Abstract
eikosapentaensyre (EPA) og dokosaheksaensyre (DHA) er de viktigste n-3 flerumettede fettsyrer (PUFA) i fiskeolje som reduserer risikoen for prostatakreft. Tumor-assosiert makrofager (TAM) er de viktigste leukocytter av intratumoral infiltrasjon, og økt TAMs korrelerer med dårlig prostatakreft prognose. Imidlertid er mekanismen av n-3 flerumettede fettsyrer i prostata kreftcelle progresjon indusert av TAMs ikke godt forstått. I denne studien undersøkte vi effekten av EPA og DHA på moduler av migrasjon og invasjon av prostata kreft celler indusert av TAM-lignende M2-type makrofager. PC-3 prostata kreftceller ble forbehandlet med EPA, DHA, eller den peroksisomproliferator-aktivert reseptor (PPAR) -γ antagonist, GW9662, før eksponering av kondisjonert medium (CM). CM ble avledet fra M2-polariserte THP-1-makrofager. Trekk og invasive evner av PC-3 celler ble evaluert ved hjelp av en coculture system av M2-type makrofager og PC-3 celler. EPA /DHA administrasjon redusert migrasjon og invasjon av PC-3 celler. Den PPAR-γ DNA-bindende aktivitet og cytosolic hemmende faktor κBα (IκBα) protein uttrykk økte, mens den kjernefysiske faktor (NF) -κB p65 transkripsjonen aktivitet og kjernefysiske NF-kB p65 protein nivå redusert i PC-3 celler inkubert med CM i tilstedeværelsen av EPA /DHA. Videre, EPA /DHA downregulated mRNA uttrykk for matriks-metalloproteinase-9, cyklooksygenase-2, vaskulær endotelial vekstfaktor, og makrofag-kolonistimulerende faktor. Forbehandling med GW9662 avskaffet de gunstige effektene av EPA /DHA på PC-3 celler. Disse resultatene indikerer at EPA /DHA administrasjon redusert migrasjon, invasjon og makrofag kjemotakse av PC-3 celler indusert av TAM-lignende M2-type makrofager, noe som kan delvis forklares ved aktivering av PPAR-γ og redusert NF-kB p65 transkripsjonen aktivitet.
Citation: Li CC, Hou YC, Yeh CL, Yeh SL (2014) Effekter av eikosapentaensyre og dokosaheksaensyre om Prostate Cancer Cell migrasjon og invasjon indusert av tumorassosiert Makrofager. PLoS ONE 9 (6): e99630. doi: 10,1371 /journal.pone.0099630
Redaktør: Rolf Müller, Philipps-universitetet, Tyskland
mottatt: 27 desember 2013; Godkjent: 17 mai 2014; Publisert: 12 juni 2014
Copyright: © 2014 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Science Council tilskuddet NSC 100-2320-B-038-009 Taipei, Taiwan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den vanligste kreftformen diagnostisert blant menn i utviklede land og er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [1]. Til tross for forbedringer i forskjellige terapeutiske tilnærmingsmåter i de senere år, terapi for pasienter med langt fremskreden prostatakreft fortsatt mangler effekt. Det faste tumor består av neoplastiske celler og stromale komponenter, inkludert fibroblaster, endotelceller, og trekk hematopoetiske celler. Makrofager er de mest tallrike immunceller i svulsten mikromiljøet, såkalte tumorassosierte makrofager (TAM) [2], [3]. TAMs er hovedsakelig M2-type makrofager fordi de uttrykker en rekke overflatemarkører som CD36 og CD163 [4]. Også TAMs ble vist å spille viktige roller i overlevelse, proliferasjon og metastase av kreftceller, og høyere TAMs infiltrering er ofte korrelert med en dårlig prognose i mange tumorer, slik som prostatakreft. En klinisk studie utført av Lissbrant et al. [5] funnet positive korrelasjoner av tettheten av TAMs med prostatatumorcelle-proliferasjon og microvessel tetthet. Videre kan TAMs lette kreftcellemigrering og invasjon av utskillende faktorer, slik som vekstfaktorer, cytokiner, kjemotaktiske faktorer, og matriks-metalloproteinaser (MMP) [6] -. [9]
peroksisomproliferator-aktiverte reseptorer ( PPAR) er kjernereseptorer og ligand-aktiverte transkripsjonsfaktorer i steroid super. PPAR-familien består av tre forskjellige undertyper: PPAR-alfa, PPAR-p /δ, og PPAR-y. De heterodimerize med retinoid X-reseptor (RXR) og regulere mål genekspresjon ved å binde seg til peroksisom proliferator responselementer (PPREs) ligger i promoterregionen [10]. PPAR-γ hovedsakelig uttrykt i adiposevev, og spiller en viktig rolle i regulering av glukose og lipidmetabolisme og adipocyttdifferensiering [11]. Det ble rapportert at PPAR-γ aktivering kan modulere inflammatoriske responser og inhibere utviklingen og progresjonen av et bredt spekter av epitel-avledede humane kreftceller, inkludert prostata, bryst, tykktarm kreft og [12] – [14]. I tillegg er induksjon av PPAR-γ ekspresjon ble korrelert med inhibering av nukleær faktor (NF) -κB aktivitet og redusert uttrykk for angiogene proteiner i ikke-småcellet lungecancerceller. Disse funn tyder på at inaktivering av NF-kB kan være involvert i en PPAR-γ-avhengige reaksjonsveien [15].
Eikosapentaensyre (EPA) og dokosaheksaensyre (DHA), er de to mest vanlige langkjedede n- 3 flerumettede fettsyrer (PUFA) i fiskeolje. Epidemiologiske data viser at forbruket av fisk er omvendt assosiert med forekomst av og dødelighet av prostatakreft, spesielt metastatisk kreft [16] – [18]. Serum EPA og DHA-nivåer i pasienter med prostatakreft var lavere enn de av pasienter med godartet prostata hyperplasi [19]. Økende bevis har vist at n-3 PUFA utøve antitumor egenskaper. Imidlertid har vært lite fokus på forholdet mellom n-3 PUFA og prostata kreft celle progresjon indusert av TAM. En tidligere studie viste at EPA hemmer human HT-29 colon cancer cellevekst, og denne effekten var et resultat av PPAR-aktivering γ [12]. Videre ble n-3 PUFA vist å indusere apoptose ved aktivering av PPAR-γ i prostatakreftceller [20]. Siden n-3 flerumettede fettsyrer er blitt vist å binde seg effektivt til den ligand-bindende domene av PPAR-γ og aktiverer PPAR-responselement-reporter-analyser på forskjellige cellelinjer [12], [21], hypotese vi at EPA og DHA administrasjon undertrykke progressive egenskaper av prostatakreft via aktivering av PPAR-γ involvert veien. Således har vi brukt PC-3-celler behandlet med kondisjonert medium (CM) fra M2-type makrofager eller i en ikke-kontakt-system for å bestemme effektene og mulige mekanismer for EPA og DHA på prostatacancer cellemigrering og invasjon indusert av TAM.
Materialer og metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og kultur vilkår
Prostata PC-3 kreftceller og menneske THP-1 monocyttiske celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Celler ble opprettholdt i RPMI 1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin (10 ng /mL penicillin og 10 U /mL streptomycin), og 2,5 mM glutamin hos 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 inkubator.
Fremstilling av fettsyre-bovint serumalbumin (BSA) komplekser
EPA, DHA, og BSA ble kjøpt fra Sigma ( St. Louis, MO, USA). Fettsyre-BSA kompleksene ble fremstilt som 10 mmol /l bestander med et forhold mellom fettsyrer til BSA fra 04:01, og ble oppløst ved en sonikator i et kjølig vannbad i 60 min. Fettsyre-BSA aksjer ble lagret ved -20 ° C under argon til den er klar til bruk [22].
Celleviabilitet analysen
levedyktighet av PC-3 celler ble bestemt av en Alamar blå analyse (Invitrogen). PC-3-celler ble sådd på 96-brønners plater (1000 celler /brønn) natten over, og deretter behandlet med forskjellige doser av EPA eller DHA (0~400 uM). BSA kjøretøy ble anvendt som en kontroll (C). Etter 20 timers behandling, ble cellene inkubert i medium inneholdende 10% Alamar blue fargestoff ved 37 ° C i 4 timer, og den kolorimetriske forandring ble målt med en mikroplateleser ved 570 og 600 nm.
CM preparater og behandlinger
Macrophage differensiering ble utført i henhold til tidligere etablerte protokoller [23]. THP-1-celler (5 x 10
6) ble sådd ut i 75-cm
2 vevsdyrkingskolber og dyrket med 320 nM forbol 12-myristat 13-acetat (PMA; Sigma) i 4 timer. For M2-type makrofag differensiering, ble THP-1-celler behandlet med 320 nM PMA, 20 ng /ml interleukin (IL) -4, og 20 ng /ml IL-13 (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA) for en annen 20 h. For å generere M1-type makrofager, ble THP-1-celler behandlet med 320 nM PMA i 4 timer, og deretter behandlet med 320 nM PMA, 20 ng /ml interferon (IFN) -γ (Peprotech), og 100 ng /ml lipopolysakkarid ( LPS) fra
Escherichia coli
serotype 0111: B4 (Sigma) i 20 timer. Etter stimulering ble cellene vasket med fosfatbufret saltløsning (PBS) to ganger og dyrket med friskt medium i 24 timer, og deretter CM ble oppsamlet.
PC-3 prostata kreft-celler ble sådd ut ved 5 x 10
5 i 6-brønners plater en dag før behandling. For å behandle celler, ble cellene anbragt i medium inneholdende forskjellige konsentrasjoner av EPA, DHA (0, 25, og 50 uM) eller 10 mM GW9662 i 24 timer, og deretter ble cellene behandlet med CM som inneholdt den samme konsentrasjon av fettsyrer i ytterligere 24 h. PC-3 celler ble høstet for videre analyse.
Migrasjon og invasjon analyser
De trekkende og invasive evner av PC-3 celler (2 × 10
4 for migrasjon analysen og 10
5 celler for invasjonen assay) henholdsvis ble bestemt med 24-brønners plater med Millicell kultur plate Setter (8-mikrometer porestørrelse, Millipore, Bille, MA, USA) for 12 timer og Matrigel-belagt (BD Biosciences, Bedford , MA, USA) setter i 24 timer. Kort sagt ble PC-3-celler tilsatt til de øvre kamrene i RPMI 1640 supplert med 10% FBS, og THP-1-celler (10
5) ble differensiert i M2-type makrofager i den nedre kammer. Etter PC-3-celler var festet, ble medium fra det øvre og nedre kammer erstattet med serumfritt RPMI 1640 inneholdende forskjellige konsentrasjoner av EPA, DHA, eller GW9662 (10 uM). Deretter ble cellene på den øvre innsatsen overflaten av membranen fjernes med bomullspinner etter inkubasjon. Etter fiksering med 4% paraformaldehyde, trekkende og invasive celler ble farget med 0,5% krystallfiolett i 2% metanol. Membraner ble vasket tre ganger med PBS, og fargestoffet ble eluert med 30% eddiksyre. Absorbansen ble avlest ved 595 nm med en mikroplateleser. Minst tre uavhengige eksperimenter ble utført for hver analyse.
DNA-bindende aktivitet av PPAR-γ og NF-kB p65
Nuclear ekstrakter fra celler ble høstet ved bruk av NE-PER Cytoplasmatisk og Nuclear protein utvinning kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Den DNA-bindende aktivitet av PPAR-γ ble analysert ved bruk av en enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) -baserte Trans-AM transkripsjonsfaktor-analyse PPAR-γ Kit (Active Motiv, Carlsbad, CA, USA). Et oligonukleotid som inneholdt en peroksisomproliferator- responselement (PPRE) (5′-AACTAGGTCAAAGGTCA-3 «) ble belagt på brønnene på mikrotiterplater strimler gitt. PPAR finnes i atom ekstrakt spesielt binder seg til PPRE. Den primære PPAR-γ antistoffet gjenkjenner en epitop på vurderbar PPAR-γ proteinet ved DNA-bindende og deretter et sekundært antistoff konjugert til pepperrotperoksidase (HRP) ble tilsatt. Absorbansen ble avlest ved bruk av et spektrofotometer ved 450 nm.
å kvantifisere DNA-bindende aktivitet av NF-kB p65, 5 ug av atom ekstrakt ble målt ved anvendelse av en ELISA-basert Trans-AM transkripsjonsfaktor NF-analyse -κB p65 Kit (Active Motif). Brønnene i ELISA-kit ble immobilisert med et oligonukleotid som inneholdt NF-kB p65 konsensus område (5′-GGGACTTTCC-3 «). I henhold til produsentens instruksjoner, 10 ug av atom ekstraktet ble tilsatt til hver brønn, og deretter inkubert med et spesifikt primært antistoff anvendes for å påvise NF-kB som gjenkjenner en epitop på p65 som bare er tilgjengelig når NF-kB er aktivert og bundet til målet sitt DNA. Etter inkubering med et HRP-konjugert, sekundært antistoff, ble det kolorimetrisk reaksjon kvantifiseres ved hjelp av spektrofotometri ved 450 nm.
proteinekstraksjon og Western blot-analyse
Cellene ble vasket med iskald PBS og skrapet i lyseringsbuffer (50 mM Tris ved pH 7,4, 1% natriumdodecylsulfat (SDS), 1% Nonidet P-40, 0,5% Na-deoksykolat, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, og 50 mM NaF) inneholdende en protease inhibitor cocktail ( komplett, Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) for å forberede hel-cellelysater. Å samle de nukleære og cytoplasmiske ekstrakter ble cellene høstet ved hjelp av NE-PER Cytoplasmatiske og Nuclear Protein utvinning kit (Pierce Biotechnology) i henhold til produsentens instruksjoner. Proteinkonsentrasjoner av supernatanten ble bestemt med en Bradford proteinanalyse Reagent kit (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Proteiner ble underkastet elektroforese på 4% ~12% SDS-polyakrylamidgel-elektroforese (PAGE), og overført til polyvinylidendifluorid-membraner i en våt-overføringsapparat. Membranene ble blokkert med 5% fettfri melk i TBS-Tween (TBS-T) i 1 time og deretter inkubert med et spesifikt primært antistoff over natten ved 4 ° C. Membraner ble vasket tre ganger med TBS-T og inkubert med HRP-konjugert sekundære antistoffer i 1 time, og blotter ble utviklet med forbedrede Chemiluminescence reagenser (PerkinElmer Life Sciences, Waltham, MA, USA) og utsatt for røntgenfilm. Relative intensiteter ble målt for å kvantifisere protein nivåer ved hjelp av Image-Pro Plus-programvare (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA). Alle blotter ble kvantifisert og normalisert mot en intern kontroll for å justere for mengden av proteiner lastet.
RNA ekstraksjon og real-time polymerase chain reaction (PCR) analyse
Total RNA fra celler ble ekstrahert bruker Trizol reagens (Invitrogen). Konsentrasjoner av RNA ble bestemt og kvantifisert ved å måle absorbansen ved 260 og 280 nm på et spektrofotometer. Komplementær (c) DNA ble syntetisert fra total RNA ved anvendelse av en cDNA-syntesesett (Fermentas, Glen Burnie, MD, USA). En real-time PCR-analyse ble utført ved hjelp av ABI 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) med Maxima SYBR Grønn qPCR Master Mix (Thermo Scientific, Foster City, CA, USA) for å bestemme hver mRNA uttrykk. Primere for CD36, CD163, PPAR-γ, MMP-9, tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP) -1, VEGF, cyklooksygenase (COX) -2, makrofag-kolonistimulerende faktor (M-CSF), og β-aktin er oppført i Tabell 1. Reaksjonene ble utført i et totalt volum på 25 ul inneholdende 1 x Maxima SYBR grønn qPCR Master Mix, 400 nM av hver primer, og 100 ng av cDNA. Syklusbetingelsene var som følger: 50 ° C i 2 minutter og 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. mRNA uttrykk ble kvantifisert i duplikat. Data ble beregnet ved hjelp av ligningen 2
-ΔΔCT og presentert som multipler av forandring i genekspresjon normalisert til p-aktin.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Nivåer av tumor nekrose faktor (TNF) -α, IL-1β, og IL-6, transformerende vekstfaktor (TGF) -β, monocytt kjemotiltrekkende protein (MCP) -1, og IL-8 ble målt ved anvendelse av ELISA-sett (eBioscience San Diego, CA, USA). Overflatene av mikroplater ble belagt med en MCP-1 eller IL-8-humane monoklonale antistoff. Prostaglandin (PG) E2-konsentrasjoner ble bestemt ved en konkurrerende sandwich-ELISA-sett (R 0,05 ble ansett som signifikant forskjellig
Resultater
Uttrykk av overflatemarkører og cytokiner nivåer i CM fra PMA-behandlede THP-1 makrofager
For å finne ut om TAMs-lignende M2-type makrofager ble vellykket produsert, THP-1 celler ble behandlet med PMA og Th2-cytokiner (IL-4 og IL-13). Resultatet viste at, sammenlignet med PMA-behandlede og bare M1-polariserte THP-1-makrofager, M2-type makrofager produserte signifikant høyere mRNA uttrykk for M2-macrophage markørene CD36 og CD163 (figur 1). Siden M2-type makrofager produserer relativt lavere nivåer av TNF-α, IL-1β, og IL-6 og høyere nivåer av TGF-β sammenlignet med M1-type makrofager. Nivåene av disse cytokinene i CM kan brukes til å evaluere polarisasjonen av THP-1-makrofag. Vi har funnet at CM fra PMA og M2 gruppene hadde signifikant lavere TNF-α, IL-1β, og IL-6-nivåer enn M1-gruppen. I tillegg CM fra M2-gruppene hadde betydelig høyere TGF-p-nivå enn det i PMA og M1-grupper (figur 2).
mRNA-ekspresjon ble analysert ved en sanntids-PCR. Multipler av mRNA endringer ble kvantifisert ved den komparative CT-metoden. Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SD,
n
= 6. Midler med forskjellige bokstaver signifikant forskjellig (
p
0,05).
CM fra PMA-behandlede THP-1-makrofager og M2-polariserte THP-1-makrofager begge hadde signifikant lavere nivåer av tumornekrosefaktor (TNF) -α (A), interleukin (IL) -1β (B), og IL-6 (C) , og et høyere nivå av transformerende vekstfaktor (TGF) -β (D) sammenlignet med de av M1-polariserte THP-1-makrofager. TNF-α, IL-1β, IL-6, og TGF-β ble målt ved ELISA. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD,
n
= 6. Midler med forskjellige bokstaver signifikant forskjellig (
p
0,05)
PC-3. prostatakreft celleviabilitet
virkningene av EPA og DHA på PC-3-celle-levedyktigheten ble bestemt ved hjelp av en Alamar blue-analyse, og resultatene er vist i figur 3. Levedyktigheten av PC-3-celler ble signifikant redusert på en 24-timers eksponering for EPA og DHA i en konsentrasjonsavhengig måte over 150 og 100 uM, respektivt.
PC-3-celler ble inkubert med EPA (A) og DHA (B) i 24 timer fulgt av en Alamar blue analysen ble utført i fire paralleller. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD,
n
= 6. * Betydelig forskjellig fra kontrollen (
p
0,05)
trekkende og invasiv. ferdigheter i PC-3 prostatakreftceller cocultured med M2-type makrofager
For å finne ut om EPA og DHA er involvert i M2-type makrofager-indusert prostatakreftceller migrasjon og invasjon, PC-3 celler ble cocultured med M2 -type makrofager i en kontaktløs apparat. Trekkende og invasive evner ble oppregulert i PC-3 celler cocultured med M2-type makrofager. EPA og DHA både betydelig redusert trekk og invasive evnene til PC-3 celler cocultured med M2-type makrofager i doseavhengig moter. Omtrent 80% av reduksjonen i trekk og invasive celler ble reversert i nærvær av GW9662, støtte PPAR-γ aktivering bli involvert i å hemme trekk og invasive evnene til PC-3 celler cocultured med M2-type makrofager (figur 4, 5 ).
PC-3-celler ble sådd ut i de øvre kamrene og cocultured med M2-polariserte THP-1-makrofager i nærvær av 50 uM EPA, DHA, eller GW9662 (10 uM) i 24 timer. Invaderte celler ble fiksert i 4% paraformaldehyde og farget med 0,5% krystallfiolett. Membranene ble vasket og fargestoffet ble eluert med en fiolett ekstraksjon oppløsning (50% etanol, 0,1% eddiksyre, og 49,9% DDH
2o). Absorbansen ble målt ved 595 nm ved å bruke en mikrotiterplate-leser. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD,
n
= 3. Midler med forskjellige bokstaver signifikant forskjellig (
p
0,05).
For invasjonen analyse, PC-3-celler ble sådd ut i de øvre kamrene belagt med Matrigel og cocultured med M2-polariserte THP-1-makrofager i nærvær av 50 uM EPA, DHA, eller GW9662 (10 uM) i 24 timer. Invaderte celler ble fiksert i 4% paraformaldehyde og farget med 0,5% krystallfiolett. Membranene ble vasket, og fargestoffet ble eluert med en fiolett ekstraksjon oppløsning (50% etanol, 0,1% eddiksyre, og 49,9% DDH
2o). Absorbansen ble målt ved 595 nm ved å bruke en mikrotiterplate-leser. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD,
n
= 3. Midler med forskjellige bokstaver signifikant forskjellig (
p
0,05).
EPA og DHA oppregulert DNA-bindende aktivitet, og protein og mRNA uttrykk for PPAR-γ i PC-3 celler inkubert med CM fra M2-type makrofager
EPA og DHA begge er ligander av PPAR-γ. For å avgjøre om EPA og DHA redusert trekkende og invasive evnene til PC-3 celler gjennom aktivering av PPAR-γ, analyserte vi PPAR-γ DNA-bindende aktivitet, mRNA og protein uttrykk i PC-3 celler dyrket med CM fra M2-type makrofager . PPAR-γ DNA-bindende aktivitet ble undertrykket i PC-3-celler inkubert med CM fra M2-type makrofager. Behandling med EPA og DHA både økt vesentlig den DNA-bindende aktivitet, og mRNA og protein uttrykk for PPAR-γ i PC-3-celler i forhold til PC-3-celler sammen med CM fra M2-type makrofager. GW9662 delvis blokkert PPAR-γ aktivering i PC-3-celler (figur 6).
PPAR-γ-bindende aktivitet ble analysert ved hjelp av en transkripsjonsfaktor ELISA (A). PPAR-γ proteinnivåer ble bestemt ved hjelp av Western blotting (B). Lik protein lasting ble bekreftet ved hjelp av β-aktin. mRNA ekspresjon av PPAR-γ ble analysert ved en sanntids-PCR (C). mRNA endringer ble kvantifisert ved den komparative CT-metoden. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD,
n
= 3, og midler med forskjellige bokstaver signifikant forskjellig (
p
0,05).
EPA og DHA redusert NF-kB-aktivering i PC-3-celler inkubert med CM fra M2-type makrofager
PPAR-γ aktivering kan redusere DNA-bindende aktivitet av NF-kB p65. Som vist i figur 7A, er NF-kB p65 DNA-bindende aktivitet oppregulert i fravær av EPA /DHA, og falt deretter med administrering av EPA /DHA. Behandling med EPA og DHA både signifikant redusert kjernekraft NF-kB p65 protein uttrykk og økt cytosolic IκBα protein uttrykk i doseavhengig oppførsel. Administrasjon av GW9662 vesentlig tilbake på EPA- og DHA-mediert inaktivering av NF-kB i PC-3 celler dyrket med CM fra M2-type makrofager (figur 7B, C).
NF-kB DNA-bindende aktiviteten ble analysert ved hjelp av en transkripsjonsfaktor ELISA (A). Protein nivåer av IκBα subenhet (B) og NF-kB p65 (C) ble bestemt ved Western blotting. Lik belastning av proteiner er illustrert ved tubulin bånd i den cytosoliske fraksjonen. Histone H1 uttrykket er vist som en intern kontroll i kjerneekstrakter. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD,
n
= 3, og midler med forskjellige bokstaver signifikant forskjellig (
p
0,05).
Angiogenic- relatert faktor uttrykk i PC-3 celler dyrket med CM fra M2-type makrofager
TAMs kan forsterke den angiogene potensialet til kreftceller. Vi analyserte angiogene relaterte faktorer i PC-3 celler inkubert med CM fra M2-type makrofager. TAMs induksjon av mRNA uttrykk for MMP-9, VEGF, COX-2, og høyere nivåer av PGE2 og IL-8 ble funnet i PC-3 celler dyrket med CM fra M2-type makrofager (figur 8). Disse angiogene relaterte faktorer ble nedregulert i nærvær av EPA /DHA. Behandling med EPA /DHA effektivt oppregulert mRNA ekspresjon av TIMP-1. Regulering av angiogene relaterte faktorer uttrykk av EPA /DHA i PC-3 celler dyrket med CM fra M2-type makrofager ble avskaffet ved cotreatment med GW9662.
mRNA uttrykk ble analysert av en real-time PCR. mRNA endringer ble kvantifisert ved den komparative CT-metoden. Nivåer av PGE2 og IL-8 ble analysert ved hjelp av ELISA. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD,
n
= 6, og en anordning med forskjellige bokstaver signifikant forskjellig (
p
0,05).
Genekspresjon M-CSF og MCP-1 nivå i PC-3 celler dyrket med CM fra M2-type makrofager
vekst~~POS=TRUNC faktorer~~POS=HEADCOMP og chemokiner er viktig for å regulere makrofag rekruttering til tumor nettsteder. Våre resultater viste at gen-ekspresjon av M-CSF og konsentrasjoner av MCP-1 i PC-3 celler dyrket med CM fra M2-type makrofager ble oppregulert (figur 9). Gen ekspresjon av M-CSF og produksjon av MCP-1 ble redusert med EPA /DHA administrasjon. Imidlertid behandling med GW9662 var i stand til å reversere EPA /DHA-mediert nedregulering av M-CSF og MCP-1.
MCP-1-nivå ble analysert ved en ELISA. M-CSF ble analysert ved en sanntids-PCR. mRNA endringer ble kvantifisert ved den komparative CT-metoden. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD,
n
= 6, og betyr med forskjellige bokstaver signifikant forskjellig (
p
0,05)
Diskusjoner
Tidligere studier har rapportert at n-3 PUFA hemmer prostatakreft cellevekst ved å indusere apoptose. I denne studien undersøkte vi de potensielle mekanismer for n-3 PUFA i moduler av PC-3 celler dyrket med CM fra M2-type makrofager. Vår studie er den første til å rapportere at i forhold til PC-3 celler dyrket med CM fra M2-type makrofager, administrasjon av EPA /DHA redusert trekkende og invasive evner gjennom å forbedre PPAR-γ DNA-bindende aktivitet, downregulating aktivering av NF-kB, og undertrykke uttrykket av NF-kB målrettede gener.
Makrofager har flere undergrupper og kan polarisert ved forskjellige stimuli. M1-type makrofager har anti-tumor egenskaper, og er kjennetegnet ved produksjon høyt nivå av TNF-α, IL-1β, og IL-6. M2-type makrofager viser tumor-vekstfremmende egenskaper, og uttrykke høyere immunosuppressive cytokiner, slik som TGF-β. Disse cytokiner markørene ble brukt for å definere M1 og M2-type makrofager polarisering. Vi observerte at PMA-, IL-4- og IL-13-behandlede THP-1-celler viste M2-type makrofag overflatemarkører CD36 og CD163 og M2-type makrofager cytokin-profiler (lavere konsentrasjoner av TNF-α, IL-1β og IL-6, og en høyere konsentrasjon av TGF-β). Innenfor svulsten mikromiljøet, TAMs primært oppviser en M2-type makrofager funksjonell profil, og denne foretrukne polarisering er på grunn av stimulering av TH2-cytokiner [24], [25]. TH2-avledede cytokiner, IL-4 og IL-13, induserer M2 polarisering av TAMs som fører til tumorvekst og utvikling [26], [27]. Makrofag rekruttering og differensiering av M2-type makrofager er regulert av vekstfaktorer, slik som M-CSF og kjemokiner, inkludert MCP-1 [28]. Overekspresjon av M-CSF og MCP-1 i flere typer kreft, inkludert prostata cancer, øker makrofag rekruttering og tumorprogresjon, og akselererer hastigheten av metastase [29] – [32]. M-CSF binding til kolonistimulerende faktor-1 reseptoren kan stimulere makrofag differensiering og forutsi Caner metastasering. En langsommere for tumorprogresjon og hemming av metastaser ble funnet i brystkreft etter genetisk ablasjon av M-CSF [33]. Dessuten ble reduksjoner i vekst og makrofag-rekruttering funnet i PC-3-celler etter MCP-1-antistoff nøytralisering [30]. Resultatene av denne studien viste at EPA /DHA kan redusere muligheten av makrofager, rekruttering i PC-3 celler dyrket med CM fra M2-type makrofager ved downregulating M-CSF og MCP-1.
En tidligere studie viste at M2-polariserte THP-1 makrofager kan indusere invasjon og angiogenese av menneskelige basal carcinoma celler [23]. Vi fant også at TAM-lignende M2-type makrofager forhøyet migrasjon og invasjon av PC-3 prostatakreftceller. Videre administrasjon av EPA /DHA trykt trekk og invasive egenskapene til PC-3 celler indusert av TAM-lignende M2-type makrofager, mens ~80% av denne effekten ble blokkert av samtidig behandling med GW9662, en PPAR-γ-spesifikke motstander. Tyder på at den endogene PPAR-γ ligand, 15-deoksy-Δ
12,14-prostaglandin J
2 (15d-PGJ
2) trykt spredning av og androgen signalering av prostata kreft celler [34] , [35]. Også behandling med 15d-PGJ
2 og den syntetiske liganden, pioglitazon, ble rapportert å inhibere proliferasjon og invasjon evne av humane tarmkreftceller [36]. PPAR-γ er uttrykt i den humane prostata epitel. Selv om prostata karsinomer ble funnet å overuttrykke PPAR-γ [13], aktivering av PPAR-γ ble vist å hemme veksten av prostata kreftceller og progresjon av kreft [37].
transkripsjonen aktivitet av NF-kB er hovedsakelig modulert ved fosforylering og nukleær translokasjon av NF-kB p65 [38] – [40]. Unormal NF-kB-aktivering ble identifisert i kreftceller, som fremmet invasjon og migrering ved å øke uttrykk for MMP’er og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) i prostatacancer PC-3-celler [41]. Tidligere studier indikerte at PPAR-γ konkurrerer med NF-kB å binde co-aktivatorer av steroid reseptor co-aktivator (SRC) -1 eller cAMP-respons element-binding (CREB) protein som hemmer NF-kB-mediert genuttrykk [ ,,,0],42]. Dessuten kan PPAR-γ aktivering induserer syntesen av IκBα, som direkte binder til p65 inneholdende NF-kB dimerer i cytoplasma og hemmer den nukleære translokasjon av NF-kB [43], [44]. I denne studien fant vi at EPA og DHA økt cytosolic IκBα uttrykk i PC-3 celler dyrket i CM. Disse dataene tyder på at EPA og DHA modulere trekk og invasive egenskaper av PC-3-celler indusert av M2-type makrofager delvis ved å øke PPAR-γ DNA-bindende aktivitet og redusere NF-kB p65 transkripsjonen aktivitet. Nylig, ble n-3 PUFA rapportert å aktivere G-protein-koblet reseptor (GPR) 120 og inhiberer NF-kB aktivitet som kan derfor dempe proinflammatoriske cytokiner sekresjon og modulere fettvev inflammasjon [45]. Vi tok ikke hensyn til hemmende effekt av NF-kB med n-3 PUFA via GPR120 fordi den reelle effekten av n-3 PUFA ble nesten avskaffet ved samtidig behandling med GW9662. Selv om samspillet mellom n-3PUFA og GPR120 ikke kan utelukkes, kan vår studie bevise, minst, at aktivering av PPAR-γ er en av de mekanismene som er ansvarlig for å redusere trekkende og invasive evner av prostata kreft celler indusert av TAM.
nedregulering av NF-kB nedstrøms mål som MMP-9, COX-2, VEGF, og IL-8 spiller viktige roller i å hemme kreftcellemigrering, invasjon og metastase [46], [47]. MMP-9 er en av de mest avgjørende MMP’er som bryter ned den ekstracellulære matriks (ECM) og videre stimulerer andre vekstfaktorer for å lette migrering og invasjon av kreftceller [48]. De viktigste naturlig inhibitor av MMP-9 er TIMP-1. Den C-terminale domene av TIMP-1 bindes til den hemopexin-lignende domene av MMP-9 [49].
