Abstract
Peritoneal metastaser er den hyppigste typen av tilbakefall hos pasienter med magekreft (GC) og er assosiert med dårlig prognose. Peritoneal lavage cytologi, brukes til å vurdere risikoen for peritoneal metastaser, har lav sensitivitet. Her vurderte vi den diagnostiske potensialet exosomal miRNA profiler i peritonealvæsken for prediksjon av peritoneal formidling i GC. Total RNA ble ekstrahert fra exosomes isolert fra seks mage ondartede ascites (MA) samples, 24 peritoneal vaskevæske (PLF) prøver, og kultursupernatanter (CM) på to humane gastriske carcinom cellelinjer som er forskjellige i deres potensial for peritoneal metastasering. Uttrykk for exosomal miRNAs ble evaluert med Agilent menneskelige miRNA mikromatriser og kvantitativ revers transkripsjon polymerase chain reaction (QRT-PCR). Microarray analyse indikerte en lav variasjon i antallet og signalintensiteten av mirnas detektert blant prøvene. I de seks MA væsker, MIR-21 viste den høyeste signalintensitet. Vi identifiserte fem mirnas (MIR-1225-5p, MIR-320C, MIR-1202, MIR-1207-5p, og MIR-4270) med høy uttrykk i MA prøver, PLF av serosa-invasiv GC, og CM av en svært metastatisk GC cellelinje; disse kandidat miRNA artene ser ut til å være relatert til peritoneal formidling. Differential uttrykk for MIR-21, MIR-320c, og MIR-1225-5p ble validert i PLF av serosa-invasive og ikke-invasive GC ved QRT-PCR og MIR-21 og MIR-1225-5p ble bekreftet å være assosiert med serøse invasjonen i GC. PLF kan brukes til å profilere uttrykk for exosomal miRNAs. Våre funn tyder på at Mir-21 og MIR-1225-5p kan tjene som biomarkører for peritoneal tilbakefall etter kurativ GC reseksjon, og dermed gi en ny tilnærming til tidlig diagnostisering av peritoneal formidling av GC
Citation. Tokuhisa M, Ichikawa Y, Kosaka N, Ochiya T, Yashiro M, Hirakawa K, et al. (2015) Exosomal mirnas fra peritoneum Lavage Fluid som Potensielle Prognostiske Biomarkører av peritoneal Metastase i magekreft. PLoS ONE 10 (7): e0130472. doi: 10,1371 /journal.pone.0130472
Redaktør: Soheil S. Dadras, University of Connecticut Health Center, UNITED STATES
mottatt: 1 februar 2015; Godkjent: 20 mai 2015; Publisert: 24.07.2015
Copyright: © 2015 Tokuhisa et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs (mirnas) er små (19-23 nukleotider) ikke-kodende RNA som fungerer som post-transcriptional regulatorer av genuttrykk og spiller viktige roller i kontrollen av mange biologiske prosesser, herunder celledifferensiering, spredning, og apoptose [1]. Mirnas har vist seg å ha onkogen eller tumor undertrykkende aktivitet, og deregulert uttrykk for mange miRNA arter er påvist i flere krefttyper, noe som tyder på potensiell anvendelse av miRNAs som biomarkører for kreft progresjon og metastase [2-5].
mirnas er pakket inn i sekretoriske mikrovesikler (f.eks exosomes, apoptotiske legemer og Shedding mikrovesikler), som skjold mirnas fra nedbrytning av RNase og tjene som redskap for miRNA sekresjon i ekstracellulære rom og kroppsvæsker. Exosomes er små membran vesikler som har vært innblandet i cellulære immunresponser; men nylig har det blitt klart at exosomes inneholde vesentlige mengder av RNA og kan være involvert i immun-uavhengige reguleringsmekanismer. Det er nå etablert som exosomes kan utføre inter overføring av miRNAs, og dermed delta i miRNA-baserte signalmekanismer [6]. Høyere nivåer av miRNA holdige exosomes har også blitt påvist i plasma hos kreftpasienter enn i den for friske individer [7], som tyder på at exosome baserte miRNA sekresjon er involvert i kreftutvikling. Analyse av avvikende miRNA uttrykket i serum, spytt, avføring og urin har vært ansatt for tidlig deteksjon av B-celle lymfom, og muntlig, tarm og blære kreft [8-11].
Magekreft (GC) er den nest vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall på verdensbasis [12]. Peritoneum er den hyppigste området av metastaser og tilbakefall av GC, og ondartede ascites (MA), forårsaket av peritoneal spredning av kreftceller, er blitt assosiert med dårlig prognose. For tiden er det ingen pålitelige prediktorer for utvikling av ondartet peritoneal ascites i GC pasienter. MiRNA holdige exosomes representerer en ny mekanisme for intercellular signalisering og kan gi innsikt i det miljø som tillater kreftspredning i peritoneum [13].
I denne studien ble exosomes isolert fra MA og intraoperativ peritoneale vaskevæske (PLF) prøver oppnådd fra pasienter GC, og dyrkningsmedium (CM) av sterkt invasive peritoneal cellelinjer, og mirnas ble deretter ekstrahert fra disse prøvene. Kvaliteten på den utpakkede exosomal mirnas og konsistensen av miRNA uttrykk mønstre ble bekreftet. MiRNA uttrykk profiler i MA, PLF, og CM prøvene ble sammenlignet og kandidat mirnas relatert til peritoneal formidling av GC ble identifisert.
Materialer og metoder
Pasienter
Alle pasienter eller deres foresatte har gitt skriftlig informert samtykke. Studien ble godkjent av etikkomiteen av Yokohama City University Hospital (Godkjenning nr A110127001).
MA og intraoperative PLF prøver ble samlet inn fra GC pasienter med clinicopathological egenskapene presentert i tabell 1. Alle pasientene hadde tidligere vært diagnostisert med GC ved histopatologisk analyse av biopsiprøver tatt fra de primære lesjoner, og seks MA pasienter hadde blitt diagnostisert for tilstedeværelsen av ascites ved mage computertomografi (CT) scan. Ascites ble også analysert ved cytologi og alle ble bekreftet som positiv for malignitet av patologer; de gjenværende MA prøvene ble anvendt for miRNA isolasjon. PLF ble intraoperativt samlet inn fra 24 GC pasienter (tab 1). Etter laparotomi, ble 100 ml av normal saltløsning helles inn i posen av Douglas og peritoneal lavage vann ble oppsamlet før kirurgisk fjerning av tumoren. PLF ble analysert ved cytologi og anvendt for miRNA isolasjon. Blant de 24 PLF prøvene, seks ble analysert ved hjelp av miRNA microarray og 18 ble analysert ved qPCR
Godt differensiert adenokarsinom (vel).; moderat differensiert adenokarsinom (mod); dårlig differensiert adenokarsinom (dårlig). Ondartet ascites (MA); Peritoneal lavage væske (PLF); TMN scenen (UICC syvende utgave); Tilstede (P) fraværende (A); Peritoneal lavage cytologi (CY);
Cell kultur
OCUM-2M cellelinje ble etablert fra en primær svulst scirrhous gastrisk karsinom og OCUM-2MD3 cellelinjen ble avledet fra OCUM-2M celler med et stort potensial for peritoneal formidling i nakne mus [14]. Cellene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Life Technologies, Grand Island, NY) supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika-antimykotisk ved 37 ° C i en 5% CO
2 kuvøse. For å oppnå celle CM, ble OCUM-2M og OCUM-2MD3 cellene vasket tre ganger med serumfritt DMEM supplementert med antibiotika-antimykotisk og inkubert i det samme medium i 48 timer.
Isolering av exosomes
prøver for isolering exosome ble fremstilt som tidligere beskrevet [15]. For å fjerne store cellepartikler og celleavfall, MA, PLF, og CM ble sentrifugert ved 2000 x
g
i 15 minutter ved 4 ° C og filtrert gjennom et 0,22 um filter (Millipore, Billerica, Massachusetts). Supernatanten ble lagret ved -80 ° C inntil nødvendig for miRNA utvinning.
For å fremskynde exosomes, ble prøvene sentrifugert ved 110 000 ×
g
for 70 min ved 4 ° C. Den exosome Pelleten ble vasket med 11 ml fosfat-bufret saltvann (PBS) og sentrifugert igjen som beskrevet. Pelleten ble anvendt for RNA-ekstraksjon.
Total RNA ekstraksjon og analyse
Total RNA ble ekstrahert fra exosomes ved hjelp av en miRNeasy mini-kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner og var deretter lagret ved -80 ° C inntil nødvendig videre analyse.
kvaliteten, konsentrasjon, og størrelsen på total exosomal RNA ble vurdert ved hjelp av en Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Foster City, California). Før analysen ble totalt RNA fremstilt ved bruk av en Agilent RNA 6000 Pico kit (Agilent Technologies) i henhold til produsentens protokoll.
miRNA microarray
mirnas hentet fra seks MA, seks PLF, og to CM prøver ble analysert ved hjelp av Agilent menneskelig miRNA mikromatriser (Agilent Technologies), som inneholder 1.226 menneskelige mirnas og 146 mennesker viral miRNAs. For miRNA deteksjon, ble 100 ng RNA merket og hybridisert med menneskelige miRNA Microarray kit (rel 16,0; Agilent Technologies) i henhold til produsentens protokoll (miRNA Komplett Merking og Hyb kit for miRNA microarray System). Hybridisering signaler ble oppdaget med en DNA microarray Scanner G2505C (Agilent Technologies) og de skannede bildene ble analysert ved hjelp av Agilent Feature Extraction programvare (v. 10.7.3.1). Dataanalyse ble utført ved hjelp av Agilent GeneSpring GX programvare v. 11.0.2. (Log
2 transformasjon). Baseline transformasjon ble ikke utført.
Kvaliteten miRNA ekstraksjon ble analysert i henhold til variasjonen i antall mikroarray-detektert miRNA art, signalintensitet, og korrelasjonen av miRNA uttrykk blant prøvene ifølge gjennomsnitt ± SD, variasjonskoeffisient (CV), og korrelasjonskoeffisienten (CC).
Valg av peritoneal metastasespesifikke mirnas
uttrykket profiler av exosomal mirnas ble analysert for å velge mirnas som er spesifikke for GC peritoneal formidling ved hjelp av følgende trinnvise metode. Trinn 1: miRNA profiler i CM av de høyt metastatiske peritoneale OCUM-2MD3 celler ble sammenlignet med de av de paren ikke-metastaserende OCUM-2M-celler, og differensielt uttrykte mirnas (gjennomsnittlig fold-forandring, 2) ble valgt
Trinn 2: seks PLF prøver ble klassifisert i to grupper: T4 (n = 4) og T1-T3 (n = 2), i henhold til kreft stadium av tumorstørrelse og forlengelse (UICC-AJCC, 7
th edition). Trinnet T4 GC er kjennetegnet ved den høyeste frekvensen av peritoneal-metastaser i forhold til andre stadier [16]. De miRNA ekspresjonsprofiler T4 gruppe ble sammenlignet med de av T1-T3 gruppe og differensielt uttrykte mirnas (gjennomsnittlig fold-forandring, 2) ble valgt
Trinn 3:. De valgte mirnas som var felles for begge trinn og som ble uttrykt i MA ble videre filtrert i henhold til signalintensitet. De med intensitetsverdier på mer enn log
2 10 i MA og PLF ble valgt som kandidat mirnas relatert til peritoneal metastaser; MIR-21 viste den høyeste gjennomsnittlige signalintensitet blant MA prøver. Differensial uttrykk for miRNA arter valgt i trinn 3 ble validert i de resterende 18 PLF prøver ved QRT-PCR.
Kvantitativ analyse av peritoneal metastase-spesifikke miRNA uttrykk ved QRT-PCR
TaqMan mikroRNA analyser (Life Technologies) ble brukt for å kvantifisere de relative uttrykk nivåer av MIR-21 (analyse ID. 000397), MIR-320c (analyse ID. 241053_mat), MIR-1225-5p (analyse ID. 002764), og MIR-16 (analyse ID. 000391). Revers transkripsjon ble utført ved hjelp av TaqMan miRNA RT Kit (Life Technologies) under følgende betingelser: 30 min ved 16 ° C, 30 min ved 42 ° C, og 5 min ved 85 ° C. PCR ble utført i 96-brønners plater ved hjelp av 7500 Real Time PCR System (Life Technologies); Alle reaksjoner ble utført i tre eksemplarer. Uttrykket nivåer av target mirnas ble normalisert med den i MIR-16, som ble brukt som et stabilt uttrykt styre [17]. Når du analyserer våre microarray data for exosomal miRNA i maligne ascites prøver, MIR-16 presenterte den laveste variasjonskoeffisienten (CV = 4%) blant søker interne standarder, inkludert MIR-638 (CV = 8%), la-7a (CV = 8%), og 142-3p (CV = 23%).
Statistisk analyse
Kontinuerlige variabler ble sammenliknet med Student
t
-test. Når det er nødvendig,
t
-test ble endret for å sammenligne ulike variasjoner. Forskjellen mellom kategoriske variabler ble evaluert ved hjelp av Fishers eksakte test. Korrelasjon mellom to variabler ble evaluert ved anvendelse av Pearson korrelasjonskoeffisient. Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant ved P 0,05. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS 21.0 programvare for Windows (IBM, Armonk, New York).
Resultater
Kvantitativ analyse av ekstrahert exosomal RNA
Total RNA ble ekstrahert fra exosomes isolerte fra MA, intraoperativ PLF, og celle CM. Median konsentrasjonen av den utpakkede exosomal RNA var 4,4 ng /mL (som spenner 1,2 til 6,1 ng /mL) for MA og 6,4 ng /mL (1,7 til 16,4 ng /mL) for PLF. Electropherograms avslørte en stor andel av små RNA art som er tilstede i alt CM og kliniske prøver, mens ingen eller meget lite forurensning med 18S og 28S ribosomalt RNA (ingen tydelige topper ved den tilsvarende molekylvekt) ble observert (figur 1).
Variasjon og felles mellom prøvene ble undersøkt. Evaluering av total exosomal RNA brukt en Bioanalyzer 2100. electropherograms viser størrelsesfordelingen (nukleotider, nt) og fluorescens intensitet (FU) av total exosomal RNA isolert fra CM, MA, og PLF. Den laveste spike (rundt 25 nt) i hver prøve er markør av Agilent RNA 6000 Pico kit.
Utførelse av miRNA mikromatriser
For å teste uttrykk for exosomal miRNA mikromatriser i hver gruppe av prøver, undersøkte vi antall oppdaget miRNAs, persentil av signalintensitet, antall ofte fanget miRNAs, og korrelasjonen av miRNA uttrykk blant gruppene. Numrene på miRNA arter detektert i hver gruppe av microarray er vist på figur 2. I de seks MA og seks PLF prøver, disse betyr tallene var 490,1 (SD = 42,3; CV = 8,6%) og 367,5 (SD = 13,4; CV = 3,6%), henholdsvis. I hver gruppe, variasjonen i antall påviste mirnas blant prøvene var lav
Signalintensitetsfordelingen for hver gruppe er presentert i figur 3.; Dette viser behandlede signaler normalisert til 25, 50, 75, og 90
th persentil i hver gruppe. I 50
th persentil, loggen
2 relative signalintensitet for MA (figur 3-1) og PLF (figur 3 og 2) prøver og blant tre grupper (MA, PLF, og CM, figurene 3 og 4) var 5,53 ± 0,19 (CV = 3,49%), 6,14 ± 0,24 (CV = 3,87%), og 4,97 ± SD (CV = 5,24%), henholdsvis. Den variasjon av signalintensiteten blant prøvene i hver gruppe, samt mellom gruppene var lav.
Antallet mirnas vanlige blant prøvene i MA, PLF, og CM grupper ble 327, 263, og 354, henholdsvis, mens dette ble 194 for de tre gruppene (figur 4).
Tabell 2 viser korrelasjonen av miRNA uttrykk mellom hver to prøver. De høyeste og laveste CC verdier var 0,94 og 0,68, henholdsvis; den gjennomsnittlige CC i alle prøvene var 0.79 (CV = 8,86%). I MA, PLF, og CM-grupper, gjennomsnitts CC verdiene var 0,85, 0,88 og 0,90, henholdsvis, og variasjonen i uttrykket profiler for hver gruppe ble lav.
Valg av kandidat miRNAs relatert til peritoneal formidling
til dags dato har ingen data vært tilgjengelig på uttrykket profiler av exosomal mirnas assosiert med peritoneal formidling, på grunn av utilgjengelighet av normale ascitisfluider mot som å sammenligne MA uttrykk profiler. Vi valgte mirnas relatert til peritoneal formidling ved hjelp av en trinnvis tilnærming. Antallet mirnas ofte fanget i de seks MA prøvene var 327. I trinn 1 og 2, 140 og 118 metastasespesifikke mirnas ble valgt i CM og PLF grupper, henholdsvis. Fra disse 327, 140 og 118 mirnas ble fem mirnas valgt som kandidater knyttet til peritoneal formidling (fig 5). To av dem (MIR-1225-5p og MIR-320c) og Mir-21 med høyest signalintensiteten blant de MA-spesifikke miRNAs ble validert som blir uttrykt forskjellig i 18 PLF prøver, ved hjelp av qPCR (tabell 3).
Skjematisk fremstilling av trinnvis tilnærming til screening mirnas relatert til peritoneal formidling. Trinn 1: utvalg av miRNAs forskjellig uttrykt (fold-endring, 2) i kulturmedium (CM) av den svært metastatisk peritoneal cellelinje OCUM-2MD3 (OCUM-2M foreldrenes cellelinje ble brukt som kontroll). Trinn 2: seks peritoneal lavage væske (PLF) prøver ble delt inn i T4 (n = 4) og T1-T3 grupper etter gastrointestinal kreft stadium; mirnas forskjellig uttrykt (fold-endring, 2) i T4 gruppen ble valgt. Trinn 3: de utvalgte miRNA arter felles for trinn 1 og 2 og uttrykt i maligne ascites (MA) med signalintensitet log
2 10 i MA og PLF ble vurdert som kandidat mirnas relatert til peritoneal metastaser
Ondartet ascites (MA).; Peritoneal lavage væske (PLF); Tilstand medium (CM), T scenen UICC 7
th edition (T4, T1-3); OCUM-2M (2M); OCUM-2MD3 (D3).
Validering av kandidat miRNA uttrykk ved qPCR
Atten PLF prøver ble delt inn i to grupper i henhold til metastatisk scenen, T4 (perforerte serosa, n = 9) og T1-T3 (subserosa eller mindre, n = 9), og ekspresjon av MIR-21, MIR-320C, og MIR-1225-5p ble analysert ved QRT-PCR. Figur 5 viser at nivåene av MIR-21 og MIR-1225-5p i T4-trinns GC pasienter ble betydelig økt sammenlignet med de i T1-T3 pasienter (MIR-21, P = 0,027, og MIR-1225-5p, P = 0,008, fig 5). . Forskjellen i MIR-320c uttrykk mellom to pasientgruppene var ikke signifikant (p = 0,928, figur 6)
En stjerne indikerer P 0,05.
Deretter sammenhengen mellom miRNA nivåer og klinisk bakgrunn av GC pasienter ble undersøkt (tabell 4). MiR-21 og MIR-1225-5p uttrykk var signifikant høyere hos pasienter med T4-stadium kreft enn i T1-T3-trinns pasienter (P = 0,015). Ingen signifikant korrelasjon ble funnet mellom miRNA uttrykk og andre kliniske parametre.
Diskusjoner
I denne studien undersøkte vi, for første gang, miRNA innholdet i exosomes isolert fra MA og PLF av GC pasienter. Vår studie viser at exosomal mirnas kan være konsekvent hentet fra MA og PLF og at miRNA uttrykk profiler kan vise status for peritoneum i GC pasienter.
Prognosen for GC med serøse invasjonen er fortsatt dårlig, selv etter R0 reseksjon, fordi av den høye frekvensen av tilbakefall, spesielt peritoneal metastaser (PM) [18]. PM i GC er den mest kompliserte form for gjentakelse, fordi det er vanskelig å forutsi, så vel som å diagnostisere. Selv ascites er den vanligste PM symptom, er det mange GC pasienter med PM ikke utvikle ascites. Blant de bildebaserte diagnostiske metoder, er høyhastighets spiral CT mye brukt for vurdering av preoperativ stadieinndeling av GC og post-terapeutisk oppfølging; imidlertid, i tilfelle av PM sin diagnostisk nøyaktighet er utilstrekkelige, hovedsakelig på grunn av lav sensitivitet [19]. Ved hjelp av PET-CT for PM diagnose i GC er også kontroversielt, som det har blitt rapportert at FDG-PET har dårlig følsomhet for deteksjon av PM i GC [20]. PLF har blitt det neste målet for diagnostisering og prediksjon av PM i GC. Cytologisk undersøkelse av intraoperativt oppsamlet PLF blir brukt for prediksjon av peritoneal gjentakelse [21] og brukes for GC staging i Japan [22]. Imidlertid har enkelte forskere rapportert at PLF cytologi ikke viser den følsomhet som kreves for prediksjon og påvisning av PM [21], og har foreslått anvendelse av molekylære diagnostiske metoder, så som RT-PCR for påvisning av mikrometastaser i PLF. I en multi prospektiv studie, mRNA-ekspresjon av gener som koder for karsinoembryonisk antigen (CEA) og cytokeratin 20 (CK-20), evaluert ved hjelp av RT-PCR, har vist seg å være nyttig for prediksjon av total overlevelse og PM i GC [23] . Imidlertid den ulempe at mRNA-baserte diagnostiske metoder er den høye nedbrytbarhet av mRNA i løpet av kirurgiske prosedyrer.
I motsetning til dette, mirnas omsluttet i exosomes forbli stabile og kan sirkulere i kroppsvæsker, slik som serum, plasma , spytt, urin, brystmelk, og tårer, i lange perioder av gangen [24, 25]; exosomes har også blitt isolert fra MA i eggstokkreft [26].
Så langt vi kjenner til, har det ikke vært noen rapport om exosomal mirnas isolert fra PLF av GC pasienter. Levänen et al. samlet exosomes fra bronchoalveolar lavage væske og analysert exosomal miRNA uttrykk for å påvise allergirelaterte miRNA arter [27]. Liu et al. rapporterte at exosomes isolert fra cervicovaginal vaskevæske inneholdt høye nivåer av MIR-21, som kan brukes som en biomarkør for livmorhalskreft [28]. Her, analyserte vi uttrykket profiler av exosomal mirnas i PLF av GC pasienter ved miRNA microarray teknologi for å identifisere kandidat diagnostiske miRNA biomarkører for prediksjon av metastaser i GC.
I vår undersøkelse, den første utfordringen lå i den kvantitative isolering av exosomal miRNA fra PLF. Weber et al. evaluert miRNA ekspresjon i 12 kroppsvæsker og rapporterte at den totale RNA-konsentrasjonen i peritoneal væske var 775 ug /l [25], som var mindre enn det vi oppnådd fra MA og PLF-4400 og 6400 ug /l, henholdsvis Årsaken til forskjellen kan være den metoden som er benyttet for isolering av total-RNA, fordi Weber et al. direkte hentet RNA fra peritoneal væske, mens vi først isolert exosomes og deretter brukt disse for RNA ekstraksjon. Analyse av kvaliteten av RNA isolert fra PLF viste en overflod av små ( 200 nt) RNA-arter i CM og MA. Det var ingen distinkte 18S og 28S ribosomale RNA toppene i forberedelse, indikerer fravær av forurensning med intracellulær RNA.
Det andre problemet oppstått i denne studien involverte konsistens i kvaliteten på exosomal miRNAs isolert. I vår studie observerte vi lav variasjon i antall oppdagede miRNA arter og miRNA signalintensitet, og en høy korrelasjon av miRNA uttrykk blant prøvene i hver gruppe. De gjennomsnittlige antall påvisbare mirnas i MA og PLF var 490 og 367, som var i samsvar med antall mirnas (397) tidligere påvist i peritonealvæsken [25].
PLF og MA prøvene viste lav variasjon i signalintensitet (CV = 3,87% for 50
th persentil). Videre miRNA uttrykk mønstre var sterkt korrelert mellom prøvene i hver gruppe (CC 0,850), så vel som mellom gruppene (0,8 CC 0,7). Resultatene indikerte at PLF kan være en high-yield kilde til god kvalitet miRNAs, som viser konsekvente uttrykk mønstre i microarray analyse.
miRNA uttrykk profiler ble analysert for å velge mirnas spesifikke for peritoneal metastaser. MiR-21 viste høyere uttrykk hos pasienter med T4-trinns karsinom enn i de av T1-T3 gruppe. Fabbri et al. rapportert at MIR-21 og MIR-29a i kreft utgitt exosomes påvirket tumorvekst og spres ved å binde seg til og aktivere TLRs i de omkringliggende immunceller og indusere en prometastatic betennelsesreaksjon [29]; Dette støttet tanken om at tumor-avledet exosomes bidra til premetastatic mikro [30, 31]. Dette kan tyde på at T4 karsinom-avledet exosomes opprette premetastatic nisje i bukhinnen, som deretter støtter peritoneal invasjon etter kurativ reseksjon av GC.
Ved hjelp av en trinnvis tilnærming, vi valgt ut fem exosomal mirnas (MIR-320C , MIR-1202, MIR-1225-5p, MIR-1207-5p, og MIR-7270) og validert MIR-320 og miR1225-5p uttrykk i PLF 18 CG pasienter ved QRT-PCR. Mir-1225-5p viste økt ekspresjon i T4 enn i T1-T3 trinns CG pasienter, resultatene oppnådd ved microarray bekrefter, mens det ikke var noen forskjell i MIR-320 nivåer mellom pasientgrupper. Mir-1225 mål polycystisk nyresykdom genet,
PKD1
, som ofte mutert i autosomal dominant polycystisk nyresykdom; således kan miR1225 påvirke utviklingen av denne sykdom [31]. Men forholdet mellom MIR-1225 og kreft er fortsatt uklar. MiR-21 og MIR-1225-5p kan utarbeide en premetastatic nisje i bukhinnen for formidling og oppgjør av metastaserende kreftceller og dermed kan indikere predisposisjon for peritoneal tilbakefall etter kurativ GC reseksjon.
PLF gir informasjon om statusen til peritoneum, for eksempel endringer i populasjonen av immunceller og sekresjon av vekstfaktorer og cytokiner [32, 33]. Cytologi og molekylære diagnostiske analyser er basert på påvisning av kreftceller, mens profilering av miRNAs i PLF kan brukes for prediksjon av en peritoneal premetastatic fenotype i GC, og sikrer mer effektive forebyggende og kurative tiltak.
