Abstract
Aim
microRNAs (mirnas) er involvert i ulike neoplastiske sykdommer, inkludert prostatakreft (PC). Hensikten med denne studien var å undersøke miRNA profil i PC vev, for å vurdere deres tilknytning clinicopathologic data, og for å vurdere potensialet i mirnas som diagnostiske og prognostiske markører.
Materialer og metoder
fra en kohort av 535 pasienter sendes til radikal prostatektomi (RP), et utvalg av 30 pasienter (14 pasienter med rask biokjemisk svikt (BF) og 16 pasienter uten BF) med Gleason score 7 ble analysert. Totalt 1435 miRNAs ble kvantifisert ved microarray hybridisering, og valgt mirnas med høyest Standardavvik (n = 50) ble validert av sanntids kvantitativ PCR (QRT-PCR).
In situ
hybridisering (ISH) ble brukt for å behandle uttrykket av MIR-21.
Resultater
MIR-21 var den eneste MIR som var signifikant oppregulert i BF-gruppen (p = 0,045) MIR-21 var oppregulert hos pasienter med BF sammenlignet med ikke-BF-gruppen (p = 0.05). I univariate analyser, høy stromal uttrykk for MIR-21 hadde prediktiv effekt på biokjemiske svikt overlevelse (BFFs) og klinisk svikt overlevelse (CFFS) (p = 0,006 og p = 0,04, henholdsvis). I multivariat analyse ble høy stromal uttrykk for MIR-21 uttrykk funnet å være en uavhengig prognostisk faktor for BFFs hos pasienter med Gleason scorer seks (HR 2,41, KI 95% 1,06 til 5,49, p = 0,037).
Konklusjon
Høy stromal uttrykk for MIR-21 var assosiert med dårlig biokjemisk tilbakefall overlevelse etter RP. For pasienter med Gleason score seks, kan MIR-21 bidra til å forutsi risikoen for fremtidig sykdomsutvikling og dermed bidra til utvalgte pasienter for eventuell adjuvant behandling eller en strengere oppfølging
Citation. Melbø-Jørgensen C, Ness N, Andersen S, Valkov A, Dønnem T, Al-Saad S, et al. (2014) stromal Uttrykk for MiR-21 Spår Biokjemisk Svikt i prostatakreftpasienter med Gleason Score 6. PLoS ONE 9 (11): e113039. doi: 10,1371 /journal.pone.0113039
Redaktør: Ichiro Aoki, Yokohama City University School of Medicine, Japan
mottatt: 14 august 2014; Godkjent: 17 oktober 2014; Publisert: 17.11.2014
Copyright: © 2014 Melbø-Jørgensen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Helse Nord, The Northern Health Administration (www.helse-nord.no) og Universitetet i Tromsø Arktisk universitet Norge (www.uit.no). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PC) er den nest største årsaken til kreft dødsfall blant menn [1]. Sykdommen Resultatet er variabel og vanskelig å forutsi. I løpet av de siste 30 årene, har antall radikale prostatectomies (RP) økte 25 ganger, hovedsakelig på grunn av pasienter overdiagnosed med-dødelige kreft [2]. Testing for prostataspesifikt antigen (PSA) er den vanligste verktøyet for å oppdage prostatakreft. Imidlertid har nyere studier vist at PSA-konsentrasjonen ikke er i stand til å skille mellom lat og livstruende kreft ved diagnosetidspunktet [3]. En identifisering av bedre prognostiske markører for risikovurderingen vil derfor ha stor betydning for den kliniske behandlingen av PC.
mirnas utgjør en klasse av små ikke-kodende RNA-molekyler (-20 nukleotider) som er involvert i regulering protein uttrykk . mirnas kan fremstilles som et biprodukt fra mRNA produksjon som inter-intron passasjerer, eller kan bli transkribert som en enkelt- eller polycistronisk produkt ved RNA polymerase II [4]. De virker ved å binde seg til det 3′-UTR av mål-mRNA, og indusere stanse av mRNA fra Argonaut (Ago) protein i RNA-induced Slå proteinkompleks (RISC) [4], [5]. Mange mirnas er deregulert i kreft og påvirkning av tumordannelse og progresjon fordi de er plassert i områder av genomet som ofte overuttrykt eller slettet [6]. Flere mirnas og deres mål er uttrykt unormalt i PC, som fører til tumorprogresjon, invasjon og metastasering. De endrede uttrykk for noen utvalgte mirnas potensielt nyttige som biomarkører for diagnose, prognose og klassifiseringsøyemed av PC [7] – [9]. MIR-21 var de første onkogene miRNA å bli oppdaget [10]. I PC, er MIR-21 anses å fungere som et onkogen, men dens rolle er uklar, og rapportene er i konflikt. Hulf et al. [11] funnet MIR-21 for å virke som et tumorsuppressorgen, mens Ribas et al. [12] rapporterte at overekspresjon av MIR-21 fremmet både hormonavhengig og hormonuavhengig tumorvekst i PC-cellelinjer. Videre konkluderte de at forhøyede nivåer av MIR-21 øker svulstutvikling, tumorvekst og indusert kastrering-resistent fenotype [13]. I motsetning til dette, Folini et al. [14] fant ingen forskjeller i MIR-21 uttrykk mellom normal prostata vev og PC. Shi et al. [15] fant MIR-21 å være involvert i chemoresistance og at Mir-21 ble oppregulert i Docetaxel motstandsdyktig PC3 (PCR3) celler sammenlignet med villtype PC3 celler.
I denne studien undersøkte vi miRNA profil i PC-pasienter. Blant 1435 mirnas, MIR-21 var den eneste kandidaten miRNA som var signifikant oppregulert og gjennomgikk videre evaluering som en prognostisk markør for hele kullet. Regional komité for medisinsk og helsefaglig forskningsetikk (2009/1393), Personvernombudet for forskning (NSD), og det nasjonale data Inspection Board har godkjent denne studien. Den etiske komiteen fravikes behovet for samtykke. Journalen ble anonymisert og avidentifisert før analysen.
Pasienter og metoder
Pasienter og vevsprøver
Primær svulstvev fra 535 radikal prostatektomi (RP) pasienter diagnostisert ved Universitetssykehuset i Nord-Norge, St. Olavs Hospital og Nordland Hospitalet fra 1995-2005 ble brukt i denne studien. Tilstrekkelig parafin innebygd vevsblokker og komplette demografiske og clinicopathological data ble innhentet for alle pasienter (tabell 1). Svulstene var gradert i henhold til den modifiserte Gleason gradering systemet [16] og iscenesatt i henhold til WHOs retningslinjer [17]. Alle primær vev ble histologisk vurdering av to patologer (ER og LTB).
miRNA screening
For miRNA profilering, 30 pasienter innenfor Gleason Score (GS) 7 gruppen ble fortløpende valgt , 14 av dem med en rask biokjemisk svikt BF (PSA≥0.4 ng /ml innen 24 måneder etter kirurgi) og 16 pasienter uten BF. GS 7 ble valgt som disse pasientene viser en heterogen klinisk resultat. De mirnas ble identifisert ved microarray hybridisering og kvantifisert med RT-qPCR (tabell 2). Totalt 1435 miRNAs ble kvantifisert ved microarray hybridisering og valgt mirnas med høyest standardavvik (n = 50) ble validert av kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR). Syv mirnas ble identifisert som det mest opp- eller ned-regulert. Av disse MIR-21 var den eneste kandidaten Mir som var signifikant oppregulert ved fold-endring. MiR-21 uttrykk ble deretter undersøkt i hele kullet ved kromogen
i
situ
hybridisering (CISH) og vurderes som en prognostisk markør for PC. Begge kreft epitelceller og tumorassosierte stromale områder ble undersøkt separat. Median oppfølgingstid var 89 måneder (variasjon 6-188). Den siste pasienten var oppdateringen november 2012.
Mikromatrise bygging
Tissue microarray (TMA) konstruksjonen ble valgt for høy gjennomstrømming molekylær patologi analyse [18]. For hvert enkelt tilfelle, en patolog (ER) histologisk identifisert og merket to kjerner med områder med tumorceller (epitelial tumorceller), to kjerner med tumor stromale vev, en kjerne fra områder med normale epitelceller, og en kjerne med normal stromal vev. Den TMA ble satt sammen ved hjelp av en vev-arraying instrument (Beecher Instruments, Silver Springs, MD, USA). Kort fortalt, vi brukte en nål diameter 0,6 mm for å høste de merkede vev områdene fra de tilsvarende formalinfikserte parafininnstøpte (FFPE) vevsblokker. Prøvene ble satt inn i en tom mottaker parafinblokk i henhold til et koordinatsystem mønster. For å inkludere alle kjerneprøver, ble tolv vev array-blokker konstruert. Flere 4 mikrometer seksjoner ble kuttet med en Micron mikrotom (HM355S), festet til glassplater, og forseglet med parafin. Den detaljerte metodikken har vært rapportert tidligere [19].
RNA ekstraksjon
RNA ble isolert fra formalinfiksert parafin-embedded prøver med RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE vev (Life Technologies) , og ble sendt til Exiqon (Vedbæk, Danmark) som utførte miRNA screening eksperiment. Tissue brukes for RNA ekstraksjon var tre 4 mm dyp, 0,6 mm sylindriske diameter kjerner fra merket kreft avdelinger fra FFPE- blokker. Den microarray brukte var LNA gruppen 6
th generasjon menneske, rotte og viral microarray designet med en miRNA bibliotek med 1435 mennesker, rotte og viral miRNA. Total-RNA (500 ng) fra både prøven og referansen ble merket med henholdsvis Hy3 og Hy5 fluorescerende markør, ved å bruke miRCURY LNA mikroRNA Hi-Power Labeling Kit, Hy3 /Hy5 (Exiqon, Danmark) ved å følge den fremgangsmåte som er beskrevet av produsenten. De Hy3-merkede prøver og en Hy5-merket referanse RNA prøve ble blandet parvis og hybridisert til miRCURY LNA mikroRNA Array sjette Gen (Exiqon, Danmark), som inneholder oppfangingsprober rettet mot alle microRNAs for human, mus eller rotte som er registrert i miRBASE 16,0. Den hybridisering ble utført i henhold til miRCURY LNA mikroRNA Array Instruksjonsbok bruke en Tecan HS4800 hybridisering stasjon (Tecan, Østerrike). Etter hybridisering, ble microarray lysbildene skannet og lagret i et ozonfritt miljø (ozon nivå under 2,0 ppb) for å forhindre mulig bleking av de fluorescerende fargestoffer. De miRCURY LNA mikroRNA Array lysbilder ble skannet med Agilent G2565BA Microarray Scanner System (Agilent Technologies, Inc., USA) og bildeanalyse ble utført ved hjelp av Imagene 9 (miRCURY LNA mikroRNA Array Analysis Software, Exiqon, Danmark). De kvantifiserte signalene ble bakgrunn korrigert og normalisert ved hjelp av den globale Lowess (lokalt Vektet scatterplot Smoothing) regresjonsalgoritmen.
Kvantifisering av modne miRNAs av sanntids qPCR
Kriteriene for utvelgelse mirnas for PCR validering var; signifikant P-verdi, høy ganger endring og tidligere troverdighet. De mirnas valgt for videre testing var MIR-21, MIR-141, MIR-23a, MIR-222, MIR-205, MIR-143 og MIR-145 (tabell 2). Alle sanntid qPCR eksperimenter ble utført ved Exiqon (Vedbæk, Danmark).
RNA (2 ul) ble revers transkribert i 10 mL reaksjoner ved bruk av miRCURY LNA Universal RT mikroRNA PCR, polyadenylering og cDNA syntese kit (Exiqon ). cDNA ble fortynnet 100 x og analysert i 10 pl PCR-reaksjoner i henhold til protokollen for miRCURY LNA Universal RT mikroRNA PCR; hver mikroRNA ble analysert i tre eksemplarer av qPCR på mikroRNA skreddersydde pick-n-mix panel. Negative kontroller unntatt mal i revers transkripsjonsreaksjon ble utført og profilert som prøvene. Amplifikasjonen ble utført i en LightCycler 480 Real-Time PCR System (Roche) i 384 brønns plater. Forsterker kurvene ble analysert ved bruk av Roche LC programvare, både for bestemmelse av krysningspunkt (CP) ved den andre deriverte metode, og for smelting kurve analyse.
forsterkningsvirkningsgrad ble beregnet ved hjelp av algoritmer som ligner på LinReg- programvare . Alle analyser ble inspisert med henblikk på forskjellige smeltekurver og smeltetemperaturen (T
m) ble kontrollert for å være innenfor kjente spesifikasjoner for analysen. Videre analyser ble påvist ved 5 Cp er mindre enn den negative kontroll, og med Cp 37 som skal inngå i dataanalysen. Data som ikke bestod disse kriteriene ble utelatt fra videre analyse.
Ved hjelp NormFinder den beste normalizer ble funnet å være Mir-23b. Alle data ble normalisert til denne miRNA i alle prøvene (MIR-23b – analysen Cp).
In situ
hybridisering
kromogen
i
situ
hybridisering (CISH) ble utført i henhold til «En dag mikroRNA ISH-protokollen» er utviklet av Exiqon, Vedbek, Danmark. Merket låst nukleinsyre (LNA) modifisert prober fra Exiqon for MIR-21 (HSA-MIR-21miRCURY LNA Prod. No. 38102-15), positiv kontroll (U6 har /nm /RNO) og negative kontroller (scramble-miRNA) ble anvendes. Noen optimaliseringer av metoden ble gjort for å få en bestemt og sensitiv påvisning av miRNA i våre seksjoner fra FFPE TMA.
4 mikrometer TMA lysbilder ble inkubert i tre dager ved 37 ° C for å feste kjerner til super Frost Plus lysbilder . Snittene ble deparaffinised i xylen (3 x 5 min), og deretter hydrert i etanol løsninger til PBS, pH 7,4. Proteinase K-20 um /ml, behandling ble gjort i PK-buffer (5 mM Tris-HCL, pH 7,5, 1 mM NaCl, autoklavert) ved 37 ° C i 20 min i en ThermoBrite hybridizer. Etter PBS-vask ble seksjonene rehydrert igjennom etanol og lufttørket. LNA-Probene ble denaturert ved oppvarming til 90 ° C i 4 min. Hybridisering av LNA-probene MIR-21 (50 nM), egge miRNA (50 nM) og U6 (1 nM) ble utført i et ThermoBrite hybridizer ved 50 ° C i 60 min. Strenge vaskinger ble utført i romtemperatur 5x SSC buffer, pre-oppvarmet SSC-buffere (50 ° C), 5 min i 5x SSC, 2 x 5 min i 1x SSC, 2 x 5 min i 0,2 SSC, og 5 min i RT 0,2 x SSC. Seksjonene ble blokkert mot uspesifikk binding i blokkeringsløsning fra DIG vaske og Block buffersett (11 585 762 001, Roche, Mannheim, Tyskland) i 15 min ved RT i et fuktighetskammer. Alkalisk fosfatase (AP) -konjugert anti DIG (11 093 274 910, Roche, Mannheim, Tyskland) 1:800 ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur i et fuktighetskammer for immunologisk påvisning. Etter PBS-T vaske substratet enzymatiske reaksjoner ble utført med NBT /BCIP (11 697 471 001, Roche, Mannheim, Tyskland) ved 30 ° C i ThermoBrite i 120 minutter. Reaksjonen ble stanset med en 2 x 5 min i vaske KTBT buffer (50 nM Tris-HCl, 150 nM NaCl, 10NM KCI), etterfulgt av vask i dobbeltdestillert vann. Seksjoner ble teller farget med atom rask rød (WALDECK, ZE-012-250) ved RT i 1 min og deretter skylles i vann fra springen. Dehydrering ble oppnådd ved å øke graderinger av etanol løsninger og endelig montering med Histokitt montering medium (Assistant-Histokitt, 1025/250 Sondheim /Rhoen Tyskland).
Skårer for CISH
bildeanalyse ble utført bruker ARIOL bildesystem (Genetix, San Jose, USA) komponering av et mikroskop (Olympus BX 61) er utstyrt med en automatisk scene og sklie loader, sammen med et kamera. Kjernene ble fotografert med 20x forstørrelse. Den dominerende fargeintensitet i epiteliale kreftceller og tumor rundt stromale celler ble scoret som; 0 = negativ 1 = svak 2 = moderat, og 3 = sterk. Alle prøver ble anonymisert og uavhengig scoret av to patologer (ER og AV). Ved vurdering av en variabel for en gitt kjerne, ble observatørene blindet for score til de andre variablene og til utfallet. Gjennomsnittlig poengsum for hvert tilfelle ble beregnet fra alle fire kjerner og begge sensorene. Ved uenighet (poengsum avvik 1), lysbildene ble re-undersøkt og konsensus ble nådd av observatørene
Statistiske metoder
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av statistikkpakke IBM. SPSS, versjon 21 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) (S1). Poengverdier fra hver patolog ble sammenlignet for inter-observatør pålitelighet ved bruk av en to-veis tilfeldig effekt modell med absolutt avtale definisjon. En Wilcoxon signert rank test ble anvendt for å vurdere om det var en statistisk signifikant forskjell i ekspresjonen av MIR-21 mellom normalt vev og kreftvev. Når man sammenligner de to prøvegrupper (BF versus ikke-BF gruppe) fra qPCR resultatene, ble tosidig t-test anvendt. For hele kullet, ble Pearson chi-kvadrat tester og Spearmans korrelasjon test utført for å undersøke sammenhenger mellom MIR-21 uttrykk og clinicopathological markører. Kaplan-Meyer metoden ble brukt til å lage plott av BFFs og CFFS. Log-rank test ble brukt til å teste for statistisk signifikans. Vesentlige variabler fra de univariate analysene ble videre undersøkt i den multivariate overlevelsesanalyse ved hjelp av en baklengs trinnvis Cox regresjonsmodellen med en sannsynlighet for trinnvis oppføring fjerning på 0,05 og 0,10, henholdsvis. Signifikansnivået ble brukt var p 0,05 for alle analyser. Alt overlevelsesanalyser ble utført ved anvendelse av tre forskjellige endepunkter: (i) biokjemisk svikt overlevelse (BFFs), (ii) klinisk svikt overlevelse (CFFS), og (iii) PC hjel overlevelse (PCDF). BF ble karakterisert som et PSA≥0.4 ng /ml og eren i minst to forskjellige blodprøver postoperativt. CF ble definert som bekreftet lokal symptomatisk progresjon og /eller verifisert metastase til ben, viscerale organer eller lymfeknuter på CT, MR, bein scan eller ultralyd. PCDFC ble definert som død forårsaket av progressive PC.
Resultater
Pasientens egenskaper og clinicopathological variabler
Total kohort.
En oversikt over pasientens kohort sin demografiske, kliniske og histopatologiske egenskaper er presentert i tabell 1. Median alder ved kirurgi var 62 (range 45-75). De prostatectomies var retropubic i 435 tilfeller og perineal i 100 tilfeller. Endelig oppfølging, hadde 170 pasienter opplevd BF, 36 CF, og 15 pasienter var døde av PC.
miRNA screening gruppen.
I de 30 pasienter med Gleason score 7 som gjennomgikk miRNA screening, median alder var 65 år (57-71), median PSA 18,8 ng /ml (range 5-79), median tumorstørrelse 22 mm (range 3-45), 21% opplevde CF og 14% var døde av prostata kreft. I den samlede gruppen av pasienter med Gleason score 7 (n = 270), median alder var 62 (range 47-74), median PSA 18,0 ng /ml (variasjon 0,7 til 71), median tumorstørrelse 23 mm, 22% opplevde CF og 9% var døde av prostatakreft. Ingen av disse forskjellene var statistisk signifikante.
microarray screening og qPCR validering
600 av 1435 mirnas undersøkt ved mikromatriser, hadde uttrykket ovenfor bakgrunn (bakgrunnssignalstyrke definert som 1,2 ganger intensiteten av en -kvartilen hvert lysbilde) (tabell 2). Av disse ble 50 mirnas med høyest standardavvik (SD) videre analysert. Fra mikromatriseanalyser, et hierarkisk 2D-gruppering viste en relativ uttrykk nivå av miRNAs som var oppregulert i begge gruppene (Figur 1a). Expression nivåer av 7 mirnas ble validert ved RT-qPCR (Tabell 3, Figur 1a). Fem av sju analyserte mirnas viste lignende trend i de to gruppene. The Heat Map Diagrammet viser resultatet av to-veis hierarkisk clustering av uttrykket nivået av de fem miRNAs. Z-poeng ble beskåret -2 til 2 (Figur 1b). MIR-21 var den eneste miRNA som var signifikant oppregulert i BF gruppen. Dette var i samsvar med oppstillings resultater. Det var en sterk sammenheng mellom array hybridisering og QRT-PCR.
a) Relative uttrykk nivåer av 50 mirnas som ble uttrykt i alle 30 matchet vevsprøver med Gleason scorer 7. X-aksen viser enkeltpersoner og Y-aksen viser miRNAs. Røde firkanter koder for oppregulert mirnas og grønne firkanter kode for nedregulert miRNAs. b) Varmekart resultatene av den to-veis hierarkisk gruppering basert på den qPCR resultatene. De mirnas viste samme trend i qPCR validering og i microarray analyse. De normaliserte verdier (DCP) har blitt brukt for analyse. Rød farge representerer et uttrykk nivå over gjennomsnittet, representerer uttrykk lavere enn gjennomsnittet blå farge.
Uttrykk av MIR-21 og sammenhenger i total kohorten
Generelt MIR-21 ble uttrykt på et høyere nivå i tumor stromale områder enn i tumor epitelceller (figur 2). Intensiteten av MIR-21 ekspresjon var sterkere i cytoplasma i tumorvev sammenlignet med normalt vev fra pasienter (p 0,001). Det var ingen forskjell i MIR-21 ekspresjon mellom tumor epitelceller og normale epitelceller. En betydelig høyere uttrykk av MIR-21 ble funnet i svulsten stromal område enn hos ikke-neoplastisk stromal område (p 0,001). Ved å sammenligne kreft epitelceller med stromale tumorceller, ble Mir-21 uttrykt på et høyere nivå i stromale tumorceller (p 0,001).
Det var signifikante sammenhenger mellom høy tumor stromal uttrykk for MIR-21 og pT-scenen (
r
= 0,134, p = 0,003), perinevral infiltrasjon (PNI) (
r
= 0,175, p 0,001) og vaskulær infiltrasjon (
r
= 0,222 p 0,001). Vi fant en svak sammenheng mellom stromal uttrykk for mir-21 og Gleason score (
r
= 0,218, p 0,001). Det var også signifikant korrelasjon mellom stromal uttrykk for MIR-21 og Gleason Score (GS); GS 7, GS 7 og GS 7 (r = 0,238, p 0,001).
Det var ingen forskjeller i stromal uttrykk for MIR-21 mellom undergrupper av Gleason score, 3 + 4 (n = 220, 41%) og 4 + 3 (n = 80, 15%) (r = – 0.001, p = 0,991)
Univariat analyse
clinicopathological variabler pT-scenen (. p 0,001), preoperativ PSA verdi dikotomisert på 10 ng /dL (n = 221, p 0,001), Gleason score (p 0,001), tumorstørrelse dikotomisert ved 20 mm (n = 285, p 0,001), perinevral infiltrasjon (PNI) (no = 134, p 0,001), positive kirurgiske marginer (PSM) (n = 286, p = 0,041), positiv kirurgisk periferiske margin (n = 154, p 0,001), positiv kirurgisk apikale margin (n = 210, p = 0,04), og vaskulær infiltrasjon (n = 43, p 0,001) ble alle signifikant korrelert til BFFs i univariate overlevelse analyser (tabell 1)
4
th kvartil ble brukt. som cut-off. En høy uttrykk for MIR-21 i tumor stromal områder var signifikant korrelert med BF (n = 170, p = 0,006, figur 3a), og CF (n = 36, p = 0,041, figur ikke vist.) Det var ingen sammenheng mellom høy stromal uttrykk for MIR-21 og PCD (n = 14, p = 0,505).
b) Pasienter med Gleason scorer 6.
i subgruppeanalyser fant vi høy stromal uttrykk av MIR-21 å være signifikant assosiert med øket risiko for BF hos pasienter med GS 6 (n = 167, p = 0,023, fig S3b), men dette ble ikke funnet hos pasienter med GS-7 (n = 262, p = 0,228) , Gleason grad 3 + 4 (n = 189, p = 0,0290, Gleason grad 4 + 3 (n = 73, p = 0,818), og GS . 7 (n = 36, p = 0,895) Vi har også funnet høy stromal uttrykk korrelert til BF for pasienter med positive omkrets marginer (n = 139, p = 0,026), men ikke for de med gratis periferiske marginer (n = 339, p = 0,107).
multivariatanalyse
Betydelige clinicopathological og molekylære markører fra univariat analyse ble inngått den multivariate modellen. Tabell 4 viser de uavhengige prognostiske faktorer for BF; pT-trinn (p = 0,001), Gleason grad (p = 0,021), ikke-apikal PSM (n = 286, p = 0,001), apikale PSM (n = 210, p = 0,003). For CF; Gleason grad (p = 0,013), PNI (n = 134, p = 0,028), ikke-apikal PSM (p = 0,028).
Høy stromal uttrykk for MIR-21 var en uavhengig prognostisk faktor for BF hos pasienter med Gleason score 6 (n = 167, HR 2,40, KI 95% 1,06 til 5,49, p = 0,037). En signifikant sammenheng mellom høy stromal uttrykk for MIR-21 og BF ble også funnet i undergruppen av pasienter med PSM (HR 1,95, KI 95% 1,95 til 3,21, p = 0,008). Men for hele kullet (n = 471), var det bare en trend mot en uavhengig sammenheng mellom stromal ekspresjon av MIR-21 og BF (n = 170, p = 0,089). Høy stromal uttrykk for MIR-21 var ikke en uavhengig prognostisk variabel for CF (n = 36, p = 0,395).
Diskusjoner
I denne studien fant vi en høyere uttrykk for speil 21 i kreftvev sammenlignet med normal prostata vev. Uttrykket var høyest i stromale tumorområder. Høy svulst stromal uttrykk for MIR-21 var en uavhengig prognostisk faktor for biokjemisk svikt hos pasienter med Gleason klasse 6, men ikke klinisk svikt, sannsynligvis på grunn av noen hendelser i den sistnevnte gruppen. Så vidt vi vet, er dette den første studien rapporterer svulst stromal uttrykk for MIR-21 som en prognostisk markør for BF etter radikal prostatektomi. Videre har vi også funnet en høy stromal uttrykk for å være en uavhengig markør for PSM i RP prøver.
Nyere studier har vist at mirnas er vesentlig endret i prostatakreft, noe som tyder på at mirnas fungere som viktige regulatorer av prostata kreftutvikling. Flere studier har blitt gjennomført for å identifisere PC-spesifikke miRNA signatur, men n konsensus er nådd med hensyn til mirnas rolle i utvikling og progresjon av PC [20], [21]. I en studie av Violinia et al. [22], total-RNA ble ekstrahert fra 363 faste cancere, inkludert prostata cancer, og 177 normalt vev. De fant en generell oppregulering av 39 miRNAs, inkludert MIR-21, mens 6 mirnas ble nedregulert. Disse resultatene var i delvis overensstemmelse med en studie av Ambs et al. hvor total RNA ekstrahert fra 60 mikro dissekert PC og 16 omkringliggende ikke-tumorvev ble analysert [23]. MiR-21 er generelt ansett som et onkogen, men så langt dens rolle i PC er uklart og rapportene har vært motstridende [11], [12], [14], [20]. MIR-21 er funnet å være forhøyet i PC3 og DU145 androgen-uavhengig cellelinjer [24]. Dessuten ble MIR-21 er identifisert som en androgen reseptor-regulert miRNA hvis nivå er forhøyet i PC sammenlignet med tilstøtende normalt vev [12]. Hemninger av MIR-21 redusere androgen-indusert PC celleproliferasjon, mens forhøyet uttrykk av MIR-21 fremmer forbedret tumorvekst og kastrering motstand
i
vivo product: [12]. Andre har også funnet MIR-21 oppregulert i pasienter med hormon og kjemoresistent PC [13], [15].
Vi fant at høy tumor stromal uttrykk for MIR-21 i svulster med Gleason scorer 6 spådd BF. Dette er i tråd med tidligere rapporter [25]. Stromal MIR-21 uttrykk analyse kan være en potensiell verktøy for å forutsi hvilke høyt differensierte svulster som er mest sannsynlig å gå videre. Nyere studier har gitt verdifull innsikt i å klargjøre involment av MIR-21 i svulstens mikromiljø: Bullock et al. [26] viste at oppregulert MIR-21 uttrykk oppstår i kreft-assosiert stromale celler, men ikke i colo-endetarms kreft celler. Videre fant de at ektopisk MIR-21 uttrykk i fibroblaster modulert den cytotoksiske effekten av oksaliplatin (chemotherapheutic brukes i behandling av kreft i tykktarmen) som resulterte i kreft progresjon. Bronisz et al. [27] viste at nedregulering av mir-320 i mammary stromal fibroblaster omprogrammerer svulsten mikromiljøet ved å aktivere en pro-onkogen secretome, og interessant, Yao et al. [28] rapporterte at myofibroblast transdifferensiering fra stamceller fibroblaster som svar på TGF-β kan forebygges ved hjelp av bestemte antisense hemmere av MIR-21. Sammen tyder disse data på pro-metastatisk påvirkning av mRNA i fibroblast differensiering og fenotype, og at MIR-21 kan være mediert gjennom svulsten mikromiljøet. Imidlertid er biologisk og funksjonelt bevis som støtter disse funnene, spesielt prostata karsinomer, begrenset.
Det er vel kjent at mindre enn 3% av pasientene med Gleason score≤6 noensinne vil utvikle enten behandlet eller ikke, og at en betydelig prosentandel av disse pasientene fortsetter å gjennomgå unødvendig behandling etter en diagnose av lav risiko PC (basert på en PSA 10 ng /ml og scene ≤ T2a) [29], [30]. Stromal MIR-21 uttrykk analyse kan være en potensiell verktøy for å forutsi hvilke høyt differensierte svulster som er mest sannsynlig å gå videre. Videre studier for å avklare eksakte rolle MIR-21 i disse høyt differensierte svulster er nødvendig. I motsetning til tidligere rapporter, fant vi høy uttrykk for MIR-21 hos pasienter med positive kirurgiske marginer, [25]. De molekylære mekanismene for dette er ukjent.
De sprikende resultatene av MIR-21 i ulike studier kan reflektere heterogenitet av PC, samt annen studie design og metodikk. En miRNA screening av hele kullet ville ha styrket vår studie. Dessuten kan kvaliteten på undersøkte vev (inkludert håndtering) drastisk påvirke tolkningen av microarray data. Foruten de interessante data på BF, er vår studie noe begrenset av det lave antallet tilfeller med klinisk tilbakefall eller PCD. Videre studier av denne mikroRNA og tilhørende veier kan avdekke nye mekanismer for kreft progresjon og terapeutisk intervensjon.
Konklusjon
Denne studien på miRNA profilering og validering i prostatakreft legger ytterligere bevis for MIR-21 som en prognostisk markør for PC. Disse resultatene indikerer at stromal uttrykk for MIR-21 har en viktig rolle i sykdomsutviklingen, men den underliggende mekanismen må undersøkes nærmere.
Hjelpemiddel Informasjon
Fil S1.
doi: 10,1371 /journal.pone.0113039.s001 product: (ZIP)
Takk
Vi takker de deltakende laboratorium teknikere ved Institutt for patologi, UNN for deres støtte og tekniske ferdigheter. Spesielt ønsker vi å takke Magnus Persson, Mona Pedersen og Marit Nina Nilsen, Christopher Fenton, Øystein Størkersen og Anders Angelsen.
