Abstract
Mange svulster er stivere enn deres omkringliggende vev. Denne økningen i stivhet er blitt tilskrevet, delvis, til en Rho-avhengig økning av myosin lettkjede II fosforylering. For å karakterisere denne mekanismen videre studerte vi myosin lettkjede-kinase (MLCK), den viktigste enzym som fosforylerer myosin II-lette kjeder. Vi forventet at økninger i MLCK ekspresjon og aktivitet vil bidra til økt stivhet i kreftceller. Vi finner imidlertid at MLCK mRNA og proteinnivåene er vesentlig mindre i kreftceller og vev enn i normale celler. I samsvar med denne observasjonen, matriser kreftceller kontrakt 3D kollagen mye saktere enn normale celler. Interessant, gjorde hemme MLCK eller Rho kinase ikke påvirke 3D gel sammentrekninger mens Blebbistatin delvis og cytokalasin D maksimalt hemmet sammentrekninger. Live-cell imaging celler i kollagen gels viste at cytokalasin D hemmet filopodia-lignende anslag som lå mellom celler mens en MLCK inhibitor hadde ingen effekt på disse anslagene. Disse dataene tyder på at myosin II fosforylering er unnværlig i å regulere de mekaniske egenskapene til svulster
Citation. Yu H-J, Serebryannyy LA, Fry M, Greene M, Chernaya O, Hu W-Y, et al. (2013) Tumor Stivhet er relatert til myosinlettkjedefosfatase Fosforylering i kreftceller. PLoS ONE 8 (11): e79776. doi: 10,1371 /journal.pone.0079776
Redaktør: Michael F Olson, Beatson Institutt for kreftforskning Glasgow, Storbritannia
mottatt: 11 juni 2013; Godkjent: 25 september 2013; Publisert: 04.11.2013
Copyright: © 2013 Yu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Støttet i delvis med tilskudd fra Northwestern University Physical Sciences Oncology Senter (CA143869) sub-prisen til PdeL, fra National Institutes of Health til SG (CA113975), GP (ES018758, ES02207 og CA172220) og ZS (Arra HD044713), leukemi og lymfom Society (White Plains, New York, USA), The American gastroenterologisk forening og UIC Gastrointestinal og leversykdom fond til SG, en Områder i Excellence Award fra kontoret til rektor for forskning, UIC til NM og en American Heart Association fellesskap (13PRE17050060) til LAS. Forfatterne bekrefter at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mange typer tumorer kan oppdages ved palpasjon fordi de er stivere eller hardere enn det omgivende vev. De mekaniske egenskaper av en tumor er bestemt av den kombinerte effekten og interaksjonen mellom flere parametre [1]. Stroma, sammensetningen og stivheten av den ekstracellulære matriks, integrin-ligering, økt vaskularisering, fluidakkumulering og tilstedeværelsen av immunceller, slik som makrofager bidra til den totale stivheten av tumor [1-3]. De fysikalske egenskapene til de transformerte celler, som kan påvirkes av den genetiske signatur av tumorcellene [4] og mikromiljøet [5,6] også spille en rolle i å bestemme tumor stivhet. Cell stivhet bestemmes i hovedsak av aktin-myosin II interaksjoner [7,8]. Det actin-myosin II interaksjon i ikke-muskelceller blir regulert ved fosforylering av myosin lettkjeder (MLC) [9]. Aktin og myosin fosfo-II omfatter den molekylære motor som konverterer ATP til mekanisk arbeid i glatte muskelceller og ikke-muskelceller [9-11] og en økning i MLC fosforyleringen har vært implisert i å bestemme tumor stivhet [1,2].
Det er to hovedveiene som regulerer MLC fosforylering. En reaksjonsvei omfatter myosin lettkjede-kinase (MLCK). MLCK er en kalsium-calmodulin avhengig enzym som fosforylerer den regulatoriske lys kjede av glatt muskulatur og ikke-muskel myosin II [9,10]. I motsetning til andre proteinkinaser som fosforylerer mange substrater, MLC synes å være den eneste substrat for MLCK. MLC fosforylering /defosforylering regulerer kontraksjon av glatt muskulatur [9] og mange andre energiavhengige prosesser, inkludert celledelingen [10] og cellemotilitet [11,12]. Fordi celleproliferasjon og metastatisk kolonisering er to av de mest skadelige aspekter av kreft, er det rimelig å forutsi en viktig rolle for MLCK i tumorvekst og metastatisk kolonisering. Til støtte for denne ide har MLCK vært implisert i celleoverlevelse [13,14] og hemme MLCK er blitt vist å indusere apoptose [13,15], og for å redusere tumorvekst [15]. Redusert MLC fosforylering har også vært innblandet i cytokinese svikt i kreftceller [16].
Den andre veien innebærer Rho A GTPase mediert aktivering av Rho kinase eller ROCK. Mens fosforylering av MLC av ROCK har blitt rapportert, synes ROCK å øke MLC fosforylering hovedsakelig ved å fosforylere og inaktivere en myosin fosfatase [17]. På grunn av at nivået av MLC-fosforylering representerer en balanse mellom de enzymer som fosforylerer og dephosphorylate MLC, inhibering av myosin fosfataser øker det intracellulære nivået av MLC-fosforylering [17]. Rho /ROCK reaksjonsvei spiller en avgjørende rolle i å formidle ekstracellulære signaler som påvirker naturen av cytoskjelettet, spesielt signaler fra den ekstracellulære matriks som resulterer i øket cellespenning [18]. Denne reaksjonsvei er også sentralt i å regulere celle motilitet og kreft metastase [12]. Blokkering ROCK er blitt vist å inhibere tumorvekst og progresjon [2], og, selv om Rho A ikke er et onkogen, en økning i Rho Et uttrykk blir detektert i kreft og Rho A /ROCK reaksjonsveien inngår i Ras-mediert transformasjon [ ,,,0],4].
Dermed er det et vell av data som viser at MLC fosforylering er et samlingspunkt i transformasjonsprosessen, responsen av kreft celler til den ekstracellulære matrise og spredning og migrering av kreftceller. For å forstå betydningen av de to store signalveier som regulerer MLC fosforylering undersøkte vi uttrykket av MLCK i kreftceller. Vår hypotese var en økning i MLCK ekspresjon i kreftceller vil resultere i økt cytoskeletal spenning og cellulære kontraktile responser. Til vår overraskelse, har vi funnet at kreft vev og celler uttrykker mindre MLCK enn sine normale kolleger og normale celler kontrakt 3D kollagen gels raskere enn kreftceller. Videre blokkerer MLCK eller ROCK har ingen effekt på 3D gel sammentrekninger mens Cytochalasin D, som forstyrrer aktin filamenter, blokkert disse sammentrekningene.
Metoder
celler og vev dyrking
Mononuclear celler (MNC) ( 1,077 g /ml) ble oppnådd ved densitets-sentrifugering på Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sverige), som beskrevet tidligere [19]. Humane uterine fibroblaster (HUF celler) ble isolert som tidligere beskrevet [20]. Den følgende humane celler, oppnådd kommersielt (kilde og katalognummer inkludert), ble også brukt: HeLa-livmorhalskreft-celler (ATCC, CCL-2), ECC-1 endometrial epithelial adenokarsinomceller (ATCC, CRL-2923), primær prostata epitelceller (1 ° prostata) fra sykdomsfrie mennesker, LNCaP prostatakreftceller (Lonza, CC-25555), HCT116 tykktarmskreftceller (ATCC, CCL-247), MCF10A ikke-transform mammary epitelceller (ATCC, CRL-10317), MCF-7 (ATCC, HTB-22) og T47D (ATCC, CRL-2865) mammary kreft celler, H520 plateepitel lungekreft celler (ATCC, HTB-182), Hec-1A livmor adenokarcinomceller (ATCC, HTB-113), HEK293T udødelignyreceller (ATCC, CRL-11268), Beas-2B transformert lunge bronkiale epitelceller (ATCC, CRL-9609), humane umbilikalvene endotelceller (HUVEC) (Lonza, CC-2517), humane lungearterien endotelceller ( HPAEC) (Lonza, CC-2530), humane normale lungearterien glatte muskelceller (HPASMC) (Lonza, CC-2581) og humane normale lunge microvasculature endotelceller (HLMEC) (Lonza, CC-2527). Vi brukte MCF10A og Beas-2B celler som kontroller fordi, mens de vokser kontinuerlig i kultur, har de ikke danne svulster når injisert i immunsvikt mus [21,22]. Fem par humane kreft vev (blære, tykktarm, lunge, eggstokk, og livmor) og omgivende normalt vev ble oppnådd fra den samarbeidende humant vev Network, Midwest Division (Columbus, OH) og lagret frosset ved flytende nitrogen. Hvert par av vev var fra samme pasient.
RNA Isolation og PCR
Total RNA ble isolert fra celler og vev ved hjelp Trizol som anbefalt av produsenten (Invitrogen, Carlsbad, California). RNA ble revers transkribert med Superscript III revers transkriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA) og RT-PCR ble utført ved anvendelse av 2 pl av cDNA og 0,5 pM hver, av de 3bf forover primer og den 3aR bakover primeren som er beskrevet av Brand-Arpon m.fl. . [23]. Kvantitativ PCR ble utført ved hjelp av SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) i henhold til produsentens anvisninger. De primere for total MLCK P4610 (5 «AGG AGC CCG AGG TTG ATT AC 3») og R4762 (5 «ACT TCC CTG CCC AGA CTT TT 3») mål eksoner 26 og 27. spesifisitet primere ble validert av en dissosiasjonskurve analyse og folden endringen i ekspresjon av hvert gen ble beregnet ved anvendelse av ΔΔCt metoden, med H3F3A som en intern kontroll.
Western Blot analyse
Deler av hver av de frosne tumor og normalt vev var skåret ut mens frosset, homogenisert i 10X vekt /volum varm SDS-prøvebuffer og oppvarmet i et kokende vannbad i 5 min. Supernatantene ble oppsamlet ved sentrifugering, og 10 ul av hver prøve ble påført på 4-20% polyakrylamid gradient SDS-geler og overført til nitrocellulose. Den øverste halvdel av hver Blottet ble probet med kanin, affinitetsrenset antistoff mot MLCK [24] og bunnen ble probet med et antistoff til GAPDH. Celler ble høstet, suspendert i PBS, inkubert med 2 mM diisopropylfluorophosphate i 10 minutter ved romtemperatur og ble ekstrahert på 9M urea, 50 mM DTT, 50 mM Tris, pH 6,8. Supernatantene ble oppsamlet ved sentrifugering ble proteinkonsentrasjonen bestemt ved hjelp av en Bradford-analysen og 10 ug protein per prøve ble påført på 4-20% polyakrylamid gradient SDS-geler og overført til nitrocellulose.
Måling av MLC Fosforylering
MLC fosforylering ble kvantifisert i HUF og HeLa celler ved hjelp av urea /glyserol geleer som beskrevet av Chew et al. [25] med små modifikasjoner. Celler ble behandlet med inhibitorer i 2 timer, vasket i isotonisk sukrose 2X og ekstrahert i 9 M urea, 5 mM DTT, 20 mM Tris, pH 6,8. Supernatantene ble samlet opp ved sentrifugering, proteinkonsentrasjonen ble bestemt, og 100 ug av HUF celleekstrakt og 225 ug av HeLa celleekstrakt ble separert ved anvendelse av glycerol-urea PAGE. Proteinene ble overført til nitrocellulose, ble un- og fosforylerte former av MLC identifisert ved anvendelse av et antistoff mot MLC og støkiometrien av fosforylering (mol PO
4 /mol MLC
20) ble beregnet som tidligere beskrevet [26] .
collagen gel Contraction analysen and Drug Treatment
For å forberede kollagen gel løsning, cellevekst medium ble supplert med 1 mg /ml kollagen type 1 rotte hale collage (BD Biosciences), nøytralisert med 1 N NaOH til pH 7,5 og bufret med 10 mM HEPES, ble kombinert med vevskultur-medier og holdt på is. Celler ble samlet opp, tellet og 5×10
5-celler ble resuspendert i 200 ul kollagen-oppløsning og anvendt på individuelle brønner i en 48-brønns plate (Fisher Scientific, Pittsburg, PA). Gelene ble inkubert ved 37 ° C i en CO
2 inkubator i 15-20 min inntil de størkner og deretter frigjøres fra veggene i brønnene med pipettespissene. Vekstmedium (200 ul) ble tilsatt til hver brønn og gelene ble tillatt å kontakte i 18 timer eller som angitt. Alle ble gelene fotografert før og etter sammentrekning. Områdene av gelene ble målt i bilde J og prosentandelen av gelen størrelse etter sammentrekning, normalisert til tverrsnittsarealet av brønnen, ble beregnet.
medikamentell behandling av kollagen celler
ML-7, Y 27632 og Blebbistatin ble kjøpt fra EMD Biosciences og cytokalasin D ble kjøpt fra Enzo miljø- og biovitenskap. Legemidler ble fortynnet i vekstmedium og tilsatt til gelene. Medikamentkonsentrasjoner ble beregnet basert på det totale volum av media og collagen-gel. Ubehandlede celler og celler behandlet med DMSO ble anvendt som kontroller.
Live-Cell avbildning av 3D Collagen Gel
HeLa-celler ble transient transfektert ved elektroporering ved anvendelse av en BioRad Gene Pulser Xcell med enten med pLL7. 0 mCherry-LifeAct (gave av Dr. Robert Wysolmasky) eller pEGFP-LifeAct (gave fra Alexander Bershadsky), som binder seg til F-aktin [27]. I korthet ble en 10 cm skål av 95% konfluente HeLa-celler trypsinisert og resuspendert i 10 ml vekstmedier. Cellene ble spunnet ned ved 2000 xg i 5 minutter og resuspendert i 400 ul Opti-MEM® I redusert serummedium supplert med 4 ul av 1 M Hepes, 1 ug av enten LifeAct plasmid og 10ug av skjærbehandlet laksesperm DNA. Electroporation ble gjort i en 4 mm kyvette (BioRad med følgende innstilling (Spenning = 240 V, kapasitans = 950uF, motstand = ∞) A 1:. 1 ratio på mCherry-LifeAct og EGFP-LifeAct transfekterte HeLa-celler ble blandet sammen og en totalt 2,5 x 106 celler ble blandet med 1 ml 1 mg /ml kollagen [28]. kollagen-celler løsning ble tilsatt til brønnen til en glassbunn matte Tek avbildning tallerken (P35G-1,5-14-C), størknet for 20 minutter ved romtemperatur og 2 ml vekstmedium ble tilsatt for å dekke celle gelmatriks og plassert i 5% CO2-inkubator. egnede inhibitorer ble tilsatt til mediet, og cellene ble avbildes på Nikon A1 laserskanning konfokalt mikroskop, ved hjelp av Apo 100×1. 45 NA objektiv, utstyrt med Tokai miljøkammeret.
Etikk erklæringen
vev ble hentet fra Cooperative menneskelig vev Network, Midwest Division (The Ohio State University, Columbus, OH), en NCI finansiert vev repository (https://htrn.osu.edu). Andre forskere kan ha mottatt prøver fra de samme fagene. Menneskelig navlestrengsblod ble hentet fra New York Blood senter (New York, NY, http: /nybloodcenter.org) i henhold til Institutional Review Board (IRB) retningslinjer. Protokoller for isolering av humant CB CD34 + celler av NM ble godkjent av IRB ved University of Illinois i Chicago. HUF celler ble isolert fra decidua peritalis dissekert fra placenta membranene etter normal vaginal fødsel ved termin av ZS med forhåndsgodkjenning fra IRB ved University of Illinois i Chicago. Ingen dyr ble brukt.
Resultater
Mylk genet ligger på kromosom 3q21 (GenBank tilgangsnummeret U48959) hos mennesker. De Mylk genet spenn 272 kb, inneholder minst 34 eksoner og koder for 3 proteiner [29]: nmMLCK (~ 210 kD), smMLCK (~ 150 kD) og et lite protein kalt telokin. Menneskelig nmMLCK og smMLCK er transkribert av eksoner 1-34 [23] og 18-34 [30], henholdsvis. Analyse av exon-intron struktur i det humane genet Mylk har avdekket spleisevarianter av nmMLCK som har unike lokaliseringsmønster i epitel-celler [30]. Minst fire ikke-muskel MLCK isoformer (MLCK2, 3a, 3b og 4), som er et resultat av alternativt spleisede varianter av et mRNA-forløper, er blitt beskrevet [31]. I motsetning til dette, smMLCK, som kodes for av eksonene 18-34 [29], er uttrykt hovedsakelig i glatte muskelceller og lave nivåer av smMLCK detekteres i epitel og endotel-celler (se nedenfor). Selv smMLCK og nmMLCK er strukturelt forskjellige, både tilsynelatende bare phosphorylate regulerings lys kjede av glatt muskulatur og ikke-muskel myosin II [9].
Vi brukte primere beskrevet av Brand-Arpon et al. [23] for å analysere ekspresjon av Mylk i humane vev og celler. Vi har fått vev fra menneskelige svulster og omkringliggende vev, slik at vi kan sammenligne uttrykket av Mylk. Kvantitativ PCR, ved hjelp av primere som er rettet mot sekvenser i eksoner 26 og 27 og gjenkjenne alle former for MLCK, avslørte MLCK mRNA nivåer er markert redusert i blære, tykktarm, lunge, eggstokk og livmor kreft vev sammenlignet med normalt vev (figur 1A). Tilsvarende qPCR på et bredt spekter av normal human (human livmor fibroblaster, endotelceller, prostata epitel og mononukleære celler), ikke-transformerte eller transformerte celler viste også lavere nivåer av total MLCK mRNA (figur 2A) i kreftceller. Dataene i figur 2A ble normalisert til nivået av Mylk ekspresjon i HeLa-celler. De fleste normale celler (HUF, HPAEC, HUVEC, 1 ° prostata) og ikke-tumorigen Beas-2B-celler er over, mens de fleste kreftceller, med unntak av ECC-1-celler, er under nivået for Mylk ekspresjon i HeLa-celler.
Kvantitativ PCR (A) og western blot (B) analyser av normale og kreftvev. RNA ble isolert fra forskjellige normale og kreft vev og total MLCK (A), inkludert alle spleisevarianter av nmMLCK og smMLCK, ble detektert ved å anvende primere målrettet mot eksoner 26 og 27. Genet for H3F3A ble anvendt som en intern kontroll i alle forsøkene. Dataene i Panel A viser gjennomsnitt av qPCR analyser utført i tre eksemplarer og feil linjer viser standardavvik. Panel B viser en Western blot-analyse ved bruk av affinitet-renset antistoff mot MLCK. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting.
Kvantitativ PCR for å påvise total MLCK (A) og western blot (B) analyser av normale og kreftceller i kultur. RNA og protein ble isolert fra forskjellige celler og analysert som beskrevet i figur 1. Dataene i felt A viser gjennomsnitt av qPCR analyser utført in triplo.
neste bestemmes om proteinekspresjon korrelert med mRNA-nivåer . MLCK protein ekspresjon i normale og kreft vev og celler ble bestemt ved å utføre Western blot ved hjelp av en affinitets-renset antistoff mot MLCK [24]. Normal blære, tykktarm og livmor vev uttrykte både ikke-muskel og glatte muskelceller isoformer av MLCK mens normal lungevev bare uttrykt smMLCK (figur 1C). Jevnt, alle av kreftvev i hovedsak uttrykt smMLCK og nmMLCK var vanskelig å visualisere i disse vevene. Interessant, mønsteret av MLCK protein ekspresjon er svært like i normale og lungekreft vev, selv om nivået av mRNA reduseres i lungekreft vev (figur 1). Analyse av vev kultur celler viste at menneske livmor fibroblaster (HUF celler) uttrykker store mengder begge former for MLCK mens menneske ikke-muskelceller (endotelceller, epithelial og ledningen blod mononukleære celler) uttrykker det meste større, nmMLCK (figur 2B). Uttrykket mønster i kreftceller, er imidlertid kompleks. Kreftceller (HeLa livmorhalskreftceller, T47D brystkreftceller, LNCaP prostatakreftceller og HL60 promyelocytic celler), uttrykker smMLCK. Interessant var økningen i smMLCK ekspresjon i kreftceller ser ut til å følge en reduksjon i ekspresjonen av nmMLCK i forhold til deres normale motstykker (f.eks sammenligne LNCaP og 1 ° prostata). I samsvar med den PCR-data, fremgår det av figur 2B at det totale nivå av MLCK uttrykk er redusert i kreftceller sammenlignet med kontrollen. (Ie: normale celler)
Vi har undersøkt de funksjonelle konsekvenser av redusert MLCK uttrykk ved å dyrke normale celler og kreftceller i 3D-gels og sammenligne deres evne til å trekke sammen gels. Flytende kollagen som inneholder like mange celler ble påført på 24-brønners skåler og tillatt å herde ved 37 ° C. De ble deretter gitt ut fra sidene av brønnene og fotografert ved definerte intervaller. Figur 3 viser at HUF og 1 ° prostata celler kontrakt gels raskt. Økning av kollagen-konsentrasjonen til 2 mg /ml minsket hastighet og grad av sammentrekning og 3 mg /ml forhindres kontraksjon (figur S1). HeLa celler og MCF10A celler kontrakt gels til middels nivå, mens MCF7 T47D og LNCaP celler knapt kontrakt gels (figur 3 og figur S1).
HeLa, LNCaP, MCF7-, MCF10A, HUF og primær prostata celler ble sådd i 24 brønners skåler i flytende kollagen. Etter kollagen herdet, ble gelene frigjort fra sidene av brønnene og tillatt å trekke seg sammen i 24 timer. Brønnene ble fotografert ovenfra på klokkeslettene. Legg merke til at HUF og primære prostataceller trekke seg sammen gelene i større grad enn HeLa og LNCaP-celler og at MCF 10A celler kontrakt mer enn MCF-7-celler. Scale bar = 2 mm.
Vi deretter undersøkt om riene kan bli blokkert av små molekyl hemmere av cytoskjelettet. Vi studerte HUF og HeLa celler fordi de innleide gels. Celler ble behandlet med ML-7, en MLCK inhibitor [32], Y27632, en Rho-kinase-inhibitor [33], blebbstatin, en myosin II-inhibitor [34] og cytokalasin D, som blokkerer aktin polymerisasjon [35]. ML-7 hadde ingen virkning på kontraksjon av geler inneholdende HUF eller HeLa-celler (figur 4). Y27632 og Blebbistatin hadde minimal, om enn statistisk signifikante, effekter på sammentrekning av gels som inneholder HUF celler. Y27632 har ikke en statistisk signifikant effekt på HeLa celle sammentrekning mens Blebbistatin hadde en mer uttalt, statistisk signifikant effekt på geler fremstilt av HeLa-celler. Interessant, cytokalasin D hadde mest uttalt effekt på gel sammentrekninger og nesten fullstendig hemmet sammentrekninger av både celletyper (figur 4). Vaske ut den cytokalasin D resulterte i en hurtig sammentrekning av geler ved begge celletyper (ikke vist).
HUF (til venstre) og HeLa (høyre) celler ble dyrket i 3D-kulturer og behandlet med inhibitorer som beskrevet. Gelene ble fotografert 24 timer senere og overflatearealet av de enkelte geler ble kvantifisert. Dataene representerer middelverdi + SEM. En måte ANOVA * = p verdi 0.05, *** = p verdi 0,001.
For å fastslå at ML-7 og Y27632 var faktisk hemme MLCK og Rho kinase og mink MLC fosforylering, brukte vi glyserol gels å kvantifisere endringer i MLC20 fosforylering. De viste at MLC20 fosforylering er redusert i HeLa celle sammenlignet med HUF celler, og at ML-7 og Y27632 reduksjon MLC20 fosforylering (figur 5). Overraskende, Blebbistatin og cytokalasin D også redusere MLC20 fosforylering noe.
fosforylert og ufosforylerte MLC ble atskilt med urea-glycerol gel elektroforese, blottet til nitrocellulose og identifisert ved hjelp av et antistoff 20 kD MLC.
Vi brukte også levende celle bildebehandling for å observere cellene innenfor gels. Disse geler ble ikke frigjort fra siden av brønnene fordi bevegelse introdusert av sammentrekning av gelen gjorde det umulig å avbilde celler. Figur 6 og filmen S1 viser at ubehandlet celle er godt spredt og utvide filopodia, som er rike på aktin, som nå ut og berøre hverandre. Celler behandlet med ML-7 eller Y27632 forble spre seg og fortsatte å forlenge filopodia. Celler behandlet med cytokalasin D forble spredt og utvidet mye større, pseudopodia-lignende strukturer heller enn filopodia. Viktigere, aktin i disse cellene så ut til å smelte sammen til større aggregater inne i cellene.
HeLa-celler ble transfektert med Lifeact mCherry (rød) eller Lifeact-GFP og dyrket i kollagen-geler. Disse geler ble ikke frigjort fra veggene i brønnene for å hindre bevegelsesartifakter. Panel A viser kontroll (ubehandlet) celler som strekker filapodia den kontakten naboceller (også se film i Figur S2). Paneler B C viser celler som ble behandlet med 20 uM ML-7 (b) eller 6 pM cytokalasin D (C). Celler behandlet med ML-7 fortsette å aktivt forlenge filopodia. Celler behandlet med cytokalasin D stoppe strekker filopodia og aktin i disse cellene ser ut til å samle seg i store aggregater. De innfellinger er blow ups av eske områder. Størrelse bar = 10 mikrometer.
Diskusjoner
Svulster kan palperes fordi de føler seg vanskeligere enn det omkringliggende vev og mange faktorer, som beskrevet i innledningen, kan bidra til stivhet en svulst. En av disse faktorene er den kontraktile tilstand av kreftceller i en tumor. En av våre viktigste forutsetningene da vi begynte disse studiene var at kreftceller ville up-regulere deler av kontraktile apparat. Dette var basert på rapporter som actomyosin kontraktilitet [2] og uttrykk for Rho proteiner [4], myosin II [36,37] og MLCK [38] er økt i humane svulster i forhold til normale kontroller. I tillegg, når kreftceller spre de har å gjøre sin vei gjennom en skog av kollagenfibre, og det er rimelig at de ville trenge mer aktivert kontraktile proteiner for å presse gjennom den ekstracellulære matrise.
Men en nærmere undersøkelse av litteraturen foreslår ellers. Eksperimenter med trekkraft mikros ha funnet en invers sammenheng mellom styrkeproduksjon og metastatisk kapasitet [39]. Mekanisk fenotyping ved hjelp av atomkraftmikroskopi [40-42] og andre metoder [43,44] har konsekvent vist at kreftceller er mykere enn normale celler. Dessuten har en fersk studie antydet at redusert stivhet kan forbedre overlevelse av kreftceller i sirkulasjonen [45]. Vi har tidligere vist at over-uttrykker en aktiv form av MLCK øker MLC fosforylering og stivhet i fibroblaster [46]. Således vår observasjon av en reduksjon i MLCK uttrykk er meget forenlig med en reduksjon i stivheten i transformerte celler rapportert av andre laboratorier [39-44].
Figur 2 viser at MLCK ekspresjon er redusert hos tumorceller dyrket i kultur. Ikke desto mindre, svulster er ikke homogen, og i tillegg til tumorceller, inneholde immunceller, myofibroblasts og andre typer av stromale celler som kunne ha økt MLCK nivå og derved bidrar til den totale stivheten av tumoren. Imidlertid ble tumorvev analysert på figur 1, og dataene reflekterer bidragene fra alle celletyper innen hver tumor. Selv om dataene viser tydelig reduksjon i MLCK uttrykk i forhold til det omgivende normale vev, kan vi ikke eliminere muligheten av at økte kontraktilitet av ikke-tumor-celler bidrar til stivheten av svulster. En tilnærming for å ta opp denne mulighet er å flekke tumorvev med antistoffer mot MLCK og for å kvantifisere nivået av fargingen i kreftceller i forhold til omgivende normalt vev og ikke-kreftceller i massen av tumoren. Vi er for tiden å etablere metoder for å utføre slike eksperimenter.
Mekanismen ansvarlig for å nedregulere MLCK uttrykk i kreftceller er ikke klart. Brand-Arpon et al. [23] har rapportert tilstedeværelse av en pseudogen (pMYLK) på kromosom plassering 3p21 bare funnet hos mennesker, sjimpanser, gorillaer og orangutanger, men ikke Gibbons eller bavianer eller andre arter. De viste også at den pMYLK inneholder en 73 bp delesjon og brukt PCR for å skille mellom ekspresjonen av Mylk (667 bp) og pMYLK (594 bp). Bruke samme primere, Han et al. [47] har rapportert at uttrykket av pMYLK økes i kreftceller og økningen i uttrykket av pMYLK er ansvarlig for redusert uttrykk for MLCK. Vi brukte de samme primerne for å analysere ekspresjon av MLCK og pMYLK i humane vev og celler. Mens vi tydelig se en nedgang i MLCK mRNA og protein uttrykk i kreftceller og vev, var vi ikke i stand til å konsekvent oppdage pMYLK uttrykk i kreftceller eller fravær av uttrykk i normale celler. Følgelig regulering av MLCK uttrykk i transformerte celler er fortsatt uklart for tiden.
observasjon at 3D-gel trekningene ikke er blokkert av ML-7 og Y27632 garanterer også kommentar. En økning i MLC-fosforylering er essensielt for aktivering av actin- aktiverte ATPase-aktiviteten av glatte muskelceller og ikke-muskel myosins [9-11]. Den delvise inhibering av Blebbistatin antyder at myosin II tverrbroer spille en rolle i disse sammentrekninger. Men den manglende evne av ML-7 og Y27632 for å blokkere disse sammentrekninger tyder på at fosforylering MLC er unnværlig. I kontrast, aktin dynamikk synes å spille en sentral rolle i 3D gel sammentrekninger. Denne observasjonen er i overensstemmelse med rapporten at avbrudd av aktin cytoskjelettet blokkerer alle typer av kollagen gel kontraksjoner [48]. Videre, den mest fremtredende på live-cell imaging av celler i kollagen gels (figur 6) er tilstedeværelsen av svært dynamisk aktin filopodia. Vonna et al. [49] har studert patogen fangst av makrofager og anslått at filopodia kan generere hundrevis av pN av makt enn 10 mikrometer avstander. En annen studie karakteriseres filopodia som «fagocyterende tentakler» som trekkes partikler mot cellen kroppen [50]. Disse forfatterne fant trinnstørrelsen av kontraksjonene var 36 + 13 nm, noe som utelukker myosin II som mulig Motoren [50]. Selv om de ikke var i stand til å implisere noen myosin i filopodial tilbaketrekking, depolymerisering av aktin filamenter med latrunculin A også blokkert filopodial trekningene [50]. Til sammen litteraturen og våre data tyder på at 3D kollagen gel sammentrekninger blir formidlet av aktin via filopodia uavhengig av myosin II.
I sammendraget, våre data utvetydig viser at MLCK uttrykk, MLC fosforylering og 3D gel sammentrekning er lavere i kreftceller og vev enn i deres normale motstykker. Videre finner vi at avtagende MLC fosforylering, ved å hemme MLCK eller rho kinase, har ingen effekt på 3D-gel sammentrekninger av normale eller transformerte celler. I motsetning til dette inhiberer myosin II hadde en delvis effekt og depolymerisering av aktin praktisk talt opphevet sammentrekning. Videre foreslo levende celle bildebehandling som filopodia spille en sentral rolle i 3D sammentrekninger. Disse dataene antyder sterkt at svulsten stivhet, det underliggende grunnlaget for selv påvisning av svulster, er uavhengig av myosin II fosforylering. Våre observasjoner er i overensstemmelse med nyere studier som har vist at kreftceller er mindre stiv enn ikke-transformerte celler [40-44]. Til slutt har vi tidligere har vist at inhibering av MLCK induserer apoptose in vitro og potenserer effekten av anticancermedikamenter til å indusere apoptose og hemmer tumorvekst in vivo [17]. Vår nåværende demonstrasjon som MLCK uttrykk er redusert i tumorceller antyder en måls vindu for spesifikt å indusere apoptose i kreftceller og provoserer videre undersøkelser av MLCK som et potensielt terapeutisk mål.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Oppsummering av kollagen gel sammentrekning analyser. Gelene ble inkubert i 24 timer, fotografert ovenfra og overflatearealet beregnes som beskrevet i metodene. Panel A viser at HUF og primær prostata celler kontrakt gels mer enn HeLa og LNCaP celler. MCF10A brystkreft celler også kontrakt gels flere enn de mer aggressive MCF7 og T47D kreftceller.
