Abstract
Prostatakreft er den vanligste diagnosen kreft påvirker en i seks menn i USA. Forståelsen av den molekylære basis av prostatakreft progresjon kan tjene som et verktøy for tidlig diagnose og utviklingen av nye behandlingsstrategier for denne sykdommen. Protein Kinase D1 (PKD1) er en multifunksjonell kinase som er sterkt uttrykt i normal prostata. Den reduserte ekspresjon av PKD1 har vært forbundet med progresjon av prostata kreft. Derfor kan syntetiske eller naturlige produkter som regulerer denne signalveien tjene som nye terapeutiske modaliteter for prostatakreft forebygging og behandling. Curcumin, den aktive ingrediensen i gurkemeie, har vist anti-kreft egenskaper via modulering av en rekke forskjellige molekyl veier. Heri, har vi vist at curcumin aktiverer PKD1, noe som resulterer i endringer i β-catenin signal ved å hemme kjernefysisk β-catenin transkripsjon aktivitet og øke nivåene av membran β-catenin i prostatakreftceller. Modulering av disse cellulære hendelser ved curcumin korrelerte med redusert celleproliferasjon, cellekolonidannelse og motilitet og forbedret celle-celle-aggregering i prostatakreftceller. I tillegg har vi også vist at inhibering av celle motilitet av curcumin er formidlet ved å redusere nivåene av aktivt cofilin, en nedstrøms mål for PKD1. De potente anti-kreft effekt av curcumin
in vitro
ble også reflektert i en prostatakreft xenograft mus modell.
in vivo
hemming av tumorvekst også korrelert med forbedret membran lokalisering av β-catenin. Samlet sett våre funn her har avdekket en roman molekylære mekanismen av curcumin handling via aktivering av PKD1 i prostatakreftceller
Citation. Sundram V, Chauhan SC, Ebeling M, Jaggi M (2012) Curcumin demper β- catenin signale i prostata kreft celler gjennom aktivering av protein kinase D1. PLoS ONE 7 (4): e35368. doi: 10,1371 /journal.pone.0035368
Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan
mottatt: 04.10.2011; Godkjent: 15 mars 2012; Publisert: 16 april 2012
Copyright: © 2012 Sundram et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble støttet av Cobre Grant (P20 RR024219) fra NIH (https://www.ncrr.nih.gov/) og med tilskudd fra det amerikanske forsvarsdepartementet (DOD) (https://cdmrp.army.mil/) til MJ (DOD PC073643) og til SCC (DOD PC073887). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
Prostatakreft er den nest største årsaken til død og den vanligste diagnosen kreft hos menn i USA [1]. Risikoen for prostatakreft øker eksponensielt etter fylte 50. Derfor er prostatakreft posisjonert til å bli en større utfordring i årene som kommer som følge av en generell økning i levealder. Selv om etiologien av prostatakreft ikke er godt forstått, både genetiske og miljømessige faktorer som ser ut til å spille en viktig rolle i utviklingen av sykdommen. En felles førstelinjestrategi for behandling av prostatakreft omfatter kirurgisk eller medikamentell kastrering gjennom androgen ablasjon terapi. Mens androgen ablasjon terapi er effektiv under innledende stadier av sykdommen, utvikler kreft raskt til en androgen uavhengig trinn hvor det ingen kjent effektiv terapi er for tiden tilgjengelig. Derfor forståelsen av den molekylære basis for sykdommen er svært ønskelig for å utvikle nyere strategier for forebyggelse og behandling av prostatacancer.
Protein Kinase D1 (PKD1) er en evolusjonært konservert, ubikvitært uttrykt serin-treonin-kinase som spiller en sentral rolle i regulering av en rekke cellefunksjoner, inkludert celleoverlevelse, proliferasjon, motilitet og invasjon [2] – [8].
PKD1
genet er uttrykt i mange organer med det høyeste uttrykk dokumentert i prostata og testikler kjønnsceller [3], [9], [10]. PKD1 oppviser en kombinasjon av strukturelle og funksjonelle trekk ved både den PKC familien (diacyl glycerol og forbolester bindende strukturelle domener) og den CaMK familien (strukturell homologi av kinase-domenet og substrat og inhibitor spesifisitet). Derfor er det en unik posisjon inne i signaltransduksjon kaskade for integrering av signaleringsinformasjon fra eksterne stimuli og konverterer dem til intracellulær respons ved å modulere forskjellige nedstrøms trasé [2]. Således dereguleringen av PKD1 påvirker flere signalveier, noe som resulterer i kroniske sykdommer som kreft [2]. Tidligere arbeid fra vårt laboratorium har implisert en avgjørende rolle for PKD1 i prostata kreft [11]. Vårt arbeid har vist evne til å inhibere PKD1 funksjoner av β-catenin i prostatakreft [12]. I tillegg har PKD1 blitt vist å interagere med og modulere funksjoner av E-cadherin, androgen reseptor og MAPKinase signalveier [13] – [18]. PKD1 hemmer også celle motilitet ved direkte interaksjon med og modulering av funksjoner av et antall proteiner som er involvert i aktin remodeling, inkludert slynge skudd fosfatase (SSH1L) og cortactin [19] – [23]. Videre er PKD1 kjent for å være involvert i å hemme invasjon, metastase og epitelial-mesenchymale overgang (EMT) av kreftceller ved å regulere ekspresjonen av matriks-metalloproteinaser (MMP) [24], [25] og funksjonene til sneglen transkripsjonsfaktor [26 ], respektivt. Derfor kan molekyler som modulerer PKD1 ekspresjon eller aktivitet spiller en viktig rolle i forebygging og eller behandling av prostatakreft.
Curcumin (figur 1 A), den aktive bestanddel av gurkemeie, er et ikke-toksisk, diferuloyl metan forbindelse som har potent anti-proliferative, anti-inflammatorisk og anti-oksyderende egenskaper [27], [28]. Begge
in vivo Hotell og
in vitro
studier har vist evne til curcumin til effektivt å hemme kreft vekst [29] – [31]. Dette potent anti-kreft egenskap av curcumin er relatert til dens evne til samtidig å modulere funksjoner av et antall forskjellige molekylære reaksjonsveier inkludert MAPK, EGFR og NFkB trasé [32]. I tillegg er curcumin regulerer også atom β-catenin /T-celle-faktor (TCF) transkripsjonen aktivitet. Imidlertid er de presise molekylære mekanismene for curcumin mediert undertrykkelse av β-catenin transkripsjonen aktivitet ikke fullt ut forstått.
A). Kjemisk struktur av curcumin. B). Effekt av curcumin på proliferasjon av forskjellige prostata kreftcellelinjer. LNCaP, c4-2, DU145 og PC3 celle ble behandlet med curcumin eller bærerkontroll DMSO i 48 timer og celleformering ble bestemt ved bruk av MTS-analyse. Den prosentvise celleformering ble beregnet ved normalisering av den spredning av curcumin behandlede celler med spredning av kontroll behandlede celler. Konsentrasjonsavhengig inhibering i celleproliferasjon ble observert med curcumin behandling. Gjennomsnitt ± SE; n = 3; * P. 0,05
I denne studien har vi avdekket effekten av curcumin på PKD1 aktivering. Curcumin mediert PKD1 aktivering trykt kjernefysisk β-catenin /TCF transkripsjon aktivitet og hemmet veksten av prostatakreft i cellelinje og xenograft dyremodell. Aktivering av PKD1 også forbedret celle-celle aggregering og hemmet cellemotilitet funksjoner
via
anrikning av membran β-catenin og hemming av cofilin aktivitet. Totalt sett har vi avdekket en roman molekylære signalveien reguleres av curcumin for å dempe prostatakreft vekst.
Resultater
Curcumin hemmer prostatakreft celleproliferasjon
deregulert celleproliferasjon er et kjennetegn av kreftceller. For å bestemme den anti-proliferative aktivitet av curcumin (figur 1A), et panel av prostatacancercellelinjer (tidlig passasje androgen følsomme LNCaP, androgen-uavhengig c4-2, PC3 og DU145) ble behandlet med varierende konsentrasjoner av curcumin i 48 h og vurderes for celledeling. Curcumin behandling utviste doseavhengig hemming av celleproliferasjon i alle de forskjellige prostatakreftceller (figur 1B). Den paret prostatakreft cellelinje system LNCaP (androgen bokstaver) og c4-2 celler (LNCaP avledet, androgen-uavhengig) ble brukt for videre studier.
Curcumin aktiverer PKD1
PKD1 er nødvendig for normal fysiologi av prostataceller og dens nedregulering er forbundet med progresjon av prostata kreft. Derfor kan ikke-toksiske, naturlige forbindelser som oppregulerer ekspresjonen eller aktiviteten av PKD1 hjelp ved forhindring og eller behandling av prostatakreft. For å bestemme om curcumin kan modulere ekspresjon eller aktivitet av PKD1, ble androgen-uavhengig prostatacancer c4-2-celler behandlet med curcumin for varierende tidspunkter, og ekspresjon av total PKD1 (figur 2A) og aktiv PKD1 (figur 2B) ble fastsatt ved hjelp PKD1 og fosfor PKD1 antistoff antistoffer. Selv om ingen markert endring i det totale PKD1 nivået ble påvist etter behandling curcumin (figur 2A), curcumin behandling betydelig forbedret ekspresjon av aktivt PKD1 innen 1 time av behandlingen (figur 2B og fig S1A). Lignende resultater ble også oppnådd i c4-2-celler som overuttrykker PKD1 (c4-2-PKD1) (fig S1B) og i LNCaP-celler (Figur S1C). Disse data tyder på at curcumin behandling effektivt kan indusere aktivering av PKD1 i prostatakreftceller.
A). Effekt av curcumin på PKD1 nivåer. C4-2-celler ble behandlet med 20 uM curcumin. Ved varierende tidspunkter, ble cellene høstet, og lysatene ble løst i SDS-PAGE, overført på en PVDF-membran og analysert for total PKD1. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll lasting. Bandet intensiteter ble densitometrically analysert, normalisert til p-aktin nivåer og grafisk. Curcumin behandling resulterte i ingen markert endring i PKD1 ekspresjon ved ett, tre og seks timer. B). Effekt av curcumin på aktivering av PKD1. For å bestemme uttrykket av aktiveres /fosforylert PKD1 ble blotter analysert med fosfor PKD1, total PKD1 og p-aktin antistoffer. Den pPKD1 bandet intensiteten ble normalisert til total PKD1 nivåer og grafisk. Curcumin behandling indusert PKD1 aktivering /fosforylering av en time, mens ble ikke observert tegn til endringer i uttrykket av total PKD1. Representative blot av tre eksperimenter er vist i figuren. Au- vilkårlige enheter.
Curcumin behandling beriker β-catenin lokalisering på cellemembranen
β-catenin er en viktig cellulær protein som er fosforylert av PKD1. PKD1 har også vist seg å øke nivåene av membran β-catenin og celle-celle-interaksjon i prostatakreftceller [12]. For å bestemme effekten av curcumin mediert aktivering av PKD1 på membran β-catenin lokalisering, ble curcumin behandlet c4-2 celler immunostained for β-catenin og behandlet for konfokalmikroskopi (figur 3). Som vist i figur 3, curcumin behandling anriket membran β-catenin lokalisering i c4-2 celler i løpet av en time av behandlingen sammenlignet med vehikkel kontroll-behandlede celler. Lignende resultater ble også observert i LNCaP-celler (figur S2).
c4-2-celler ble dyrket på dekkglass over natten i 12 brønners plater. Cellene ble behandlet med DMSO (øvre panel) eller curcumin (20 pM) (nedre panel) i 1 time, vasket, fiksert og immunofarget for β-catenin (rød) og mot-farvet med DAPI (blå). Høyere β-catenin farging ble observert på celleoverflaten ved 1 time av curcumin behandling, sammenlignet med kontroll DMSO behandlede celler. Originale Forstørrelser 600 ×.
Curcumin mediert forbedring av membran β-catenin hemmes av PKD1 siRNA
PKD1 har tidligere vist seg å påvirke subcellulære lokalisering av β-catenin [12] . Derfor søkte vi å undersøke hvilken rolle PKD1 i curcumin mediert anriking av membran β-catenin. For dette formålet, brukte vi PKD1 spesifikke siRNA til taushet PKD1 i c4-2 celler. PKD1 siRNA effektivt silenced PKD1 uttrykk (over 95%) i c4-2 celler sammenlignet med egge (ikke-målrettede) siRNA (Figur 4A). Etter inhibering av PKD1 ekspresjon, ble c4-2-celler behandlet med curcumin og behandlet for konfokal mikroskopi for å bestemme β-catenin og PKD1 uttrykk og lokalisering (figur 4B). I egge siRNA transfekterte celler, curcumin behandling effektivt forbedret β-catenin lokalisering på cellemembranen (figur 4B, A2-D2) sammenlignet med kontrollceller (figur 4B, A1-D1). Men i celler transfektert med PKD1 stanse siRNA, curcumin behandling klarte å berike β-catenin på membranen i c4-2 celler (figur 4B, A4-D4). Disse data antyder at PKD1 spiller en rolle i curcumin mediert anrikning av membran β-catenin i prostata kreftceller.
A). Stanse av PKD1 av PKD1 bestemt siRNA. C4-2 celler ble transfektert for 48 timer med 25 nM kontroll siRNA eller PKD1 siRNA, lysert og immunoblottet for PKD1 og β-aktin ved hjelp av spesifikke antistoffer. Kvantifisering av proteinbåndintensitetene ble utført ved densitometrisk analyse. De PKD1 nivåer ble normalisert til p-aktin nivåer og grafisk. Au- vilkårlige enheter. Immunoblotting viser over 95% undertrykkelse av PKD1 uttrykk på transfeksjon med PKD1 bestemt siRNA (spor 2) sammenlignet med kontroll siRNA-transfekterte celler (spor 1). B). Undertrykkelse av PKD1 hemmer berikelse av membran β-catenin nivåer. C4-2-celler ble dyrket på dekkglass over natten. Cellene ble først transfektert med enten kontroll siRNA (A1-D1; A2-D2) eller PKD1 stanse siRNA (A3-D3, A4-D4) i 24 timer, etterfulgt av behandling med bærerkontroll (DMSO) (A1-D1; A3 D3) eller curcumin (20 pM) (A2-D2, A4-D4) i 1 time. Cellene ble immunfarget for β-catenin (rød) eller PKD1 (grønn) og kjernen ble telleren farvet med DAPI (blå). Høyere β-catenin farging ble observert på celleoverflaten av styre siRNA-celler ved 1 time av curcumin behandling (A2) i forhold til kjøretøyet behandling (A1). Imidlertid siRNA mediert stanse av PKD1 (B3, B4) hemmet curcumin mediert anrikning av membran β-catenin flekker på celleoverflaten (A4 vs A3 og A2). Originale forstørrelser 600 × med 2 × zoom.
Curcumin demper kjernefysisk β-catenin signale
PKD1 modulerer β-catenin signalveien ved å samhandle, fosforylere og modulere subcellulære lokalisering og hemme transkripsjonen aktivitet av kjernefysisk β-catenin [12]. Vi observerte maksimal PKD1 aktivering av curcumin behandling innen 1 time (figur 2B). Forbigående aktivering av PKD1 har vist seg å ha langtidsnedstrøms cellulære effekter [12], [17]. Derfor har vi bestemt videre effekten av curcumin på membran β-catenin lokalisering etter 24 timer med behandling ved hjelp av konfokalmikroskopi (figur 5A). Høyere membran β-catenin lokalisering sammen med redusert cytoplasmatiske β-catenin ble observert i celler etter 24 timers behandling av curcumin (figur 5A). I tillegg er 24 h curcumin behandling også forandres den subcellulære lokalisering av PKD1 (figur 5A). Mens i kontrollceller, ble PKD1 primært lokalisert i cytoplasma, curcumin behandlede celler viste PKD1 lokalisering på membranen og i kjernen (figur 5A).
A) Virkning av curcumin behandling på den cellulære lokalisering av β- catenin og PKD1. C4-2-celler behandlet med curcumin (20 uM) eller DMSO i 24 timer ble immunofarget for β-catenin (grønn) eller PKD1 (rød) og mot-farvet med DAPI (blå). Curcumin behandlede celler viste lavere cytoplasma og høyere membran β-catenin flekker sammenlignet med kontrollceller. I tillegg, mens PKD1 ble hovedsakelig er lokalisert i cytoplasma i kontrollceller, curcumin behandlede celler viste farging primært på cellemembranen og i kjernen (hvite piler), med svak cytoplasmatisk farging. Originale Forstørrelser 600 × med 2 × zoom. B) Effekt av curcumin om atom β-catenin nivåer. Atom proteiner isolert fra c4-2 celler behandlet enten med curcumin (20 mm) eller DMSO ble løst på PVDF membran og behandlet for immunblotting ved hjelp av β-catenin antistoff. Histone H1 protein ble brukt som lasting kontroll. Densitometrisk kvantifisering av β-catenin bandet intensiteter, normalisert til Histone H1 nivåer er vist i grafen. Curcumin behandling markert reduserte nivåene av atom β-catenin sammenlignet med bærerbehandlede celler. Au- vilkårlige enheter. C) Effekt av curcumin på β-catenin transkripsjon aktivitet i c4-2 prostatakreftceller. Den β-catenin transkripsjonsaktiviteten ble målt ved forbigående transfeksjon cellene med TCF luciferase reporter konstruere inneholder enten TCF promoter bindingsseter (pTOP-Flash) eller mutant TCF promoter bindingsseter (pFOP-blits) sammen med den interne kontrollen plasmid som inneholder
Renilla
luciferase genet (PRL-TK). Etter 3 timer ble cellene behandlet med curcumin (20 uM) eller DMSO i 24 timer. Den β-catenin transkripsjonsaktiviteten var først normalisert til
Renilla
luciferase aktivitet, og uttrykkes som et forhold mellom pTOP-FLASH /pFOP-FLASH aktivitet. Aktiviteten av curcumin behandlede celler ble normalisert til aktiviteten av bæremiddelbehandlede celler (ansett som 100%). Curcumin behandling betydelig redusert β-catenin transkripsjon aktivitet i c4-2 celler i forhold til kjøretøy behandlede celler. Middelverdi ± SE, n = 3, * p 0,01. D). Effekt av curcumin på transkripsjon av cyclin D1. Transkripsjonen av cyclin D1 ble analysert fra celler behandlet med curcumin eller bærerkontroll i 24 timer. Etter revers transkripsjon av RNA til cDNA, ble PCR-amplifisering av cyclin D1 eller internkontrollen GAPDH utført ved anvendelse av genspesifikke primere. De amplifiserte produkter ble løst i 1% agarosegel. Den densitometrisk kvantifisering av cyclin D1 bandet intensiteter normalisert til GAPDH nivåene vises i grafen. Curcumin behandling reduserte ekspresjonen av cyclin D1. Au- vilkårlige enheter. E). Immunoblot analyser. Cellelysater fremstilt fra curcumin (20 uM) eller DMSO behandlede c4-2-celler ble oppløst ved SDS-PAGE og behandlet for immunblotting ved hjelp av spesifikke antistoffer. Curcumin behandling markert redusert cyklin D1 uttrykk, mens det ikke ble observert effekt på ekspresjonen av total β-catenin, E-cadherin eller Wnt 3a. Representative immunoblotter fra tre forsøk er vist.
β-catenin er en kritisk komponent i Wnt signalkaskade. Kjernefysiske β-catenin virker som et ko-transkripsjonsfaktor ved å danne et kompleks med TCF og forbedrer ekspresjonen av et antall molekyler med pro-onkogene roller, herunder cyklin D1, c-myc og c-jun. Siden PKD1 modulerer den subcellulære lokalisering av β-catenin, og siden Curcumin mediert PKD1 aktivering forbedret membran lokalisering av β-catenin, analyserte vi effekten av denne aktiveringen på atom β-catenin ekspresjon ved hjelp av immunblotting og på β-catenin transkripsjonen aktivitet ved anvendelse av et luciferase reporter system i c4-2 prostatakreftceller (Tall 5B og 5C). Curcumin behandling signifikant redusert atom ekspresjonen av β-catenin sammenlignet med dimetylsulfoksyd (DMSO) behandlede celler (Figur 5B). Reduksjonen i atom β-catenin nivåer var korrelert med dempningen av β-catenin transkripsjonen aktivitet i c4-2 (figur 5C). For å bestemme nedstrøms effektene av undertrykket β-catenin aktivitet, ble ekspresjonen av cyclin D1 analysert i curcumin behandlede c4-2 celler. Interessant nok var en markant nedgang i uttrykket av cyclin D1 på mRNA (figur 5D) og proteinnivåer (figur 5E) observert i curcumin behandlet c4-2 celler. Lignende resultater ble også oppnådd ved sanntids-PCR-analyse (data ikke vist). Imidlertid, ingen tilsynelatende forandring ble observert i ekspresjonen av Wnt 3a, β-catenin og E-cadherin (figur 5E).
Vi bestemte også den effekt av curcumin på β-catenin transkripsjonsaktivitet i LNCaP-celler. I likhet med c4-2 celler, curcumin hemmet β-catenin transkripsjon aktivitet (figur S3A) og markert redusert uttrykk for cyclin D1 (figur S3b) i LNCaP celler.
Curcumin behandling undertrykker onkogene fenotype i prostatakreftceller
Forbedret klonogene potensial og redusert celle-celle adhesjon er to viktige kjennetegn ved kreft vekst og metastasering. Den klonogene vekst karakteristiske er nødvendig for kreftcellene for å etablere en primær tumor og til slutt metastasere. Derfor, undersøkte vi muligheten av curcumin for å hemme forankringsavhengig og forankringsuavhengig kolonidannelse. Curcumin behandling inhiberte forankringsavhengig og forankringsuavhengig kolonidannelse i en doseavhengig måte i c4-2 prostatakreftceller (figur 6A, B). I forankrings uavhengige analyser, curcumin behandling ikke bare redusert antall kolonier, men også redusert størrelsen på kolonier (figur 6B). Lignende resultater ble observert i LNCaP-celler (figur S3C, D).
A). Anchorage avhengig kolonidannelse analysen. C4-2-celler (2000) ble platet ut over natten, behandlet med indikerte konsentrasjoner av curcumin i 14 dager og undersøkt for deres kolonidannende evne. Representative fotografier er vist. Curcumin viste en doseavhengig inhibering i forankringsavhengig kolonidannelsesbestemmelsen. Gjennomsnitt ± SE; n = 3; *
p
0,05. B). Anchorage uavhengig kolonidannelse analysen. C4-2-celler ble sådd ut i 0,3% agarose og ble behandlet med varierende konsentrasjoner av curcumin i 9 dager. Antallet kolonier ble tellet og plottes. Curcumin behandling hemmet forankringsuavhengig koloni dannelsen av c4-2 celler. Gjennomsnitt ± SE; n = 3;
* p
0,01. C) Celle-celle-aggregering assay. C4-2-celler behandlet med curcumin (15 uM) eller DMSO i 1 time ble høstet og analysert for celle-celle-aggregering ved inkubering under forsiktig risting betingelser ved 37 ° C i nærvær av 5 mM CaCl
2. Etter 6 timers inkubasjon ble en aliquot av reaksjonsblandingen analysert og fotografert for celle-celle-aggregering i henhold til fasekontrastmikroskop. Større celle-celle-aggregater ble observert i curcumin behandlede celler, sammenlignet med DMSO kontrollceller. Originale Forstørrelser 100 ×.
Cell-celle adhesjon er tilrettelagt av inter cadherin-cadherin interaksjon. Den økte membran lokalisering av β-catenin styrker cadherin-catenin interaksjoner og således forbedrer celle-celle-interaksjoner [12]. For å bestemme effekten av forsterket membran lokalisering av β-catenin, curcumin behandlet c4-2 og PKD1 overekspresjon c4-2-celler (c4-2-PKD1) ble vurdert for celle-celle-aggregering. Curcumin behandlede c4-2-celler dannes større celle-celleaggregater sammenlignet med kontroll behandlede celler (figur 6C). Interessant, mens c4-2-PKD1 dannet store celle aggregater, ble mye større celle-celle aggregater observert på curcumin behandling av disse cellene (Figur S4). Disse data implisere en rolle curcumin mediert aktivering av PKD1 i celle-celle aggregering.
Curcumin hemmer cellemotilitet gjennom PKD1 mediert cofilin fosforylering
Kreftceller vanligvis utviser forbedret cellular motilitet å lette metastaser. Derfor vil evnen til en Kjemopreventivt eller kjemoterapeutisk middel for å inhibere celle motilitet hjelpe til med å forebygge kreft metastasering. Derav undersøkte vi effekten av curcumin på celle motilitet ved anvendelse av en «sårheling «og Boyden kammer analyser. Sammenlignet med kontrollgruppen, curcumin behandling inhiberte cellulær motilitet av c4-2 prostatakreftceller i begge analyser (figur 7A, B). En lignende effekt på cellulær motilitet ble også observert i LNCaP-celler (figur S3E).
A). Scratch analysen. C4-2 celler ble dyrket inntil sammenflytende, i form av plater som inneholder IBIDI innsatser. Innsatsene ble fjernet fra platene for å generere hullene (faste, hvite linjene viser bredden av gapet; stiplede linjer grenser spalten) og fasekontrastbilder av det samme område av hullene ble tatt ved forskjellige tidsintervaller i nærvær eller fravær av 20 iM curcumin. Curcumin behandling hemmet bevegelighet av c4-2 prostatakreftceller. B). Boyden kammer analysen. Like mange c4-2 celler ble sådd på Boyden kammer og inkubert i nærvær DMSO eller curcumin (20 uM) i 24 timer. Migrerte celler ble fiksert, farget, telles og grafisk. Curcumin hemmet bevegelighet av c4-2 celler. Gjennomsnitt ± SE; n = 3; *
p
0,05. C). Effekt av curcumin på ekspresjon av aktin ombygging proteiner. Totalt cellelysater fremstilt av curcumin (20 mm) eller DMSO behandlet c4-2 celler ble behandlet for immunblotting ved hjelp av spesifikke antistoffer. Den densitometrisk kvantifisering av proteinbånd normalisert til p-aktin-nivå er vist i diagrammet. Curcumin behandling induserte en markert økning i ekspresjon av inaktive fosfo-cofilin sammenlignet med DMSO behandlede kontrollceller. Mindre endring ble også observert i uttrykket av Arp3. Au- vilkårlige enheter.
Den svært koordinert prosess av aktin ombygging til grunn for prosessen med cellular motilitet. Denne remodellering ved den økende fremre krever organisert virkningen av et antall molekyler som er involvert i F-aktin omorganisering. De actin-relaterte proteiner (Arp) spiller en viktig rolle i forgreningen av aktin filament. Proteinet cofilin er en aktin monomer genererende molekyler som er involvert i aktin remodeling. Cofilin aktiveres ved sprettert (SSH) fosfatase-mediert defosforylering reaksjon og blir inaktivert av LIM-kinase (LIMK) mediert fosforylering reaksjoner [2], [21]. PKD1 er intrikat involvert i å hemme cellemotilitet ved å samhandle, fosforylere og hemme funksjonene til mange motilitet relaterte proteiner inkludert en sprettert en som (SSH1L) fosfatase [21]. Siden curcumin aktivert PKD1, forsøkte vi å undersøke effekten av curcumin på aktiviteten og nivåer av cofilin og Arp3 protein ved immunblotting. Curcumin behandling økte nivåene av inaktive fosfo-cofilin i c4-2 prostatakreftceller med liten eller ingen effekt på ekspresjonen av det totale protein (figur 7C). Curcumin behandling også forårsaket en svak nedgang i uttrykket av Arp3 protein. Disse dataene antyder en potensiell rolle PKD1 i curcumin hemming av cellemotilitet
via
cofilin fosforylering.
In vivo
effektene av curcumin på prostatakreft vekst
En xenograft mus modell ble brukt til å undersøke
in vivo
effekten av curcumin på prostata tumorvekst og β-catenin subcellulære lokalisering. Naken mus ble subkutant inokulert med androgen-uavhengig c4-2-celler. Etter svulst utvikling, ble musene administrert intratumor injeksjoner av curcumin eller kjøretøy kontroll. På dag 7, ble tumorvolumer målt og hastigheten av tumorvekst følgende curcumin behandling ble bestemt. Curcumin effektivt inhiberte tumorvekst med mer enn to folder, sammenlignet med kontroll-behandlede mus (*
p
0,05) (Figur 8A). I tillegg observerte vi endringen i β-catenin subcellulære lokalisering i curcumin behandlet tumorvev (figur 8b), tilsvarende
in vitro
observasjoner (figur 3 og 5A). Disse resultatene tyder på at curcumin inhiberer prostatatumorvekst ved å modulere β-catenin funksjoner.
A) Virkning av curcumin på prostatakreft vekst. C4-2 prostata kreft celler ble brukt til å generere xenografter i manns nakne mus. Etter tumorutviklingen, ble musene behandlet intra-tumorally med curcumin (n = 4) eller DMSO (n = 3). Satsen for tumorvekst ble målt etter 7 dagers og prosent tumorvekst etter behandling ble fremstilt grafisk. Curcumin hemmer effektivt prostatakreft vekst. B) Effekt av curcumin på β-catenin lokalisering. Tumorvev fra curcumin eller kontrollbehandlede mus ble behandlet for IHC-farging ved anvendelse av anti-β-catenin antistoff. Forbedret farging av membranøs β-catenin ble observert i curcumin behandlede mus sammenlignet med kontrollmus. Originale Forstørrelser 400 ×.
Diskusjoner
Den feilregulering av PKD1, en serin-treonin kinase, har vært assosiert med kreft progresjon [2], [4], [6]. PKD1 uttrykkes på høyeste nivå i prostata og spiller en avgjørende rolle i normal fysiologi av prostata [9], [10]. Tidligere arbeid fra vårt laboratorium har vist foreningen av PKD1 nedregulering med utviklingen av prostatakreft [3], [11]. Vår tidligere arbeid har også opplyst rolle PKD1 i E-cadherin fosforylering, modulering av cellemotilitet og celle-celle aggregering i prostatakreftceller [13]. I tillegg har vi vist PKD1 å interagere med, fosforylere og modulere funksjonen av β-catenin [12]. Den naturlige makrolakton Bryostatin en aktiverer PKD1 i prostatakreftceller [12]. Den aktiverte PKD1 fosforylerer og translocates atom β-catenin fra kjernen som resulterer i inhibering av β-catenin /TCF transkripsjonen aktivitet [12]. Dermed naturlige forbindelser som modulerer PKD1 aktivering kan hjelpe i forebygging og behandling av prostatakreft. Curcumin er en naturlig forbindelse som for tiden er i kliniske forsøk for forebygging og behandling av forskjellige cancere [33] – [35]. I denne studien har vi vist at curcumin aktiverer PKD1, demper β-catenin /TCF transkripsjonen aktivitet og beriker membran β-catenin resulterer i undertrykkelse av prostatakreft vekst.
β-catenin er en multifunksjonell protein som spiller en viktig rolle i ontogenese og onkogenese. I kombinasjon med TCF og p300, fungerer den som en transkripsjonsfaktor i Wnt signalveien [36]. I tillegg β-catenin, sammen med E-cadherin funksjoner ved cellemembranen som en kritisk komponent i adherens krysset for å forbedre celle-celle adhesjon [37]. Dermed feilregulering av β-catenin har blitt assosiert med utvikling av mange typer kreft, inkludert prostata kreft [36], [38], [39]. Vi har tidligere vist en ny mekanisme for β-catenin regulering gjennom virkningen av PKD1 [12]. Heri, har vi vist at curcumin aktiverer PKD1 innen 1 time av behandlingen (figur 2B). I tillegg, ved bruk av en reporter luciferase-analysen, har vi vist at β-catenin aktivitet hemmes av curcumin, etter PKD1 aktivering (figur 5C).
Siden β-catenin er en viktig signalmolekyl, dens funksjoner reguleres via flere ulike veier [40]. Mens curcumin er blitt vist å inhibere β-catenin /TCF transkripsjonsaktivitet [41], dens presise molekylære mekanismer som ikke er fullstendig kjent. Heri vi for første gang vist at curcumin demper β-catenin /TCF transkripsjonsaktivitet
via
aktivering av PKD1 i prostatakreftceller. Studier har også rapportert hemming av β-catenin transkripsjonen aktivitet ved behandling curcumin i tykktarmskreftceller via caspase-3-mediert nedbrytning av β-catenin [42]. Vi har imidlertid ikke observere en markert nedgang i totale β-catenin uttrykk nivåer i prostata kreft cellelinjer. * P 0,05.
