Abstract
Vi har tidligere vist at en stromal celle-stammer factor-1 (SDF-1; CXCL12) /CXCR4 systemet er involvert i etableringen av metastaser i kreft i munnhulen. Nylig har små ikke-kodende RNA, microRNAs (mirnas) er blitt vist å være involvert i metastatiske prosess av flere typer kreft. Imidlertid mirnas som bidrar til metastaser indusert av SDF-1 /CXCR4 system i munnhulen er i stor grad ukjent. I denne studien undersøkte vi de metastaserelaterte mirnas indusert av SDF-1 /CXCR4 system som bruker B88-SDF-1 orale kreftceller, som viser funksjonell CXCR4 og fjernt metastatisk potensial
in vivo
. Gjennom miRNA microarray analyse, identifiserte vi oppregulering av MIR-518c-5p B88-SDF-1 celler, og bekreftet induksjon av real-time PCR-analyse. Selv om en LNA-baserte MIR-518c-5p-inhibitoren ikke påvirke cellevekst av B88-SDF-1-celler, var det signifikant inhibere migreringen av celler. Deretter transfektert vi en MIR-518c ekspresjonsvektor inn foreldre B88 celler og CAL27 oral kreft celler og isolerte stabile transfektanter, B88-518c og CAL27-518c celler, henholdsvis. Den forankringsavhengige og-uavhengig vekst av MIR-518c transfektanter ble betydelig forbedret sammenlignet med veksten av mock-celler. Dessuten har vi oppdaget at den forbedrede migrering av disse cellene. LNA-baserte MIR-518c-5p hemmer betydelig svekket forbedret cellevekst og migrasjon av MIR-518c transfektanter, noe som indikerer at disse fenomenene var i hovedsak avhengig av uttrykk for MIR-518c-5p. Deretter undersøkte vi funksjonen til MIR-518c-5p
in vivo
. MIR-518c transfektanter eller håne transfektanter ble inokulert i tyggemuskelen eller blodkarene i nakne mus. Tumor volum, lymfeknuter metastase, og lungemetastaser ble betydelig økt i mus inokulert med Mir-518c transfektanter. Resultatene indikerte at Mir-518c-5p regulerer vekst og metastasering av kreft i munnhulen som en nedstrøms målet for SDF-1 /CXCR4 system
Citation. Kinouchi M, Uchida D, Kuribayashi N, Tamatani T, Nagai H, Miyamoto Y (2014) Involvering av MIR-518c-5p til vekst og metastaser i Oral Cancer. PLoS ONE 9 (12): e115936. doi: 10,1371 /journal.pone.0115936
Redaktør: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, USA
mottatt: 11 august 2014; Godkjent: 02.12.2014; Publisert: 23.12.2014
Copyright: © 2014 Kinouchi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet av en Grant-in-Aid for Scientific Research (B; 25293411 og C; 26463046; http: //www.. jsps.go.jp/english/e-grants/grants01.html). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Vi har tidligere vist at B88 celler, som er muntlige kreftceller som uttrykker kjemokinreseptoren CXCR4, spesielt metastaserer til livmorhals lymfeknuter via en stromal celle-avledet faktor (SDF) -1 gradient produsert av lymphatic stroma [ ,,,0],1] – [3]. Tvungen uttrykk for SDF-1 i B88 celler (kalt B88-SDF-1 celler) konferert forbedret cellemotilitet og lungemetastaser etter intravenøs inokulasjon [4]. Nylig viste også vi at CXCR4 uttrykk bidrar til metastatisk potensial av spyttkjertelkreft [5]. Videre har vi også demonstrert at blokkering av CXCR4 med 1,1 «- [1,4-fenylenbis (metylen)] bis-1,4,8,11-tetraazacyklotetradekan octahydrochloride (AMD3100), en CXCR4-antagonist, kan være en potent anti -metastatic terapi for CXCR4-relaterte hode og nakke kreft [5], [6].
Selv om SDF-1 /CXCR4 system hovedsak fungerer som en kjemotaktisk faktor i kreftceller til frø metastaser, nyere studier vist at dette systemet regulerer også tumorvekst, kreft-celle-tumor mikro interaksjon og angiogenese [7] – [10]. Faktisk, for å etablere metastaser, flere viktige prosesser, for eksempel invasjonen, intravasation, bloduttredelse og ektopisk vekstpotensial, er uunnværlig. Således er det viktig å undersøke funksjonen av nedstrøms mål (e) som er ansvarlig for prosessen med metastase i SDF-1 /CXCR4 system. microRNAs (mirnas) er små regulerings ikke-kodende RNA som binder seg til spesifikke mål-mRNA, som fører til undertrykkelse translasjonell [11]. mirnas er involvert i regulering av biologiske prosesser, inkludert cellevekst, differensiering og apoptose, både i fysiologiske betingelser og i løpet av sykdommer, så som kreft [11]. Nyere bevis har indikert at mirnas spille viktige roller i metastatisk prosess av flere typer kreft [11]. Imidlertid mirnas som bidrar til metastaser indusert av SDF-1 /CXCR4 system i munnhulen er i stor grad ukjent. Derfor, i denne studien undersøkte vi målet mirnas regulert av SDF-1 /CXCR4 system i B88-SDF-1 celler ved hjelp av miRNA mikromatriser og undersøkt deres funksjonelle rolle på metastase i munnhulekreft.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
musene ble håndtert i tråd med anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av Forskningsutvalget, Tokushima University (Permit Number: 11111) Animal. Kort sagt ble alle musene holdt under patogen-fri tilstand, fikk mat og vann ad libitum, og opprettholdt i en 12 timers lys /mørke-cyklus i et passende temperaturkontrollert rom. All kirurgi og aktiv dødshjelp ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. B88 celler [1], ble [12] opprinnelig etablert fra en pasient med tungen kreft i 1988. Den etiske komiteen av Tokushima universitetssykehus fravikes behovet for samtykke om bruk av denne cellelinjen (Permit Number: 453).
miRNA microarray analyse
Små RNA for miRNA microarray analyse ble ekstrahert fra serum sultet B88-mock celler og B88-SDF-1 celler. En miRNA microarray ble utført og analysert i Toray (Tokyo, Japan) med en human 3D-Gene Array (V16.1.0.0). Microarray rådata ble avsatt i Gene Expression Omnibus (GEO, http: //www.ncbi.nlm.nih.-gov/geo) i henhold til minimum informasjon om microarray eksperiment (MIAME) retningslinjer. Sjonsnummer er GSE59323.
Celler og cellekultur
Oral kreft celler ble ansett som fri for mycoplasma og bakteriell forurensning. CAL27 celler er oral cancer celler som ble erholdt fra American Type Culture Collection (Rockville, MD). B88-celler sterkt metastasere til cervikale lymfeknuter, når cellene inokuleres i tyggemuskelen på nakne mus, men sjelden metastasere til lungene ved intravenøs inokulering [1], [4]. I kontrast, celler som CAL27 sjelden metastasere til cervikale lymfeknuter eller lunger, når cellene blir inokulert i tyggemuskelen eller halevenen til nakne mus, henholdsvis (upublisert observasjon). Cellene ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM; Sigma, St. Louis, MO) supplementert med 10% føtalt kalveserum (FCS), 100 ug /ml streptomycin, og 100 U /mL penicillin i en fuktet atmosfære på 95% luft og 5% CO2 ved 37 ° C.
mus og
in vivo
studie
BALB /c nakne mus ble kjøpt fra CLEA Japan (Osaka, Japan). Musene ble holdt under patogenfrie forhold. Forsøkene ble igangsatt når mus var 8 uker gamle og ble utført som beskrevet tidligere [1], [4]. I korthet ble cellene orthotopically inokulert i tyggemuskelen av nakne mus (2 x 10
6) eller inokulert i blodkarene i nakne mus (1 x 10
6); de musene ble avlivet på dag 35. Tumorvolumet ble beregnet ved å måle tumorstørrelsen og ved hjelp av følgende formel: Tumor volum = 1/2 x L x W
2, hvor L og W representerer den største diameter og den minste diameter, respektivt. Tilstedeværelse eller fravær av lymfeknute og fjernmetastaser ble bekreftet av hematoxylin og eosin-farging.
Transfeksjon
Celler (5 x 10
5-celler /skål) ble sådd ut i 100 mm kultur retter (Falcon, Becton Dickinson Laboratorium, Franklin Lakes, NJ) i DMEM supplert med 10% FCS. Tjuefire timer senere ble cellene transfektert med 5 ug av den HSA-MIR-518c ekspresjonsvektor eller kontrollvektor (ORIGENE, Rockville, MD), under anvendelse Lipofectamine LTX (Life Technologies, Carlsbad, CA) ved sluttkonsentrasjonen av 50 pM. Cellene ble inkubert i 24 timer i DMEM inneholdende 10% FCS (V /V) og ble deretter trypsinert og utsådd (01:05 forhold) på 100 mm kulturskåler i DMEM-medium inneholdende 10% FCS (V /V). Førti-åtte timer senere ble cellene plassert i et selektivt medium som inneholdt Geneticin (700 ug /ml G418, Life Technologies). Etter valget med G418 i 2 uker, ble alle de kolonier ble samlet inn og følgende stabile transfektanter isolert: B88-518c, B88-mock2, CAL27-518c, og CAL27-mock celler
Kvantitativ RT-PCR.
Etter 24 timer, RNA ble isolert fra logaritmisk voksende celler med TRIzol reagens (Life Technologies) i henhold til produsentens instruksjoner. Revers transkripsjon ble utført ved hjelp av TaqMan mikroRNA RT Kit (Life Technologies) eller miScript II RT Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). I kvantitativ PCR, ble Mir-518c-5p og RNU6B mirnas påvises ved å bruke TaqMan Gene Expression analyse (Life Technologies) eller miScript Primer analysen (Qiagen). Gene-spesifikke produkter ble målt kontinuerlig av en ABI StepOnePlus Real-Time PCR System under 40 sykluser av PCR. I noen eksperimenter ble celler transfektert med eller uten 50 nM miRCURY LNA mikroRNA inhibitor (Exiqon, Vedbæk, Danmark) med Lipofectamine RNAiMax (Life Technologies).
MTT analyse
Celler ble sådd på en 96-brønners plate (Falcon, Becton Dickinson Labware) ved 5 x 10
3-celler per brønn i DMEM inneholdende 10% FCS. Tjuefire timer senere, ble cellene transfektert med eller uten 50 nM miRCURY LNA mikroRNA inhibitor hjelp Lipofectamine RNAiMax. Etter 24 eller 48 timer ble antallet celler kvantifiseres ved en analyse ved hjelp av MTT [3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid; Sigma].
In vitro
celle migrasjon analysen
in vitro
migrasjon av cellene ble evaluert ved bruk transwells (Corning, NY) som tidligere beskrevet [1]. Cellene plugget i porene eller cellene er festet til den nedre overflate av membranen ble tellet i de10 felter med høy effekt vis (x 400) av en tredje person blindet til behandlingsbetingelsene. I noen eksperimenter, ble 50 nM miRCURY LNA mikroRNA inhibitor tilført før cellene ble sådd ut på det øvre kammer.
Sår assay
Ved 24 timer etter utsåing av cellene, ble en lineær sår generert de sammenflytende monolagene ved å skrape med en pipette tips. Ufestede celler ble vasket av med omrøring. Celler ble fotografert på det samme punkt på en rist i 48 timer senere. Hver cellelinjen ble belagt og såret i tre eksemplarer
spheroid formasjon analysen
Celler ble sådd på en 96-brønns plate (NanoCulture plate; SCIVAX Life Sciences, Woburn, MA). 1 x 10
3 celler per brønn i DMEM inneholder 10% varme-inaktivert FCS. Tjuefire timer senere, ble fenotypen av cellene observert av fasekontrastmikroskop (× 300).
Statistisk analyse
Signifikante forskjeller mellom anordningene for de forskjellige grupper ble evaluert med Statview 4.5 (Abacus Concepts, Berkeley, CA) ved hjelp av enveis ANOVA med betydning satt til p. 0,05
Resultater
Isolering av MIR-518c-5p, som er indusert av SDF- 1 /CXCR4 system
Vi undersøkte miRNA nedstrøms for SDF-1 /CXCR4 system ved hjelp av den orale cancercellelinje, B88-SDF-1, som har en autokrin SDF-1 /CXCR4 system og oppviser fjern metastatisk potensiale
in vivo product: [4]. Microarray analyse avdekket at flere mirnas ble oppregulert eller nedregulert i B88-SDF-1 celler sammenlignet med mock-celler (data ikke vist). For å bekrefte spesifisiteten av microarray analyse ble miRNA uttrykket bekreftet av kvantitativ RT-PCR. I likhet med microarray resultater, ble Mir-518c-5p (tidligere kalt MIR-518c *) uttrykk oppregulert i B88-SDF-1 celler sammenlignet med mock celler (Fig. 1a). Videre vil dette oppregulering ble fullstendig opphevet ved transfeksjon av en MIR-518c-5p LNA inhibitor (fig. 1A). Vi har også fått lignende resultater i foreldre B88 celler stimulert med SDF-1 (Fig. 1B).
(A) Uttrykket av MIR-518c-5p ble bekreftet i B88-mock og B88-SDF-1 celler ved real-time PCR. Den nedregulering av MIR-518c-5p B88-SDF-1 celler etter behandling med en MIR-518c-5p LNA inhibitor ble også bekreftet. N.D .: ikke oppdages. (B) Uttrykket av MIR-518c-5p ble bekreftet i foreldre B88 celler etter behandling med eller uten SDF-1 ved real-time PCR.
Effekt av MIR-518c-5p hemming av celle vekst og SDF-1 /CXCR4-avhengig cellemigrasjon
Tidligere har vi funnet at verken parakrint heller autokrint SDF-1 /CXCR4 system påvirket forankringsavhengig vekst av B88 celler [1], [4] . Vi undersøkte effekten av MIR-518c-5p på cellevekst ved hjelp av en bestemt MIR-518c-5p LNA hemmer. Inhibitoren påvirket ikke veksten av enten B88-B88 eller mock-SDF-1-celler (Fig. 2A). Vi neste undersøkte effekten av MIR-518c-5p på SDF-1 /CXCR4-avhengig migrering av cellene. Migrasjon kammer analyser avslørte at den forbedrede motilitet av B88-SDF-1-celler ble betydelig svekket etter behandling med en MIR-518c-5p LNA inhibitor (fig. 2B).
(A) vekst av B88-mock celler (venstre side) og B88-SDF-1-celler (høyre side) i nærvær av enten en kontroll LNA-inhibitor eller en MIR-518c-5p LNA-inhibitor ble undersøkt ved hjelp av et MTT-assay. Det var ingen signifikante forskjeller mellom de tre gruppene av enveis ANOVA. (B) Den motilitet av B88-SDF-1-celler i nærvær av enten en kontroll LNA-inhibitor eller en MIR-518c-5p LNA-inhibitor ble undersøkt ved anvendelse av en Transwell migrasjonsanalyse. Totalt 2 × 10
4-celler ble transfektert før de blir seedet i kammeret. **;
p
. 0,01 sammenlignet med ubehandlede kontroll eller kontroll LNA hemmerbehandlede celler ved enveis ANOVA
Effekt av MIR-518c-5p overekspresjon på cellevekst
Deretter utførte vi en gevinst på funksjonsanalyse overekspresjon MIR-518c-5p i foreldre B88 celler og også i foreldre CAL27 celler der uttrykket av CXCR4 og MIR-518c-5p var ikke synlig. Etter transfeksjon av tom vektor eller MIR-518c uttrykk vektor, samlet vi alle G418 resistente kloner å unngå klonal heterogenitet av cellene og etablert følgende transfektanter, B88-mock2, B88-518c, CAL27-mock og CAL27-518c. Vi kunne påvise oppregulering av MIR-518c-5p Mir-518c transfektanter sammenlignet med mock-celler, som ble fullstendig hemmet av behandling med MIR-518c-5p LNA inhibitor (Fig. 3A, B). Forankringsavhengig vekst potensialet for både B88-518c og CAL27-518c celler ble signifikant forbedret sammenlignet med den mock-celler (fig. 3C, D), som ble signifikant inhibert ved behandling med den MIR-518c-5p LNA-inhibitor (fig. 3E, F). Deretter undersøkte vi effekten av MIR-518c overekspresjon på forankringsuavhengig vekst av cellene. B88-celler mock2 dannet rundt og tett celle-celle adhesjon sfæroider (Fig. 3G), mens B88-518c celler dannet Grapevine lignende klumper (fig. 3 H). I motsetning til dette, begge CAL27 transfektanter som dannes runde kuler (fig. 3i, j), men større sfæroider ble observert i CAL27-518c celler (fig. 3J).
B88 celler og CAL27 celler ble stabilt transfektert med et styre vektor eller en MIR-518c uttrykk vektor, og B88-mock2 eller B88-518c celler og CAL27-mock eller CAL27-518c celler ble isolert, henholdsvis. (A, B) Uttrykket av MIR-518c-5p i B88-transfektanter (A) og CAL27-transfektanter (B) ble vurdert ved real-time PCR. Den nedregulering av MIR-518c-5p B88-518c celler eller CAL27-518c celler etter behandling med en MIR-518c-5p LNA inhibitor ble også bekreftet. (C, D) Anchorage-avhengig vekst av B88-transfektanter (C) og CAL27-transfektanter (D) ble evaluert ved anvendelse av et MTT-assay. *;
p
0,05, **;
p
0,01 sammenlignet med mock-celler ved en-veis ANOVA. (E, F) for vekst av B88-transfektanter (E) og CAL27-transfektanter (F) i nærvær av enten en kontroll LNA-inhibitor eller en MIR-518c-5p LNA-inhibitor ble undersøkt ved hjelp av et MTT-assay. *;
p
0,05, **;
p
0,01 sammenlignet med ubehandlede kontroll eller kontroll LNA-inhibitor-behandlede celler ved en-veis ANOVA. (GJ) Anchorage-uavhengig vekst av B88-mock2 (G), B88-518c (H), CAL27-mock (I) eller CAL27-518c (J) ble evaluert med en nano-kultur plate.
Effekt av MIR-518c-5p overekspresjon på cellemigrasjon
B88-518c celler ervervet en betydelig chemokinetic respons (fig. 4A) og forbedret cellemotilitet (fig. 4B). Vi har også oppdaget en forbedret migrasjon i CAL27-518c celler (fig. 4C). Den forbedrede cellemotilitet av B88-518c cellene ble betydelig svekket etter behandling med Mir-518c-5p LNA inhibitor (fig. 4D).
(A) B88-mock2 eller B88-518c celler ble dyrket til samløpet. En sårheling Analysen ble utført. *;
p
0,05 sammenlignet med mock-celler ved en-veis ANOVA. (B, C) Et motilitet av B88-518c-celler (B) eller CAL27-518c-celler (C) ble evaluert ved anvendelse av en Transwell migrasjonsanalyse. Hver transfektant ble sådd ut ved en tetthet på 1 x 10
4. **;
p
0,01 sammenlignet med mock-celler ved en-veis ANOVA. (D) Den motilitet av B88-transfektanter i nærvær av enten en kontroll LNA-inhibitor eller en MIR-518c-5p LNA-inhibitor ble også undersøkt ved anvendelse av en Transwell migrasjonsanalyse. **;
p
0,01 sammenlignet med ubehandlede kontroll eller kontroll LNA hemmerbehandlede celler ved enveis ANOVA
Rollen MIR-518c-5p på vekst og metastasering.
in vivo
Vi har evaluert ved effekten av MIR-518c-5p på vekst og metastasering in vivo. B88 og CAL27 transfektanter ble orthotopically inokulert i tyggemuskelen på nakne mus [1]. Størrelsen av primærtumor fra B88-518c celler (Fig. 5A) og CAL27-518c celler (Fig. 5B) ble signifikant økt sammenlignet med svulster fra mock-celler. Selv om både mock og MIR-518c transfektantene histopathologically spredning til de cervikale lymfeknuter, vekten av lymfeknuter innehold MIR-518c transfektanter som var betydelig tyngre enn den til lymfeknuter inneholdende mock-celler (fig. 5C-E). Vi neste utført intravenøs inokulasjon bruke disse transfektanter. Mange og store metastatiske noduler ble funnet i lungene, i alle de mus inokulert med B88-518c celler (Fig. 6A). Antall knuter fra mus inokulert med B88-518c celler var signifikant økt sammenlignet med tall fra mock-celler (fig. 6B).
(A, B) B88-transfektanter (A) og CAL27-transfektanter ( B) ble orthotopically inokulert i tyggemuskelen på nakne mus, som ble avlivet på dag 35. størrelsen av primære tumorer ble målt en gang i uken. Resultatene som presenteres er gjennomsnitt ± SD. *; p 0,05 sammenlignet med mock-celler ved en-veis ANOVA. (C) Representant H E farging av metastatiske lymfeknuter fra de nakne mus inokulert med B88-mock2 celler (til venstre) og B88-518c celler (høyre). (D, E) Vekten av de submandibulære lymfeknutene ble målt i mus inokulert med B88-transfektanter (D) og CAL27-transfektanter (E). *; p 0,05 sammenlignet med mock-celler ved en-veis ANOVA
Cellene ble inokulert inn i blodkarene i nakne mus, som ble avlivet på dag 35. (A) Representative H . E farging av lungene fra det nakne mus inokulert med B88-mock2 celler (til venstre) og B88-518c celler (høyre). (B) De metastatiske knuter ble talt under et mikroskop. **, P. 0,01 sammenlignet med mock celler ved enveis ANOVA
Diskusjoner
mirnas er små, endogene, evolusjonært konserverte ikke-kodende RNA som regulerer ca 60% av pattedyr gener ved å modulere sine transkripsjonsnivåer. mirnas er involvert i mange molekylære reaksjonsveier og i dreibare biologiske prosesser, inkludert cellevekst, utvikling, differensiering, proliferasjon og celledød [11]. Nyere bevis har vist rolle mirnas ved modulering av den metastatiske prosess i forbindelse med faste tumorer, og disse mirnas er blitt betegnet metastamir [13]. Mange metastamirs er identifisert og har pro- og anti-metastatiske effekter [11]. Imidlertid er det sannsynlig at det finnes mange mirnas som er metastamir med ukjente funksjoner, fordi 3% av det humane genom er beregnet til å kode for miRNA sekvenser [14]. I denne studien, viste vi at Mir-518c-5p kan være en roman metastasefremmende metastamir. MIR-518c-5p ble opprinnelig identifisert i de 250 små RNA-biblioteker fra 26 forskjellige organsystemer og celletyper mennesker og gnagere, beriket i neuronal samt normale og maligne hematopoetiske celler og vev [15]. Selv om funksjonen av MIR-518c-5p ikke er klart definert i kreft, Dyrskjøt og kolleger vist at Mir-518c-5p var signifikant assosiert med sykdomsprogresjon når man korrigerer for sykdom stadium og grad ved hjelp av en multivariat Cox regresjonsanalyse [16]. Videre nyere undersøkelser viste at Mir-518c-5p viste en betydelig oppregulering i retinoblastom i en miRNA microarray analyse [17]. Tatt sammen med vår nåværende resultater, kan MIR-518c-5p fungere som en oncomiR i tumorceller.
I denne studien, viste vi at Mir-518c-5p blir oppregulert ved SDF-1 /CXCR4 system i en parakrint eller Autocine måte. Rhodes og kolleger undersøkte miRNA ekspresjon indusert av SDF-1 /CXCR4 system i østrogen-reseptor-a-positive brystcancerceller [18]. Men verken MIR-518c-5p eller annen miRNA påvist i vår miRNA analyse var til stede i sine resultater. Videre, selv om vi også analysert miRNA microarray analyse i CXCR4-positiv spyttkjertelkreftceller, ACC-M [19], etter stimulering med SDF-1, var det ikke noen felles mirnas mellom de tre miRNA microarray analyser til tross for bruk av SDF-1 /CXCR4 system i disse kreftceller (data ikke vist). Dette funn kan skyldes de forskjellige forsøksbetingelser i cellene; Imidlertid kan det være på grunn av forskjellige setespesifikke metastatisk mønster av disse kreftceller. For eksempel brystkreft favoriserer metastasering til benet, spyttkjertel kreft i lunge, og oral cancer til lymfeknute. Dermed kan mirnas som er nødvendige for homing til den bestemte målorganet bli aktivert av CXCR4 ved binding av dens ligand, SDF-1 i disse kreftceller.
Mekanismen MIR-518c-5p oppreguleringen av SDF -1 /CXCR4 system i orale kreftceller ble ikke avklart i denne studien. MIR-518c-5p tilhører MIR-515 familie i et kromosom 19 miRNA klynge, såkalte C19MC [20]. C19MC er den største klyngen, bevart bare i primater, koding 59 modne mirnas og viser en svært lav uttrykk i de fleste menneskelige vev på grunn av epigenetisk kontroll [20]. På grunn av at SDF-1 /CXCR4 system kan oppregulere DNMT1 /DNMT3ß uttrykk [21] eller ANP32A /LANP, en komponent av inhibitoren av histon-acetyl transferase [22], kan MIR-518c-5p oppregulering være avhengig av resultatet av demetylering av C19MC. Alternativt nyere undersøkelser har vist at noen av de miRNA medlemmer i C19MC ble oppregulert ved leverkreft, karakterisert ved avvikende IGF, fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) -Akt-mTOR eller p53 bane aktivering [23], [24]. SDF-1 /CXCR4-systemet kan også aktivere PI3K-Akt trasé i B88 celler [1], og disse banene kan være involvert i oppregulering av MIR-518c-5p. Vi videre undersøkt MIR-518c-5p uttrykk ved hjelp av en muntlig kreft cellelinje, HNT, der uttrykk for CXCR4 var 7,5 ganger lavere enn i B88 celler [1], [3]. HNT-SDF-1-celler utviste svak, men ikke signifikant, fenotypiske endringer
in vitro
og
in vivo
, karakterisert ved at aktivering av PI3K-Akt av SDF-1 var ikke påvisbar [ ,,,0],4]. Videre er MIR-518c-5p induksjon i hNT-SDF-1-celler kunne påvises bare ved en marginal nivå, sannsynligvis på grunn av redusert ekspresjon av CXCR4, sammenlignet med den til B88-celler (data ikke vist). Dermed blir CXCR4 ekspresjonsnivået og sterk nedstrøms signalering, for eksempel PI3K-Akt, kan også være avgjørende for aktivering av MIR-518c-5p uttrykk derfor ytterligere studier ville være nødvendig for å klargjøre denne mekanisme.
i denne studien fant MIR-518c-5p indusert av SDF-1 /CXCR4 systemet ikke stimulere cellevekst, men klarte forbedre celle migrasjon ved hjelp av en LNA inhibitor. I kontrast, kan vi oppdage både vekst stimulering og økt fraflytting etter transfeksjon av en MIR-518c uttrykk vektor,
in vitro Hotell og
in vivo
. Selv om årsaken er uklar, kan det funn skyldes virkningen av MIR-518c-3p produsert av MIR-518c ekspresjonsvektor. Men vi kunne ikke finne tidligere rapporter om MIR-518c-3p i kreftceller og cellevekst, og en LNA inhibitor mot Mir-518c-5p kunne undertrykke økt vekst både i B88-518c og CAL27-518c celler (Fig. 3E , F). Derfor tror vi at effekten av MIR-518c-3p på veksten av cellene kan være delvis neglisjert. Den andre muligheten kan skyldes den nedregulering av de nonphysiological eller falske mål-mRNA som deler et lignende frø sekvens ved overekspresjon av MIR-518c-5p. Men overekspresjon av MIR-518c-5p av oligonukleotid Contrarily hemmet veksten og migrasjon av B88 celler og CAL27 celler, mest sannsynlig på grunn av nedregulering av falske target mRNA (data ikke vist). Dette resultatet indikerer at uttrykk for MIR-518c ved hjelp av vektor metoden induserte en fysiologisk og ikke-giftig tilstand i disse muntlige kreftceller. Derfor tror vi at moderat induksjon av MIR-518c-5p kan være tilstrekkelig for cellemigrasjon, men sterk induksjon av MIR-518c-5p kan være nødvendig for induksjon av cellevekst. Fordi
i silico
mRNA mål av MIR-518c-5p inkludere flere typer gener som regulerer vekst og metastasering (S1 Table), teser målgener kan kontrollere annen effekt av MIR-518c-5p.
C19MC, inkludert MIR-518c-5p, kart til kromosom bandet 19q13.4 [20]. Kasamatsu og kolleger viste at 19q13.4 locus forsterkes i spyttkjertel adenoid cystisk karsinom, en svært metastatisk type hode og nakke kreft [25]. Videre er forsterkningen av denne locus ofte detektert i ependymoblastoma og embryonale tumorer med rikelig neuropil og sanne rosetter, meget aggressive embryonale neoplasmer, i en mengde på 93% [26]. SDF-1 /CXCR4 systemet spiller viktige roller i å opprettholde arkitekturen i nisjer for blodkreft og andre vev stamceller som kjønnsceller og follicular, intestinal og nevrale stamceller [27], [28]. Spesielt, de fleste kreftstamceller (cscs) uttrykker CXCR4 og svare på en kjemotaktisk gradient av SDF-1, noe som tyder på at cscs mest sannsynlig representerer en undergruppe stand til å initiere metastaser [29]. I tillegg har flere grupper nylig bundet ekspresjon av medlemmer av C19MC med miRNA signatur karakteristisk for humane embryonale stamceller [20]. Til sammen C19MC, inkludert MIR-518c-5p, kan uttrykkes i cscs som er involvert i vekst og metastasering.
Konklusjoner og anbefalinger
Resultatene indikerte at Mir-518c-5p regulerer vekst og metastasering av kreft i munnhulen som en nedstrøms målet for SDF-1 /CXCR4 system. I fremtiden vil det være viktig å undersøke sammenhengen mellom CXCR4 og MIR-518c-5p uttrykk i den kliniske materialet. Hvis den molekylære mekanismen av MIR-518c-5p mot kreft metastase kan bli ytterligere avklart, kan den undertrykkelse av cellevekst og migrering av en MIR-518c-5p inhibitor tjene som grunnlag for utvikling av behandlingsformer mot metastaser.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table.
miRNA målrettet av MIR-518c-5p er analysert ved bruk av microRNA.org program (https://www.microrna.org/microrna/getMirnaForm.do), og cut-off-verdien er tilpasset mindre enn -1,5 av miRSVR poengsum
doi:. 10,1371 /journal.pone.0115936.s001 plakater (DOC)
takk
Vi takker Dr. Koh-ichi Nakashiro (Institutt for oral og maxillofacial Surgery, Ehime Universitetet Graduate School of Medicine) for å gi teknisk assistanse.
