn antistoffer er (i) sin enkle og rimelige syntese, (ii) muligheten for deres langtidslagring ved romtemperatur og således (iii) deres stabilitet under transport, (iv) de forskjellige mulighetene for konjugering til andre reagenser og (v) deres manglende immunogenisitet [12]. Aptamerer er valgt i en
in vitro
prosess som kalles
S
ystematic
E
volution av
L
igands av
EX
ponential Enrichment (
SELEX
) ved amplifisering av DNA eller RNA-oligonukleotider basert på deres affinitet til et målmolekyl [13] – [15]. Mangfoldet av oligonukleotider som tillater valg av aptamerer for nesten alle målmolekyl. Således, aptamerer er et egnet verktøy for medisinsk anvendelse i diagnose og terapi.
Vi begynte å velge DNA aptamerer med sikte på deres medisinske anvendelse for inhibering av tumormetastase. Vi lyktes i å velge en aptamer med høy affinitet for E- og P-selectin og testet binding til sine mål molekyler via filter oppbevaring analyser (FRA). For å vurdere aptamer evne til å blokkere interaksjonen av kreft og leukemi celler med selektiner, vi brukte laminær strømning assays under fysiologiske skjærspenningsbetingelser, ved anvendelse av human kolorektal kreft cellelinje HT29, human kronisk eosinofil leukemicellelinje EOL-1, og primære humane lunge mikrovaskulære endotelceller (HPMECs). De valgte DNA aptamerer inhiberte interaksjonen av kreftceller med endotelium ved å blokkere deres selektin-mediert adhesjon. Dermed valgte aptamerer gi et attraktivt alternativ til eksisterende sammenlign reagenser.
Materialer og metoder
Oligonukleotider
Den første DNA-biblioteket som brukes for SELEX ble kjøpt fra Metabion. Den besto av en randomisert område på 50 nukleotider flankert av konstante regioner ved 5′- og 3′-enden (21 eller 20 nukleotider, henholdsvis) for å tillate PCR-amplifisering. Ytterligere oligonukleotider ble kjøpt fra Invitrogen.
Biotinylation av E-selektin og Immobilisering på streptavidin-belagte Dynabeads (Target Perler)
For biotinylering reaksjon, 50 mikrogram rekombinant human E-selektin /IgG-Fc -chimeras (rh E-selektin, R Life-teknologi) og suspendert i valg buffer (3 mM MgCl
2 i fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7,5) omfattende en mg bovint serum albumin (BSA) /ml som tidligere beskrevet [16].
Biotin Immobilisering på streptavidin-belagte Dynabeads (forvalg perler)
Streptavidin-belagte magnetiske kuler (5 mg) ble vasket fem ganger med 500 ul vaskebuffer (1 mg BSA /mL PBS), resuspendert i 500 ul PBS inneholdende 0,9 mM biotin, og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. De biotin-streptavidin-belagte magnetiske kuler ble vasket fem ganger med 500 ul vaskebuffer, resuspendert i 1,5 ml PBS, inkludert 1,25 mg BSA /ml og ble deretter anvendt for forhåndsvalg.
In vitro
valg av selektinbindende DNA aptamerer
for
in vitro
utvalg av E-selektin spesifikk DNA aptamerer, vi brukte SELEX prosedyre (figur 2), inkludert et forhåndsvalg skritt for å fjerne streptavidin -binding DNA. For forvalg, 250 pmol av ssDNA biblioteket (5′-GCCTGTTGTGAGCCTCCTAAC- (N)
50-CATGCTTATTCTTGTCTCCC-3 «) ble inkubert med 30 nmol preseleksjon perler i 30 minutter ved romtemperatur. Streptavidin-bindende DNA ble fjernet ved magnetisk separering. Den første seleksjonsrunden ble initiert ved inkubering av forhåndsvalgt DNA-bibliotek med 50 pmol mål perler i 30 minutter ved romtemperatur. Etter fjerning av ikke-bundet DNA ved å vaske med 200 ul utvalg buffer, ble bundet til DNA-eluert i 55 ul vann ved oppvarming av blandingen til 80 ° C i 3 minutter. Eluerte DNA ble amplifisert via PCR ved anvendelse av 1 uM 5′-biotinylerte revers primer (5»-GGGAGACAAGAATAAGCATG-3 «), 1 uM forover primer (5′-GCCTGTTGTGfAGCCTCCTAAC-3»), 1,5 mM MgCl
2, 200 uM dNTP i 1 × PCR buffer B og 0,05 U FIREPol DNA Polymerase per mL (de to sistnevnte kjøpt fra Solis biodyne). Separasjon av enkelt-trådet DNA aptamerer fra dobbelt-trådet PCR-produktene ble gjort ved streptavidin-belagte magnetiske kuler. Derfor, ble PCR-produktene fortynnet 1:02 i 2 x B W buffer. Etter inkubering i 15 minutter ved romtemperatur ble supernatantene fjernet og kulene ble resuspendert i 150 mM NaOH etter inkubasjon i ytterligere 10 minutter ved romtemperatur. De samlede supernatanter, inneholdende enkelt-trådet DNA, ble nøytralisert ved anvendelse av 100 mM HCI og benyttes som start basseng for et utvalg neste runde. Etter inkubasjon av DNA enkelttråder med mål perler mengder vasketrinnene ble hevet fra runde til runde økende stringens.
DNA ble inkubert med immobilisert rh E-selektin på magnetiske kuler (mål perler). Etter vasking og fjerning av ubundet DNA, ble mål-DNA bundet ble eluert og amplifisert via PCR. Den dobbeltkjedet PCR-produkt ble separert i enkeltkjedet DNA og den neste SELEX trinn startet etter denne regenerering. Identifiseringen av aptamerer via kloning og sekvensering av anriket ssDNA bassenget ble utført etter flere SELEX runder (10-20 runder).
Kloning
Isolering av utvalgte aptamerer ble oppnådd ved molekylær TA-kloning. Derfor vektoren pUC19-T (pCR2.1-TOPO; Invitrogen) ble spaltet med XcmI (Thermo Scientific) for å danne 3′-overheng tymidin [17], [18]. Aptamerer ble amplifisert via PCR ved bruk FIREPol DNA Polymerase fremstilling av 5′-adenosin-overheng og ligert med vektoren ved anvendelse av T4 DNA-ligase (Thermo Scientific). DNA fra 50 resulterende kloner ble isolert og sekvensert (GATC-Biotech).
Filter Retention analysen
Filter oppbevaring analyser (FRA) ble benyttet for å bestemme dissosiasjonskonstantene av aptamer selektin interaksjoner. Derfor DNA ble radioaktivt merket med [ $ \\ raster = «RG1» $ –
32P] adenosin-5′-triphosphte (Hartmann Analytic) med T4 polynukleotidkinase (Thermo Scientific) og renset via gel-ekstraksjon fulgt av utfelling isopropanol. For bindingsanalyser, konstante mengder av radioaktivt DNA (mindre enn 1 nM) ble inkubert med økende mengder av tilsvarende proteiner (0-1 uM) i 30 minutter ved romtemperatur i seleksjonsbuffer. Etterpå protein-aptamer kompleksene ble filtrert (Manifold I Dot-BlotSystem, Whatman) ved en pre-ekvilibrert (15 minutter i 0,4 M KOH) nitrocellulosemembran (Whatman) i 5 minutter i demineralisert vann ved romtemperatur og ble deretter vasket i valget buffer. Etter filtrering ble nitrocellulosemembranen tørket og eksponert i 3 timer til en fosfor bildeskjerm (Bio-Rad). For kvantifisering vi brukte ett område-spesifikk binding modell (Antall One-programvaren)
Nuclease-motstand-stabilitet
DNA aptamer ble radioaktivt merket med. [-?
32P] adenosin 5′-triphosphte som beskrevet ovenfor og inkubert med 100 pl komplett medium ved 37 ° C. Etter bestemte tidspunkter (0-720 min), ble 10 mL av hver prøve frosset i flytende nitrogen og deretter analysert via 10% denaturering gel elektroforese.
Cellelinjer og kultur betingelser
Den menneskelige kolorektal kreft cellelinje HT29 (kjøpt fra den europeiske cellekultur samling) og human kronisk eosinofil leukemicellelinje EOL-1 (fra DSMZ) ble opprettholdt i RPMI-1640 supplert med 2 mM L-glutamin, 10% føtalt kalveserum (FCS ), ble 100 pg penicillin /ml og 100 ug streptomycin /ml (sistnevnte reagenser kjøpt fra PAA) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2. For alle analysene ble HT29 celler dyrket inntil 80% sammenflytning; EOL-1-celler ble dyrket i suspensjon. Primære humane lunge mikrovaskulære endotelceller (HPMECs) ble hentet fra Promocell, dyrket i endotelceller vekstmedium MV supplert med tilsvarende supplement blanding som fastsatt av leverandøren, og 100 pg penicillin /ml og 100 ug streptomycin /ml. HPMECs var sub-dyrket ved hjelp av en bestemt løsne kit (PromoCell) i henhold til produsentens instruksjoner. Alle forsøk med primærceller ble utført i løpet av de første seks passasjer.
Hemming av Dynamic Tumor Cell Adhesjon til immobilisert Menneskelig E- og P-selektin
Vi har analysert aptamer hemming av selectin ligand samhandling i henhold laminære strømningsforhold som representerer endothelial skjærspenning funnet i post-kapillære venules av metastatiske organer som lunger [19]. For dette formål ble rh rh E- og P-selektin som er immobilisert på IBIDI behandle microslides VI (IBIDI) ved en sluttkonsentrasjon på 0,02 mg /mL, fortynnet i DPBS inkludert Ca
2 + og Mg
2+ ( DPBS
+; PAA) i 30 minutter ved 37 ° C. I parallell som en kontroll, ble kamre belagt på samme måte med 0,02 mg /ml IgG-Fc (R 0,05 er merket med *, svært signifikante forskjeller (p 0,01) med ** og ekstremt signifikante forskjeller (p 0,001) med ***
Resultater
Utvalg og karakterisering av en E- og P-selektin Specific DNA Aptamer
med sikte på å velge DNA aptamerer som hemmer samspillet mellom menneske E-selectins og deres ligander presenteres på kreftceller, utførte vi SELEX hjelp rekombinant fremstilt human E-selektin fusjonsprotein som mål molekyl. Etter 17 runder med seleksjon, den anrikede DNA pool viste ca 20% binding til rh E-selektin i forhold til den første DNA-basseng (figur 3A), omfattende en dissosiasjonskonstant (
K
d) 170 ± 65 nM. Sekvensanalyser av 50 enkeltrom oligonukleotider avledet fra dette bassenget avdekket ingen sekvens likheter mellom disse oligonukleotider. Men undersøke flere av disse molekylene av filter oppbevaring analyser, identifiserte vi rh E-selektin spesifikk DNA aptamer SDA (5′-GCCTGTTGTGAGCCTCCTAACGATTTGGATTTGGGGTGGAGGGTATGGTTTGTGCTGGCGTTCTCATTTCCCATGCTTATTCTTGTCTCCC-3′) med en
K
d verdi på 98 ± 16 nM (figur 3B).
DNA ble radiomerket, inkubert med økende mengder av proteiner og filtrert gjennom en nitrocellulosemembran. Brøkdeler av bundne DNA ble oppdaget via autoradiografi og kvantifisert. (A) Rekombinant human E-selektin inkuberes med DNA bassenget etter en (▴) og 17 (•) SELEX runder. (B) Aptamer SDA inkubert med rh E-selektin (•,
K
d ≈ 87 nM), rh P-selektin (▪,
K
d ≈ 84 nM) eller streptavidin (▴) som en kontroll. En kontroll DNA gjorde verken binder seg til menneskelig E- (▾) eller P-selektin (♦)
På grunn av sekvens likheter mellom E- og P-selectins [6], [22] -. [ ,,,0],24], testet vi affiniteten av SDA for rekombinant human E-selektin /IgG-Fc-kimærer (rh P-selektin; R 0,001
vs
E-selektin.)
immobilisert rh E- (A. ) eller rh P- (B) selektin (0,2 mM hver), så vel som stimulert HPMECs (C) ble inkubert med 5 uM av SDA eller kontroll-DNA. Selectin ligand-presentere tumorceller ble perfused over immobilisert proteiner eller E-selektin presentere HPMECs (strømningshastighet 8 ml /h) og støtteceller ble telt. SDA redusert vedheft til tilsvarende celler (n = 6 av samlet 2 forskjellige eksperimenter,
P
-verdier brukt til selectins). IgG-Fc kontroll viste ingen adhesjon effekt. Alle
P
verdiene ble beregnet med ubehandlede selectins som standard
(* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001).
for å undersøke om SDA også hemmer EOL-en celle adhesjon til menneskelig P-selectin, immobilisert vi menneskelig P-selektin på kammeret overflate. I laminær analysen, upåvirket EOL-en celle adhesjon til menneskelig P-selectin resulterte i 10,42 ± 3,7 hendelser per minutt (figur 5B). Denne verdien ble redusert til 60% med 6,54 ± 2,2 hendelser per minutt i nærvær av SDA (
P
. 0,05
vs
P-selectin). Ved inkubasjon med kontroll DNA, flyt vedheft EOL-1 celler til P-selectin uendret med 13,00 ± 3,7 hendelser per minutt (
P
. 0,01
vs
SDA).
SDA hemmer HT29 Flow adhesjon til stimulert menneskelig Lunge mikrovaskulære endotelceller
Etter å vise at SDA var i stand til å redusere tumor celle adhesjon ved menneskelig E- og P-selektin-belagte overflater i henhold laminær stress, vi neste undersøkt innflytelsen av SDA på celle-celle interaksjoner. Derfor ble to humane cellelinjer som benyttes: human lunge mikrovaskulære endotelceller (HPMECs) og HT29 celler. Ikke-stimulerte HPMECs ikke til stede E-selektin på deres overflate. Ved TNFa-stimulering, HPMECs produsere E-selektin og presentere det på deres celleoverflaten som åpner for interaksjon med HT29 som har e-selektin ligander SLE
X og SLE
A. Først, ble ikke-stimulerte HPMECs belagt på en mikro-kammer. Adherens av selektin ligand-presenter HT29-celler ble bestemt til å være 1,50 ± 1,3 celler pr minutt (-rh TNFa). Etter E-selektin produksjonen ble indusert ved behandling med rh TNFa i 4 timer før strømningsklebe forsøkene antallet HT29-celler fester seg til HPMECs økt til 23.17 ± 12,7 hendelser per minutt (+ rh TNFa,
P
0,01
vs
stimulert HPMEC).. For å undersøke innflytelsen av SDA på denne celle-celle-interaksjon, ble rh TNFa-stimulert HPMECs inkubert enten med SDA eller kontroll-DNA. Følgende laminær analysen med HT29 celler viste at SDA redusert HT29 vedheft på E-selektin presentere HPMECs betydelig til 45% (10,50 ± 2,1 hendelser /min,
P
. 0,05
vs
stimulert HPMECs). I kontrast, kontroll DNA viste ingen signifikant effekt (19,67 ± 7,7 hendelser /min,
P
0,05
vs SDA
;. Figur 5C).
Diskusjoner
metastaser formasjon er den viktigste kliniske hinder i kreftbehandling [2]. Et økende antall studier viste en avgjørende involvering av E- og P-selektiner i løpet av metastatisk [4], [27], [28]. Derfor selectins fremstå som lovende mål å forstyrre metastasedannelse. For dette formål kan aptamerer være fordelaktige verktøy. Aptamerer er i stand til å binde sitt mål molekylet med høy spesifisitet og affinitet og kan hemme funksjonen av et mål-molekyl. I motsetning til antistoffer, er disse oligonukleotider oppviser temperaturstabilitet så vel som enkel og billig syntese sammen med enkel håndtering. Spesielt DNA aptamerer kan være mer aktuelt da RNA aptamerer om deres lengre halveringstid i serum. Den terapeutiske relevans aptamerer har blitt bevist av tidligere studier [12].
Vi utførte en
in vitro
utvalg for DNA aptamerer binding til E-selektin og identifisert en aptamer, heter
S
electin
D hoteller, NA
A
ptamer (SDA) som består av høye affinitet for både menneskelig E- samt for human P-selectin. For SDA en dissosiasjonskonstant på omtrent 100 nm ble bestemt, noe som dokumenterer den høye affiniteten til bimolecular interaksjonen mellom aptamer og selektin.
På grunn av aminosyresekvens-likheter mellom E- og P-selektin og det samme affinitet for SLE
X og SLE
A, henholdsvis [6], [22], [23], [29], tilsvar affinitet SDA til begge selectins er ikke overraskende.
In vitro
bindingsanalyser viste en nesten lik affinitet av SDA for rekombinant human P- og E-selektin. -Forsøk med murine rekombinante selectins viste at SDA beholdt affiniteten for muse-selektin, så vel som også var ikke uventet på grunn av rekkefølgen analogi mellom humane og murine selectins (data ikke vist). Vi ikke påvise mulig bindingsaffiniteten SDA for L-selektin, på grunn av dens manglende viktighet i den metastaseprosessen. Videre L-selektin virker sammen med andre ligander enn E- eller P-selektin.
Som nevnt ovenfor, nukleinsyrer generelt og spesielt RNA ikke er bemerkelsesverdig stabile i serum på grunn av tilstedeværelsen av forskjellige nukleaser [12] . Å analysere aptamer levedyktighet, utførte vi en stabilitet analysen med radioaktivt merket SDA. Den aptamer viste seg å være stabil i stor utstrekning i fullstendig medium i flere timer. Etter en time omtrent 80% full lengde SDA kunne påvises. Videre er det kjent at aptamerer med en masse på omtrent 40 kDa eller større forblir i omløp i lengre perioder av gangen [30]. Dermed ville vi forvente en lignende oppførsel for våre selectin aptamer med en masse på 30 kDa, som er en forutsetning for enhver
in situ
eller
in vivo
applikasjoner i kommende undersøkelser. Dette tilfellet, og demonstrerte stabiliteten av SDA er oppmuntrende funksjoner for fremtidig vellykkede
in vivo-studier
.
SDA er i stand til å inhibere adhesjonen til e, samt P-selektin, vi hypotese at dette aptamer forstyrrer lektin domener av selectins, som de er ansvarlige for karbohydratbindende [31]. Ved hjelp av dynamisk strømning adhesjonsegenskaper assays, vi først demonstrerte at SDA inhiberte interaksjonen mellom E-selektin og selektin ligand presentere HT29-celler, så vel som interaksjonen mellom P-selektin og selektinbindende EOL-1-celler i fullstendig medium under skjærspenningsbetingelser. Deretter testet vi den hemmende effekten av SDA på samspillet mellom E-selectin presentere HPMECs og selektinbindende HT29 celler. Denne analysen simulerer den naturlige klebeprosessen ganske godt, da den drives under fysiologiske skjærspenningsbetingelser og vi målt en signifikant reduksjon for HT29-adhesjon mediert av SDA på 45%. Dette faktum bekreftet hemmende effektiviteten av denne aptamer og validert sin stabilitet i fullt medium og deretter dens evne til
in vivo
studier.
Så langt vi kjenner til, bare en tio-modifisert DNA aptamer (ESTA-1) er beskrevet i stand i bindings- og blokkerings E-selektin effektivt [32]. Dette, derimot, viste ingen mål bindende i våre hender i filter oppbevaring analyser. Videre to modifisert RNA-aptamerer PF377 [33] og ARC5690 [30] eksistere som binder og blokkere P-selektin. Disse eller andre aptamerer med en hvilken som helst endring i deres sukkerdelen er forholdsvis kostbare å fremstille og derfor mindre egnet for lange tids behandlinger. I tillegg er 2′-fluor modifisert RNA aptamer PF377 begrenset for enhver
in vivo
anvendelse, siden det kan bare behandles med syntetisk PBS å utelate noen nukleaser [33], [34]. Serumet ustabilitet av dette nevnt, og de fleste andre RNA aptamerer er den viktigste årsaken til deres svikt i videre studier.
I forhold til de allerede eksisterende endret aptamerer, har vi valgt en stabil ikke-modifiserte DNA aptamer med hemmende kapasitet på selektin-ligand interaksjoner mellom vaskulærendotelet og kreftceller ved å redusere den innledende og hastighetsbegrensende trinnet under transendothelial migrering av kreftceller.
i tillegg til oligonukleotid-antagonister, alternativ selektin rettet mot hemmere er presentert av et stoff klassen heter glycomimetics. Disse er modifisert oligosakkarider som etterligner naturlige karbohydrater som omfatter evnen til å binde de etterligner karbohydrat ligand. En glycomimetic som blokkerer E-, er P- og L-selektin GMI-1070 [9]. SDA aptamer beskrevet her representerer en ny selektin-inhibitor som kan brukes i kombinasjon med allerede eksisterende andre inhibitorer for å forebygge metastasedannelse.
Konklusjoner
Oppsummert har vi valgt en ikke-modifisert 91 nukleotid lange DNA aptamer, SDA, som viser høy affinitet for human E- og P-selektin med
K
d
verdier på omtrent 100 nM. Dens evne til å inhibere interaksjonen av human kreft og leukemi celler til selektiner selv i et strømningskammer som simulerer blodstrømmen i fysiologisk miljø fremhever SDA som et lovende verktøy for videre
i
vivo
studier. Den generasjonen av mus som bærer tilsvarende menneskelige selectins for de
i
vivo
analyser er en viktig neste steg og gjenstand for dagens eksperimenter.
Takk
takker Katrin Seelhorst for gjennomlesning av manuskriptet.
