Abstract
Bakgrunn
Plateepitelkarsinom i hode og hals (SCCHN) er den syvende vanligste kreftformen i verden. Dessverre har overlevelsen av pasienter med SCCHN ikke bedret seg i de siste 40 årene, og dermed nye mål for behandling er nødvendig. Nylig ble økninger i serumnivå av interleukin 6 (IL-6) og uttrykk for Twist i tumorprøver funnet å være assosiert med dårlig klinisk utfall i flere typer kreft, inkludert SCCHN. Selv om Twist har vært foreslått som en hovedregulator av epitelial-mesenchymale overgang og metastase i kreftformer, de mekanismer som Twist nivåer er regulert post-translasjonelt er ikke helt forstått. Tumorprogresjon er kjennetegnet ved involvering av cytokiner og vekstfaktorer og Twist induksjonen har vært forbundet med et antall av disse signalveier, inkludert IL-6. Siden mange av effektene av IL-6 er mediert gjennom aktivering av protein fosforylering kaskader, innebærer dette at Twist uttrykket må være under en stram kontroll på post-translasjonell nivå for å svare på en riktig måte å ytre stimuli.
metodikk /hovedfunnene
Våre data viser at IL-6 øker Twist uttrykk via en transkripsjon uavhengig mekanisme i mange SCCHN cellelinjer. Videre undersøkelser viste at IL-6 stabiliserer Twist i SCCHN cellelinjer gjennom kasein kinase 2 (CK2) fosforylering av Twist rester S18 og S20, og at dette fosforylering hemmer nedbrytning av Twist. Twist fosforylering ikke bare øker dens stabilitet, men også forbedrer celle motilitet. Dermed post-translasjonell modulering av Twist bidrar til sin kreftfremmende egenskaper.
Konklusjon /Betydning
Vår studie viser Twist uttrykk kan reguleres på post-translasjonell nivå gjennom fosforylering av CK2, som øker Twist stabilitet i respons til IL-6 stimulering. Våre funn gir ikke bare nye mekanistiske innsikt i post-translasjonell regulering av Twist, men også foreslå at CK2 kan være en levedyktig terapeutisk mål i SCCHN
Citation. Su YW, Xie TX, Sano D, Myers JN (2011 ) IL-6 Stabiliserer Twist og Forbedrer Tumor cellemotilitet i hode og nakke kreft celler gjennom Aktivering av kasein kinase 2. PLoS ONE 6 (4): e19412. doi: 10,1371 /journal.pone.0019412
Redaktør: Torbjørn Ramqvist, Karolinska Institutet, Sverige
mottatt: 22 desember 2010; Godkjent: 31 mars 2011; Publisert: 29 april 2011
Copyright: © 2011 Su et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av The University of Texas MD Anderson Cancer Center SPORE i hode- og halskreft bevilgning P50 CA097007, National Institutes of Health Cancer Center Support stipend CA016672, og Pantheon og Broudy «forplikte seg til The Cure» stiftelser. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Plateepitelkarsinom i hode og hals (SCCHN) er den syvende vanligste kreftformen i verden [1]. Til tross for forbedringer i kirurgiske og strålebehandling teknikker, har fem års overlevelse ikke bedret seg betydelig de siste tiårene, og holder seg på 50-55%. Selv om lokale tilbakefall og nakke lymfeknutemetastaser står for mesteparten av dødsfall fra denne sykdommen, bare 10-20% av pasienter har nytte av integrering av systemisk kjemoterapeutisk behandling, med marginalt forbedret overlevelse og betydelige toksiske effekter [2], [3]. Derfor er nye mål for terapi nødvendig
Nylig har overekspresjon av Twist i kliniske vevsprøver ble funnet å være korrelert med metastase og dårlig prognose i pasienter med SCCHN, så vel som andre kreft [4] -. [7] . Twist er en svært konservert basic-helix-loop-helix transkripsjon faktor som spiller en viktig rolle i å tilrettelegge celle bevegelse i utviklingen av embryo. I kreftceller, er Twist regnes som et onkogen, som sin opphøyde uttrykk fremmer sykdomsutvikling og metastase ved å fremkalle den epiteliale-mesenchymale overgang (EMT) [8].
Til tross for sin betydning i tumorprogresjon, post-transcriptional regulering av Twist er ikke godt forstått
En komparativ analyse av Twist mRNA og Twist protein uttrykk i museembryoer viste rikelig Twist RNA uttrykk i presomitic mesoderm, epiteliale somites, og anterior mesoderm, men ingen Twist protein kan bli funnet i de vev [9]. Avviket ble også bemerket under musen embryo utvikling, som Twist RNA når sitt høyeste nivå på 7,0 dager etter samleie mens ingen Twist protein kan bli funnet før 8,25 dager etter samleie. Mangelen på samsvar mellom Twist mRNA uttrykk og Twist protein uttrykk indikerer at Twist uttrykk styres ved post-transkripsjonsnivået [9]. Post-transkripsjonell modifikasjon av transkripsjonsfaktorer, inkludert fosforylering og ubiquitinering, har vist seg å være viktig for deres funksjon, da dette tilveiebringer en mekanisme ved hvilken cellen kan hurtig initiere transkripsjonelle programmer som reaksjon på ytre stimuli. For eksempel har det blitt rapportert at Twist kan brytes ned via ubikvitin /proteasom-reaksjonsveien degradering, som behandling med en proteasominhibitor inhiberer degradering av Twist [10]. Det er også bevis for at funksjonen til Twist kan moduleres ved fosforylering [11], [12]. Fordi fosforylering er ofte involvert i reguleringen av et protein s ubiquitin /proteasom-avhengig nedbrytning [13], hypotese vi at fosforylering av Twist øker stabiliteten ved å øke dets relative ekspresjonsnivået.
SCCHN tumorigenesis og progresjon er kjent for å være påvirket av flere vekstfaktorer og cytokin aliserte faktorer, inkludert interleukin 6 (IL-6) [14] – [17]. I SCCHN pasienter, korrelerer forhøyet serum-IL-6-nivå med dårlig overlevelse og ugunstig klinisk utfall [14], [15], [18]. IL-6, fremstilt enten ved infiltrering av immun-celler eller tumorceller, ikke bare gir overlevelsessignaler til kreftceller, men forenkler også motilitet av kreftceller gjennom EMT [19], [20]. Den tradisjonelle IL-6 signalveien er gjennom binding med sIL-6 reseptor (gp80), som induserer dimerisering av gp130 og påfølgende aktivering av enten Janus-kinaser (JAK) /STAT3 i en transkripsjonsavhengig måte, eller Ras-MAPK og PI3K /Akt sti [21]. I tillegg til kanoniske trasé, kasein kinase 2 (CK2) har også nylig blitt rapportert nedstrøms for IL-6-signalisering i kreft [22].
CK2 er et sterkt konservert og ubikvitært uttrykt serin /treonin-kinase, som består av to katalytisk (α eller α «) og to p-regulatoriske subenheter [23]. Betydningen av CK2 underenheter kan demonstreres ved genetiske studier som viser at mus som manglet CK2α eller CK2β er i sin spede dødelig mens CK2 a «knockout-mus som hadde defekter bare i spermatogenesen [24] – [26]. CK2 har nylig kommet til å bli ansett som en «master-kinase» siden den regulerer aktiviteten til mange andre kinaser, og er involvert i mange viktige cellulære prosesser [27]. For eksempel styrer CK2 stabiliteten IκBα og PML tumor suppressor gjennom fosforylering og modifikasjon av deres ubiquitin /proteasome degradering [28], [29]. CK2 har blitt rapportert å være overuttrykt og å korrelere med dårlig overlevelse i mange tumortyper, inkludert SCCHN [30] – [32]. Tradisjonelt er CK2 betraktet som en konstitutivt aktiv proteinkinase, men flere studier har vist at CK2 kan svare på mange vekstfaktor stimuli, inkludert IL-6 [22], [33], selv om mekanismene for dens aktivering i hovedsak forblir uklar [34 ].
det har blitt rapportert at STAT3, den store nedstrømssignalet til IL-6 vei, kan transkripsjonelt aktivere ekspresjon av Twist [35], [36]. Våre foreløpige data viste imidlertid ble det Twist proteinekspresjon økte med IL-6 før den oppregulering av Twist mRNA i flere aggressive SCCHN cellelinjer, noe som tyder på en transkripsjons uavhengig regulering av Twist av IL-6. Siden mange av effektene av IL-6 blir mediert gjennom aktivering av protein fosforylering kaskader [21], og substratfosforylering er ofte involvert i regulering av et protein s ubiquitin /proteasom-avhengig nedbrytning [37], postulerte vi at Twist ekspresjon blir regulert av IL-6-aktivert fosforylering.
i denne studien vi vise at behandling av SCCHN cellelinjer med IL-6 fører til stabilisering av Twist proteinet. Videre undersøkelser viste at IL-6 stimulerer Twist fosforylering gjennom aktivering av CK2 serin /treonin proteinkinase. Våre funn gir ikke bare en roman mekanistisk innsikt som Twist aktiveres gjennom fosforylering av CK2 kinase men også har betydelige implikasjoner for forutsigelse og behandling av hode og nakke kreft.
Resultater
Twist uttrykk oppreguleres kort tid etter at IL-6 behandling
De fleste SCCHN og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinjer utskiller IL-6 og uttrykker reseptorer for IL-6 (tabell S1 og figur S1) [38]. For å studere virkningen av IL-6 på disse cellelinjer, ble undersøkt Twist uttrykk langs tidsforløpet av behandlingen. Western blot fra representative cellelinjer er vist i figur 1A. Twist ekspresjon ble indusert i disse celler i løpet av 15 minutter etter behandling med IL-6. I kontrast, Twist mRNA nivåer forble uendret over en lignende behandling periode (figur 1B). Disse data indikerer at Twist ekspresjon blir regulert av IL-6 på det post-transkripsjonelle nivå.
(A) Twist-protein-ekspresjon ble indusert kort tid etter IL-6 behandling i SCCHN celler (OSC-19, HN31) og lungekreftceller (A549). Etter serum sult over natten, ble cellene utsatt for IL-6-behandling (20 ng /ml i 0-4 h), og Twist ekspresjon i cellelysatene ble analysert ved hjelp av western blot. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (B) Twist mRNA uttrykk som kvantifisert ved real-time RT-PCR vært stort sett uendret gjennom IL-6 behandling (0-6 timer). Verdier ble normalisert til uttrykket nivåer av husholdningsgenet
GAPDH
, og er uttrykt som den midlere fold forandring fra basalnivået ± S.E.M. For hvert tidspunkt, ble to til fire replikater utført. Alle forsøk ble utført in duplo for hver cellelinje. Data fra et representativt eksperiment med OSC-19 SCCHN celler er vist. (C) Twist nedbrytning ble hemmet av enten MG132 eller IL-6. Etter OSC-19 SCCHN-celler ble behandlet med CHX (100 uM), CHX pluss proteasominhibitor MG132 (10 uM), eller CHX pluss IL-6 (20 ng /ml) i 0-4 timer ble Twist ekspresjon bestemt ved western blot. (D) Et bildeelementer i hvert bånd i (C) ble målt ved bilde J og normalisert slik at antallet piksler ved tid 0 var 100%. Dataene er plottet som stokken
10 av den relative pikseltetthet (y-aksen) som funksjon av tiden (min). Halveringstiden ble bestemt ut fra loggen over 50% relativ pikseltetthet. Halveringstiden for Twist var 1,2 h i nærvær av CHX alene og . 4 timer i nærvær av CHX + IL-6
Denne observasjonen at IL-6 oppregulerer Twist uttrykk post- transcriptionally ledet oss til å undersøke om degradering av Twist ble i sin tur modulert av IL-6 behandling. Nedbrytningsrater Twist i SCCHN celler ble undersøkt ved behandling med proteinsyntese inhibitor cycloheximide (CHX) alene, CHX pluss proteasominhibitor MG132, eller CHX pluss IL-6. Mengden av protein ved hvert tidspunkt ble bestemt ved western blot og kvantifisert ved densitometri. Som vist i figur 1C og 1D, endogen Twist hadde en 1,2-h halveringstid, men når enten IL-6 eller MG132 ble lagt, mindre Twist var degradert og det gjorde ikke nå sitt halveringstid i 4-h behandlingsperioden . Dataene er konsistente med en tidligere studie som viser at Twist protein brytes ned gjennom proteasome degradering system [10] og indikerer at Twist protein er stabilisert post-translatorisk gjennom hemming av sin nedbrytning av IL-6.
Twist fosforyleres som respons på IL-6 behandling, og CK2 er funnet i banen mellom IL-6 og Twist
Ettersom IL-6 har blitt vist å aktivere flere cellesignalveier gjennom aktivering av proteinkinase-kaskader, vi neste undersøkt om Twist er fosforylert i respons til IL-6 behandling. Celler transfektert med et plasmid som koder for en hemagglutinin (HA) Twist-fusjonsproteinet ble behandlet med IL-6; påfølgende immunoprecipitation med et HA antistoff og western blotting ved hjelp av en uspesifikk fosfoserin- antistoff avslørte økt fosforylering av serin /treonin rester i Twist (figur 2A), som bekrefter at Twist er fosforylert i respons til IL-6 stimulering.
(A ) Twist ble fosforylert i respons til IL-6-behandling. OSC-19 SCCHN-celler ble transfektert med enten HA-Twist plasmid eller styrevektoren i 48 timer, deretter behandlet med IL-6 (20 ng /ml) i 30 min; behandlede og ubehandlede cellelysatene ble immunpresipitert med HA-antistoff og analysert ved western blot ved anvendelse av en ikke-spesifikk fosfoserin antistoff. (B) Hemmere til kjente nedstrøms veiene for IL-6 var ikke i stand til å inhibere Twist oppregulering av IL-6. OSC-19 SCCHN-celler ble forbehandlet med de angitte kinase inhibitorer eller dimetylsulfoksyd (DMSO; kontroll) i 1 time, deretter ble behandlet med IL-6 (20 ng /ml) i 30 min. Twist ble bestemt ved western blot. (C) Et CK2 fosforyleringssetet (SNSE) i Twist, forutsagt ved bruk av https://scansite.mit.edu/motifscan_seq.phtml, er konservert på tvers av arter. (D) CK2-aktiviteten ble økt med IL-6 og inhibert av CK2-inhibitor DMAT i SCCHN celler. Etter serum sult over natten, ble lysater av HN31 celler behandlet med PBS (kontroll), IL-6 (20 ng /ml, 30 min), eller IL-6 pluss DMAT (10 pM) oppsamlet. Endogen CK2 aktivitet i cellelysatene (5 ug) ble målt ved anvendelse av et syntetisk peptid CK2 substrat (RRRADDSDDDDD; 0,1 mM) og γ-
32P-ATP som en fosfatdonor som tidligere beskrevet [49]. Y-aksen representerer tellingen per minutt (CPM) av radioaktivitet etter normalisering til den ikke-substratet kontroll. *
P
0,05 av Student
t
-test. (E) IL-6-indusert Twist-ekspresjon ble inhibert av CK2-inhibitorer. Twist ekspresjon ble målt etter behandling med IL-6 (30 min) i lysater av OSC-19 SCCHN eller A549 lungekreftceller tidligere inkubert i CK2 inhibitorer DMAT eller TBB (1 time). Twist ekspresjon ble inhibert ved doser så lave som 0,8 uM og er ikke begrenset til en spesiell cellelinje. (F) knockdown av den katalytiske subenhet av CK2 (CK2α) med shRNA hemmet Twist proteinekspresjon. Knockdown av CK2α i OSC-19 SCCHN celler for 24 timer betydelig redusert Twist uttrykk og blokkerte sin induksjon av IL-6-behandling (20 ng /ml, 30 min).
Å identifisere kinase ansvarlig for IL-6-indusert fosforylering av Twist, anvendte vi en kjemisk inhibitor screeningstrategi for å bestemme hvorvidt IL-6-mediert Twist oppregulering kan blokkeres av kinase-inhibitorer er kjent for å være nedstrøms fra signalveien. Twist ble oppregulert av IL-6 til tross for bruk av hemmere blokkerer JAK (AG490), PI-3K (Wortmannin), Erk (U0126), p38 MAPK (SB202130), eller juni
N
terminale kinase (SP600125) dette indikerer at Twist oppregulering er uavhengig av disse baner (figur 2B). Siden ingen av de kjente veier som vi har testet ut til å være involvert i mediering av IL-6-indusert ekspresjon Twist, vi neste skannet aminosyresekvensen i beregningsproteinfamilie forutsigelse webserver https://scansite.mit.edu/motifscan_seq.phtml og identifisert en CK2 substrat konsensus motiv (SNSE) innen Twist på restene 18 til 21 som er konservert over arter (Figur 2C)
CK2 er en serin /treonin kinase.; økende nylige studier indikerer at den kan spille en viktig rolle i progresjon av SCCHN [32], [39]. Det ble tidligere betraktet som en konstitutivt aktiv intracellulær kinase, men flere nyere funn har vist at CK2 kan aktiveres i respons på ytre stimuli slik som IL-6, selv om de underliggende mekanismer for aktivering forblir uklar [22], [34]. I overensstemmelse med tidligere studier, ble CK2 aktivitet i SCCHN cellelysater oppregulert ved IL-6 og inhibert av CK2-spesifikk inhibitor 2-dimetylamino-4, 5, 6, 7-tetrabrom-1 H-benzimidazol (DMAT), som bestemt ved en CK2 kinase aktivitet assay som brukte en syntetisk CK2 Substratpeptidet og γ-
32P-ATP som en fosfatdonor (figur 2D).
For ytterligere å demonstrere at CK2 er i veien mellom IL-6 og Twist, vi neste undersøkt Twist uttrykk i nærvær av IL-6 og CK2 hemmere DMAT eller 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole (TBB). Som vist i figur 2E, ble IL-6-indusert Twist ekspresjon hemmet av enten CK2-inhibitor og denne inhibering ble observert i forskjellige cellelinjer. Virkningene av CK2 på IL-6-indusert Twist ekspresjon ble ytterligere bekreftet ved knockdown av den katalytiske subenhet CK2α i SCCHN cellelinjer, hvor både basal nivåene av Twist uttrykk og de etter IL-6 behandling ble redusert (figur 2F). Samlet utgjør disse dataene ytterligere bekrefter viktigheten av CK2 til IL-6-indusert stabilisering av Twist.
CK2 kollegaer med, phosphorylates, og stabiliserer Twist
Vi neste undersøkt om CK2 og Twist er forbundet med hverandre ved hjelp av ko-immunoutfellingsstudier eksperimenter. Først brukte vi lysatene fremstilt fra HEK 293T celler transfektert med både villtype Myc-Twist og CK2α. Som vist i figur 3A, ble CK2α oppdaget i vestlige blotter av immunpresipitatene utført med Myc antistoff og Myc-Twist ble oppdaget i den vestlige blotter av immunpresipitatene utført med CK2α antistoff. Kontroll immunopresipitater ved hjelp av ikke-spesifikk IgG falt ikke ut enten protein. Dataene tyder på at proteinene kan kommunisere med hverandre. For ytterligere å undersøke samspillet mellom endogen CK2α og Twist protein i SCCHN celler ble Fadu cellelinje valgt fordi det uttrykker en høy basal nivå av CK2 protein; HN31 SCCHN celler som stabilt uttrykker Myc-taggede Twist (HN31 Myc-Twist SCCHN celler) ble etablert for immunoutfellingsstudier formål på grunn av dårlige prestasjoner av de kommersielt tilgjengelige Twist antistoffer. Som vist i figur 3B, endogen Twist i Fadu SCCHN celler var co-immunoutfelt med et anti-CK2α antistoff. I HN31 Myc-Twist SCCHN celler som stabilt uttrykker Myc-merket Twist, endogen CK2α var også co-utfelt med anti-myc immunpresipitatene. Disse data støtter hypotesen om at CK2 kan regulere Twist ved å vise at disse to proteiner er fysisk assosierer med hverandre
(A) og amp;. (B) Toveis ko-immunutfelling viste at CK2α er forbundet med Twist. (A) Co-immunoutfelling ble utført i lysater fra HEK 293T-celler transfektert med både WT Myc-vri og CK2α. CK2α ble co-immunopresipitert med Myc-Twist og vice versa. (B) Cellelysater fra Fadu (venstre) eller HN31 celler som stabilt uttrykker WT Myc-Twist (til høyre), ble immunopresipitert med CK2α (i Fadu celler) eller Myc antistoff (i HN31 WT Myc-Twist celler) og utsatt for vestlig blot-analyse. Endogen Twist ble co-immunopresipitert med CK2α i Fadu cellelysater, og endogene CK2α ble funnet i MYC-immunpresipitatene av HN31 Myc-WT Twist cellelysater. (C) co-immunopresipitert CK2α i HN31 Myc-Twist immunopresipitater ble økt ved hjelp av IL-6 (20 ng /ml, 20 min) og inhiberes ved forbehandling med et antistoff mot IL-6-reseptor, tocilizumab (50 ng /ml, 45 min). (D) CK2 fosforylert Twist. En immun kinase analysen ble utført på MYC-immunpresipitatene fra HEK 293T cellelysater forbigående overekspresjon WT Myc-Twist eller Myc -S18,20A Twist. Rekombinant CK2 kinase og γ-
32P-ATP ble tilsatt til immunopresipitatene ved 30 ° C i 15 minutter, og reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av SDS-prøvebuffer og oppvarming ved 95 ° C i 5-10 min. Prøvene ble deretter underkastet elektroforese og overført til en polyvinylidenfluorid membran for autoradiografi eller western blot-analyse. (E) Stabiliteten Twist ble påvirket av området av CK2 fosforylering. [HN31 SCCHN-celler som stabilt uttrykker WT Myc-Twist, den CK2 hypophosphomimetic mutant Myc-S18,20A Twist, eller fosforylering-mimetiske mutant Myc-S18,20D Twist var behandlet med CHX (100 uM) i de angitte tidsrom. Myc-Twist ekspresjon i cellelysatene ble bestemt ved western blot. Data representerer en av tre uavhengige eksperimenter. De beregnede halveringstiden (t1 /2) fra den tredoble forsøkene er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. *
P
. 0,05 av Student
t
-test
For å undersøke om samspillet mellom Twist og CK2α er IL-6 avhengige, co- immunoutfelling ble gjentatt i Myc-Twist-stabil cellelinje HN31 etter kort behandling med IL-6 (20 min). Fordi HN31 uttrykker høye nivåer av endogent IL-6 (tabell S1), et monoklonalt antistoff mot IL-6 reseptoren, tocilizubam ble anvendt for å undersøke deres interaksjon i henhold til blokkering av IL-6 signalering. Som vist i figur 3C, økt CK2α ble co-immunopresipitert med Myc-Twist etter IL-6 behandling, men ble ikke funnet i immunpresipitatene fra celler forbehandlet med tocilizumab i 45 min.
For å avgjøre om CK2 phosphorylates Twist på rester S18 /S20, den antatte fosforylering nettstedet fra vår beregnings prediksjon, utførte vi et immun kinase analyse i HEK 293T celler overekspresjon enten villtype (WT) Myc-Twist eller mutant Myc-Twist som S18 og S20 er erstattet med alanin ( S18,20A Twist). Renset CK2 kinase fosforylert WT Twist, men fosforylering ble avskaffet i nærvær av CK2 inhibitor DMAT og sterkt redusert i mutert S18,20A Twist (figur 3D).
For å teste om stabilitet Twist er påvirket av stedet fosforylering ble stabile HN31 celler som overuttrykker WT Twist, S18,20A Twist, eller en fosforylering ligner hvor S18 og S20 er mutert til asparaginsyre (S18,20D Twist) etablert. Etter behandling av cellene med CHX, de beregnede halveringstider for S18,20D Twist, S18,20A Twist, og WT Twist fra de tre forsøkene var 9.62 ± 0.99 h for S18,20D Twist, 2,45 ± 0,59 h for S18,20A Twist og 4,69 ± 0,73 h for WT Twist (Figur 3E). Alle
P
verdier for å sammenligne hjelp fra noen to grupper med Student
t
-test var mindre enn 0,05. Dette støtter hypotesen om at fosforylering av Twist av CK2 forbedrer Twist stabilitet. Samlet utgjør disse dataene indikerer at CK2 forbinder med og fosforylerer Twist, og at fosforylering på S18 og S20 stabiliserer Twist.
CK2 og Twist er involvert i IL-6-forfremmet cellemotilitet
neste undersøkte effekten av IL-6, CK2-inhibering, og vri knockdown på SCCHN celle motilitet, målt ved sårhelende og Boyden-kammer migrerings analyser. Som vist i figurene 4A og 4B, ble migrering av OSC-19 SCCHN-celler i en 12-h sårhelende ripe assay fremmet av IL-6 og undertrykt av CK2-inhibitor DMAT, mens den relative formeringshastigheten i hver gruppe gjennomgikk ingen betydelig endring (Figur 4C). Knockdown av Twist i OSC-19 celler dypt undertrykt cellemotilitet, noe som indikerer sin viktige rolle i celle migrasjon (figur 5A, øvre panel). Etter behandling med IL-6 i 24 timer, ble migrasjon økt, men denne økningen ble reversert i Twist knockdown gruppene (figur 5A, midt panel). IL-6-forfremmet cellemigrasjon ble hemmet av CK2 inhibitor samt knockdown av Twist, noe som tyder på at både CK2 og Twist er innblandet i signal-indusert migrasjon. Deretter undersøkte motiliteten i cellelinjer som stabilt uttrykker WT eller muterte Twist
in vitro
. Til tross for den høye bakgrunn av endogent IL-6 sekresjon og tilstedeværelsen av endogent Twist i HN31 SCCHN celler, overekspresjon av WT, men ikke S18,20A, fremmet Twist cellevandring i forhold til kontrollgruppen (figur 5B, øvre panel;
P
0,05). Videre er overekspresjon av S18,20D Twist ytterligere økt celle motilitet forhold til den for celler som uttrykker enten WT eller S18,20A Twist, noe som tyder på at denne mutasjonen fører til økt celle motilitet.
(A) Bilder til SCCHN cellemigrering av sårhelende analyse er vist. OSC-19 SCCHN-celler ble behandlet med PBS (kontroll), IL-6 (20 ng /ml), DMAT (20 uM), eller både IL-6 og DMAT i 2% medium som angitt. Den konfluente cellemono ble såret ved å skrape med en 200-mL pipette tips. Bilder av riper ble kjøpt til 0 og 12 timer. (B) Kvantitative målinger av den relative avstand migrerte ble analysert med bilde J. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. av den relative migrerte avstand. *
P
0,05 av Student
t
-test. (C) celleformeringshastigheten under hver betingelse i (A) ble målt ved MTT-analyse i 12 timer. Forskjeller mellom grupper ikke har noen statistisk signifikans.
(A) knockdown av Twist hemmet SCCHN celle migrasjon i Boyden kammeret migrasjon analysen. OSC-19 SCCHN celler ble først transfektert med kontroll vektor eller Twist shRNAs i 24 timer i medium med eller uten IL-6 (20 ng /ml). Cellene ble deretter underkastet trypsinisering, telles, og analysert med hensyn på celle motilitet ved anvendelse av en Boyd kammer migrasjonsanalysen etter 20 timer. Øvre middel paneler: Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik av celletall fra fire forskjellige lavere effekt felt mikroskopiske utsikt. *
P
0,05 av Student
t
-test. Nedre panel: Twist uttrykk for tilsvarende eksperimenter i de øvre og midtre paneler ble oppdaget av western blot. p-aktin ble brukt som lasting kontroll. (B) Mutasjon av Twist endret migrering av SCCHN celler. Bevegeligheten av HN31 SCCHN-celler som stabilt uttrykker WT Myc-Twist eller indikert mutant Myc-Twist protein ble undersøkt med Boyden kammeret migrasjon analysen etter 20 timer. Øvre panel: Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. av celletall fra fire forskjellige lavere effekt felt mikroskopiske utsikt. *
P
0,05 av Student
t
-test. Midtre panelet: representative bilder av de migrerte celler fra de tilsvarende Transwell membraner ved lavt strømforbruk feltet forstørrelse. Nedre panel: Western blot for de tilsvarende eksperimenter i øvre panel av (B). p-aktin ble brukt som lasting kontroll. (C) celle proliferasjon av hver tilstand i (B), som målt ved MTT-analyse i 20 timer. Forskjeller mellom grupper ikke har noen statistisk signifikans.
Diskusjoner
Denne rapporten viser en ny post-translasjonell phosphoregulation av Twist av IL-6 gjennom aktivering av CK2 i SCCHN celler. Dette post-translasjonell modifikasjon kan stabilisere Twist, slik at det å regulere cellemotilitet, som gir bevis for en ny mekanisme for Twist regulering i kreftceller.
Publiserte rapporter har impliserte både Twist og IL-6 i utvikling /progresjon av kreft, som deres uttrykk kan påvises i mange epiteliale tumorer eller pasientens serum og er assosiert med uheldige kliniske resultater [4], [16], [18]. Selv om det har blitt rapportert at IL-6, og dens nedstrøms signalformidler, STAT3 kan øke Twist uttrykk gjennom transkripsjon i brystkreftcellelinjer [20], [35], [36], betyr dette ikke utelukker mekanismen for post-translasjonell modifisering av Twist uttrykk. Som vist i figur 2B, er Twist ekspresjon indusert kort tid etter at IL-6-behandling til tross for inhibering av fosfo-STAT3 ved kjemisk inhibitor AG490 eller SB202130 ved høyere doser, noe som indikerer at Twist oppregulering er STAT3 uavhengig. Som vist i figur 1A og 1B, Twist proteinekspresjon markert øket før forandringer i Twist mRNA-ekspresjon i SCCHN cellelinjer. Disse funnene har ingen motsi de av en tidligere studie av Lo
et al product: [36], hvor Twist protein ble indusert ved en time etter aktivering av EGFR-fosfor-STAT3 veien mens Twist mRNA nivåer bare økt etter 2 timer med behandling. Selv om det ikke ble diskutert i tidligere arbeid, avviket mellom Twist mRNA og protein uttrykk i vår studie indikerer eksistensen av en post-transcriptional reguleringsmekanisme på tvers av ulike cellelinjer.
Våre data viser at Twist protein kan være fosforylert og stabilisert av IL-6 i SCCHN cellelinjer, støtter konseptet at phosphoregulation av transkripsjonsfaktorer er ofte benyttet av flere cellulære signalveier for betimelig reaksjon på ytre stimuli [37]. Selv Twist phosphoregulation har blitt beskrevet i studier av Twist mutasjoner hos pasienter med Sæthre-Chotzen syndrom, en autosomal dominant forstyrrelse av craniosynostosis [11], rollen phosphoregulation Twist i kreftceller, så vidt vi vet, har vært diskutert i bare noen få studier [12], [40]. Den CK2 fosforyleringssetet (S18 og S20) identifisert i denne studien er plassert innenfor den NSEEE motivet, en av fem evolusjonært konserverte domener i Twist aminosyresekvens, hvis funksjon er uklar [41]. Våre funn kan bidra til å forbedre forståelsen av dette domene, ettersom CK2 er forbundet med mange vekstfaktor eller cytokin-reaksjonsveier, slik som IL-6 og epidermal vekstfaktor (EGF), hvori Twist er også involvert [20], [22], [ ,,,0],33], [36].
Interessant nok er disse faktorene også kjent for å påvirke tumorgenese og progresjon av SCCHN [16]. Vi analyserte post-transkripsjonell regulering av Twist i respons til andre SCCHN relevante cytokiner /vekstfaktorer og fant at funksjonen med å stabilisere Twist er ikke begrenset til IL-6. Andre viktige vekstfaktorer i SCCHN, slik som EGF og vaskulær endotelial vekstfaktor C, også stabilisere Twist nivåer [Figur S2]. Dette tyder på at en felles mekanisme kan delta i reguleringen av Twist i SCCHN, og at det kan være interessant å vite hvilken rolle CK2 i disse signalveier.
mekanisme som CK2 aktiveres fortsatt uklart [34] . Selv om det har blitt vist at CK2 aktivering er Erk-avhengige i neuroblastom-celler [33], farmakologisk inhibering av Erk med U0126 i vår studie ikke blokkerer IL-6-mediert økning i Twist uttrykket (figur 2B). Dette tyder på at det kan være andre enn Erk som kan aktivere CK2 celle meklere. Hvorvidt dette er celletype spesifikke behov for å bli etterforsket videre.
metastaser er stor trussel mot helse og overlevelse av kreftpasienter og dets ledelse er utfordrende for helsepersonell. Siden Twist regnes som en mester regulator av EMT og metastase for kreft [8], har nedregulering av Twist i kreftceller er foreslått som et lovende terapeutisk tilnærming, da det ikke bare sensitizes celler til kjemoterapi og fremmer celle apoptose men også hemmer cellene «trekkende og invasive egenskaper [33], [42].
