Abstract
Nuclear faktor-erytropoide to P45-relatert faktor 2 (Nrf2) er en transkripsjonsfaktor som regulerer uttrykket av mange cytoprotective gener. I denne studien fant vi at uttrykket av Nrf2 ble undertrykt i prostata svulst i Transgene Adenokarsinom av Mouse Prostata (TRAMP) mus. Tilsvarende uttrykk for Nrf2 og induksjon av NQO1 ble også betydelig undertrykt i tumorigent Tramp C1 celler, men ikke i ikke-tumorigene TRAMP C3 celler. Undersøkelse av promoter-regionen til mus Nrf2 genet identifisert et CpG øy, som ble metylert ved spesifikke CpG steder i prostata TRAMP tumor og i TRAMP C1-celler, men ikke i normal prostata eller TRAMP C3-celler, som vist ved bisulfitt genomisk sekvensering. Reporter-analyser indikerte at metylering av disse CpG områdene dramatisk inhiberte den transkripsjonelle aktivitet av Nrf2 promoteren. Kromatin immunopreceipitation (chip) analyser avslørte økt binding av metyl-CpG-bindende protein 2 (MBD2) og trimetyl-histon H3 (Lys9) proteiner til disse CpG-områdene i de TRAMP C1 celler sammenlignet med TRAMP C3 celler. I motsetning til dette, ble bindingen av RNA-Pol II og acetylert histon H3 til Nrf2 promoteren redusert. Videre behandling av TRAMP C1 celler med DNA-metyltransferase (DNMT) inhibitor 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza) og histondeacetylase (HDAC) inhibitor trichostatin A (TSA) gjenopprettet ekspresjon av Nrf2 så vel som induksjon av NQO1 i TRAMP C1 celler. Samlet utgjør disse resultatene indikerer at uttrykket av Nrf2 undertrykkes epigenetiske av arrangøren metylering forbundet med MBD2 og histonmodifikasjonene i prostata svulst Tramp mus. Våre nåværende funn viser en ny mekanisme som Nrf2 uttrykk undertrykkes i TRAMP prostata svulst, kaste nytt lys over den rollen Nrf2 i kreftutvikling og gi eventuelle nye retninger for oppdagelse og forebygging av prostatakreft
Citation.: Yu S, Khor TIL, Cheung KL, Li W, Wu TY, Huang Y, et al. (2010) Nrf2 Expression er regulert av epigenetiske mekanismer i prostatakreft av Tramp Mus. PLoS ONE 5 (1): e8579. doi: 10,1371 /journal.pone.0008579
Redaktør: Andy T. Y. Lau, University of Minnesota, USA
mottatt: 13 september 2009; Godkjent: 06.12.2009; Publisert: 05.01.2010
Copyright: © 2010 Yu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av National Institutes of Health gir R01-CA118947 og R01-094828 til A.-N. T. Kong. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
prostata kreft, så vel som mange andre aldersrelaterte krefttyper, er karakterisert ved økt intracellulær oksidativt stress [1], [2]. Kronisk oksidativt stress og tilhørende patologiske tilstander, inkludert betennelse og metabolske sykdommer har blitt postulert å kjøre somatiske mutasjoner og neoplastisk transformasjon, og dermed kunne spille en viktig rolle i utvikling og progresjon av prostatakreft [3]. Økt oksidativt stress eller reaktive oksygenforbindelser (ROS) nivåer kan være en konsekvens av økt ROS produksjon og /eller redusert antioksidantkapasitet og eller ROS avgiftning. Nylig nedsatt antioksidantforsvar i kreftutvikling av prostatakreft har vært å få økt oppmerksomhet.
Mobilantioksidantforsvar system består av et batteri av antioksidant /avgifte enzymer og proteiner som superoksid dismutase (SOD), katalase, hemeoxgenase ( HO), UDP-glukuronosyltransferaser (UGT), glutation peroksidase (GPX), glutation S-transferaser (GST) og NAD (P) H: quinon oksidoreduktase (NQO) [4]. Nedregulering av GST ved DNA-metylering synes å være ganske vanlig i human prostata cancer at det har blitt utviklet som en diagnostisk markør [5]. Uttrykket og aktivitetene til SOD, er blitt rapportert katalase og GPX til å bli redusert i prostata carcinoma vev, så vel som i plasma og erytrocytter [6] – [8]. Nyere studier fra vårt laboratorium og andre har funnet ut at uttrykket nivåer av SOD, UGT1A1, NQO1 og flere GST familie gener ble betydelig undertrykt i prostatakreft i Transgene Adenokarsinom av Mouse Prostata (TRAMP) mus [9] – [11]. Selv om nedregulering av GST enzymer i human prostata cancer har vært knyttet til promoteren hypermethylation av GST-gener [5], [12]; promoter DNA hypermethylation ser ikke ut til å forårsake GST gen undertrykkelse i Tramp svulster [9]. I stedet nedregulering av kjernefysiske faktor-erytropoide 2p45 (NF-E2) -relaterte faktor 2 (Nrf2), en viktig regulator av cellulære antioksidant enzymer, kan være ansvarlig for transkripsjonen undertrykkelse av GST og andre fase II avgift enzym gener [11 ].
Nrf2 er en helix-loop-helix grunn leucine glidelås transkripsjonsfaktor som regulerer uttrykket av mange fase II avgift og antioksidant enzymer via sin binding til antioksidant-responselement (eR) i promotorområdet [ ,,,0],4]. Knockout av Nrf2 i mus vesentlig avskaffet induserbare uttrykk for ARE-mediert avgifte og antioksidant enzymer, og gjengitt disse musene svært utsatt for kreftfremkallende og /eller oksidative skader [13], [14]. I disse sammenheng, tidligere som vi har funnet at proteinet uttrykket nivåer av Nrf2 og Nrf2-målgenet heme-oksygenase-1 (HO-1) ble svekket i huden tumorer i mus hud karsinogenese modell [15]. På samme måte ble ekspresjon av Nrf2 så vel som dets nedstrøms målgener som UGT1A1, GSTM1 og NQO1 funnet å være gradvis nedregulert i prostatatumorer med progresjon av prostata tumordannelse i tramp mus [10]. Frølich et al. rapporterte nylig uttrykk for Nrf2 og GST Mu-familiens gener ble betydelig redusert i TRAMP prostata svulst, og knyttet dette fenomenet til økt oksidativt stress og DNA-skade i prostatakreft. Meta-analyse av vev uttrykk profilering data fra Oncomine database (www.oncomine.org) foreslo at de uttrykk for Nrf2 og flere GST mu gener er også gradvis nedregulert i humane prostata kreft [11].
transkripsjon av Nrf2 har nylig blitt vist å bli regulert av aryl-hydrokarbon-reseptor (AhR) og Nrf2 i seg selv [16], [17]. Imidlertid synes det for tiden akseptert paradigme Nrf2 regulering skal i hovedsak oppnås via posttranslasjonelle mekanismer. Som sådan er Nrf2 funksjonelt trykkes av Kelch lignende erytroid-celle-avledet protein med CNC-homologi (ECH) -Associated protein 1 (Keap1), som binder seg til og sequesters Nrf2 i cytoplasma som fører til nedbrytning av Nrf2, og dermed forhindrer Nrf2 kjernefysisk translokasjon og trans av sine mål gener [18]. Ved utfordringene ved oksidativ eller elektro påkjenninger som kan medføre potensiell endring av kritiske cysteinrester i Keap1 og eller Nrf2 seg sammen med fosforylering av kinaser, er Nrf2 løslatt fra Keap-en, translocates inn i kjernen, dimerizes med små MAF proteiner, binder seg til ARE og transcriptionally aktiverer Nrf2-ER målgener [4]. Til dags dato er det ikke klart om hvordan uttrykk for Nrf2 i menneskelig prostata kreft eller i TRAMP mus tumor er undertrykt.
epigenetiske eller epigenomic mekanismer, særlig DNA metylering, er ofte innblandet i endringer av genet ekspresjon i prostatakreft [19], [20]. Koordinert hypermethylation av APC og GSTP1 tidlig i kreftutvikling har blitt utnyttet som potensielle diagnostiske markører for å oppdage prostatakreft [21]. I tillegg er endring av DNA-metylering profiler er forbundet med progresjon av kreft [20]. DNA metylering, kombinert med histonmodifikasjonene, vil påvirke interaksjoner av arrangører av kritiske gener med transkripsjons corepressors og coactivators fører til endringer i genekspresjon, som kan være en av drivkreftene for prostata kreftutvikling. Stanse av flere gener ved DNA metylering har blitt rapportert i Tramp prostatakreft og cellelinjer avledet fra Tramp prostatakreft [22] – [24]. Inhibering av DNA-metyltransferase-aktivitet ved 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza) er blitt vist å forebygge prostata tumorgenese i tramp mus [25]. I tillegg er ekspresjonen av Keap1 blitt rapportert å bli regulert ved hjelp av DNA-metylering i lungekreft [26]. I den foreliggende undersøkelse har vi først identifisert et CpG øy i oppstrøms 5′-flankerende region av det murine Nrf2-genet, etterfulgt av avlesning av DNA-metylering status for hele CpG øya via bisulfitt genomisk sekvensering. Vi har funnet at visse CpG områder i den fjerne regionen av CpG øy ble hypermethylated i TRAMP tumorvev, så vel som i tumorigen TRAMP-C1 og C2 celler, men ikke i normal prostatisk vev og ikke-tumorigene TRAMP-C3-celler. Utnytte denaturert reporter analysen, kromatin immunpresipitering (chip) analyse og behandlinger med trichostatin A (TSA) /5-aza, forutsatt at vi overbevisende bevis for at uttrykket av Nrf2 er epigenetiske regulert under utviklingen av prostatakreft i Tramp mus. Nrf2 uttrykk ble undertrykt ved metylering av visse CpG områder, og dette ble fulgt av rekruttering av MBD2 og trimetyl-histon H3 (Lys9) til Nrf2 genet arrangøren i prostata svulst tramp mus.
Resultater
Hypermethylation av spesifikke CpG nettsteder i CpG Island i Murine Nrf2 Gene
genomisk sekvens av Nrf2 genet (NC_000068.6: 75544698-75513576 Mus musculus kromosom 2, referanseenheten (C57BL /6J), inkludert 2 kb av sin 5′-oppstrøms sekvens) ble analysert for CpG island hjelp CpG island Finder (https://people.usd.edu/~sye/cpgisland/CpGIF.htm). Siden flere mRNA-varianter med forskjellige transkripsjonsstartsider (TSS) har blitt rapportert i litteraturen [16], [27], [28], og derfor i den foreliggende undersøkelsen definerer vi initieringssetet for translasjon (TIS) i posisjon 1 for å unngå enhver mulig forvirring. En CpG island ble identifisert mellom -1175 og 1240, med en GC innhold på 61,53%, CpG observert /forventet ratio på 0,66 og en total på 150 CPGs. Den CpG øy omfatter det murine Nrf2-promotoren, det første exon og del av det første intron (figur 1A). Lignende resultater ble oppnådd ved bruk av andre kriterier og algoritmen (https://www.uscnorris.com/cpgislands2/cpg.aspx, data ikke vist). 10 sett med bisulfitt genomisk sekvense (BGS) primere ble utformet ved hjelp av BiSearch webserveren (https://bisearch.enzim.hu/, [29]) for å dekke 5′-flankerende område som spenner -1226 til 844 av murine Nrf2 gen (tabell S1). Bisulfite-konvertert genomisk DNA som stammer fra 12 håndgripelig prostatakreft på 24 uker gammel tramp mus og 10 tilsynelatende normale prostata vev av C57BL /6J mus ble brukt som maler. Som vist i figur 1B, selv om mesteparten av CpG øya er knapt denaturert, ble de første 5 CpG områder syntes å være hypermethylated (96%) i prostata tumorer sammenlignet med tilsynelatende normalt vev prostata (4%). Representative sekvense Kromatogrammene viser de første 5 CPGs i prostata tumor og normal prostata er vist i figur S1. Følgende 10 CPGs som er atskilt med to CpG-fri hull (-1131 til -1060 og -886 til -798) vises også differensial metylering status i tumorer (34%) sammenlignet med normalt vev (2%). I tillegg er en annen region som ligger i den første intron synes å være tynt CpG-metylert i prostata tumor (4,5%).
(A) En CpG øy ble identifisert i den 5′-flankerende region av mus Nrf2 gen , som strekker seg fra posisjon -1175 til 1240 med oversettelsen initiering nettstedet satt som posisjon 1. sekvensene er omfattet av bisulfit genomisk sekvensering (-1226-844) og inneholder denaturert CPGs er skjematisk presentert med CpG områder angitt med vertikale linjer. (B) metylering mønstre og omfang av CpG steder i formidler av Nrf2 genet i TRAMP prostata svulst og tilsynelatende normal prostata ble bestemt av sulfitt genomisk sekvensering som beskrevet i Material Metoder. Svarte prikker indikerer denaturert CPGs og åpne sirkler indikerer ikke-denaturert CPGs. (C) De metylering mønster og omfang av CpG steder i promotoren av genet i Nrf2 TRAMP C1 og C3-celler ble bestemt. De CPGs i sekvensen mellom 296-594 vises ikke fordi metylering er ubetydelig.
TRAMP C1, C2 og C3 cellelinjer ble stammer fra en heterogen tumor av 32-ukers TRAMP mus [30 ]. Mens TRAMP C1 og C2 cellene er tumorigent når podet inn syngene C57BL /6J verter, TRAMP C3 cellene ikke. Genomisk DNA fra C1 og C3-celler ble bisulfitt-sekvensert som beskrevet ovenfor for å detektere metylering statusen til CpG øya i Nrf2 genet. Overraskende, denaturert CpG «hot spots» som finnes ovenfor i TRAMP prostata svulst ble også metylert i tumorigene C1 celler, men ikke i ikke-tumorigent tramp C3 celler (figur 1C).
metylering av de første 5 CPGs betydelig Trykt den transkripsjonen aktivitet av Mouse Nrf2 Arrangøren
for å undersøke den funksjonelle rollen metylering av spesifikke CpG områder, spesielt de første 5 CPGs i CpG island, luciferase reportere drevet av Nrf2 arrangøren med eller uten den første 5 CPGs (betegnet som -1367 og -1065, henholdsvis) ble konstruert som beskrevet i materialer og metoder (figur 2A). De plasmider ble metylert ved hjelp M. SSSI CpG metyltransferase
in vitro Hotell og metylering status ble bekreftet av Hpal /HhaII fordøyelse (figur S2). Som vist på fig. 2B, den -1065 Nrf2 promoteren, som var blitt rapportert tidligere [17], [28], vesentlig øket luciferaseaktiviteten til ca 200 folder. I motsetning til dette -1367 Nrf2-promotoren viste en mindre potent transkripsjonen aktivitet (~67 folder). Viktigere,
in vitro
CpG-metylering av reporter konstruksjonen resulterte i en dramatisk reduksjon av den transkripsjonelle aktivitet av den -1367 Nrf2 promoter (84% reduksjon); mens aktiviteten av den -1065 promoteren ble redusert med bare 23,4% av CpG-metylering. Lignende resultater ble oppnådd i Hep G2 hepatomceller og humane embryoniske nyre HEK 293-celler (figur S3).
(A) Konstruksjon av luciferase reportere er skjematisk presentert. Nrf2 promotorer med (-1367-1) eller uten (-1065 til 1) den ekstra sekvensen inneholder de første 5 CPGs ble amplifisert fra musegenomisk DNA og satt inn i PGL 4,15 vektor. Den resulterte journalister ble utpekt som PGL-1367 og PGL-1065, henholdsvis. (B) PGL-1367 eller PGL-1065 reportere, enten metylert ved CpG metyltransferase eller ikke, ble ko-transfektert med PGL 4,75 vektor som inneholder en Renilla reniformis luciferasegenet drevet av CMV-promoteren inn i TRAMP C1-celler, og luciferase-aktiviteter ble målt etter 24 timer. Den transkripsjonelle aktivitet av hver av de konstruksjoner ble beregnet ved normalisering av ildflue luciferase-aktivitet med tilsvarende Renilla luciferase-aktivitet, og er representert som folder av induksjon sammenlignet med aktiviteten av tom PGL 4,15 vektor. Verdiene er gjennomsnitt ± SD av fire separate prøver.
Hypermethylated CpG Island var assosiert med metyl-CpG-bindende domene (MBD2) og histonmodifikasjonene, er reversibel ved 5-aza /TSA Behandling
undertrykkelse av genekspresjon av CpG metylering er vanligvis oppnås ved MBD proteiner som binder seg til metylert DNA som fører til rekruttering av kromatin remodellering og transkripsjons repressor komplekser [31]. I denne studien ble chip analyser benyttes til undersøkelse av proteiner som muligens kunne være forbundet med Nrf2 promoter i TRAMP C1 og C3 celler. Basert på metylering status for Nrf2 arrangøren, ble primersett utformet for å dekke de første 5 CPGs og TSS å oppdage foreningen av spesifiserte DNA-bindende proteiner samt RNA polymerase II (Pol II). Spesifisiteten av chip analyser ble verifisert ved uspesifikke IgG som ikke trekke ned noe. Som en positiv kontroll, er β-aktin-promoter like forbundet med Pol II i C1 og C3 (figur 3A). Bindingen av Pol II til Nrf2 genet TSS ble signifikant redusert i C1 celler sammenlignet med i C3-celler, noe som indikerer en undertrykt transkripsjon av Nrf2 i C1-celler (figur 3A og amp; B). Etter avtale med denne observasjonen, binding av MBD2 og tri-denaturert histone 3-lys9, (H3K9me3) til denaturert CPGs i Nrf2 arrangøren var høyere i C1 celler enn i C3 celler, mens foreningen av acetylert histone 3 (H3Ac) vises en omvendt mønster (figur 3A B). Metyl CpG bindende protein 2 (MeCP2) og pattedyr Sin3A (mSin3A) ble også testet for sin binding med denne Nrf2 arrangøren; imidlertid ingen påvisbar binding ble observert (data ikke vist).
(A) -brikke analyse ble utført for å påvise binding av angitte proteiner til spesifikke regioner av Nrf2 gen tverrbundet og immunopresipitert fra TRAMP C1 og C3-celler. Resultatene fra 3 uavhengige eksperimenter ble kvantifisert ved densitometri som vist i (B). (C) TRAMP C1-celler ble behandlet med bærer, 5-aza-eller 5-aza + TSA som beskrevet, og deretter ble cellene underkastet til chip-analyse. Resultatene fra 2 uavhengige eksperimenter ble kvantifisert ved densitometri som vist i (D). Chip-analyser ble utført som beskrevet i Materiell og amp; Metoder som bruker antistoffer mot Pol II, MBD2, H3K9m3 og AcH3. 3 sett med chip primere ble brukt (tabell S2), med Nrf2P1 dekker de første 5 CPGs (-1190 til -1092) i CpG island og Nrf2P2 dekker et område nær TSS (-62 til 20). Ikke-spesifikk IgG ble anvendt som en negativ kontroll og binding av Pol II p-aktin-promoteren ble anvendt for å bekrefte effektiviteten av ChIP assay. Forsøkene ble gjentatt minst to ganger med lignende resultater.
Metyleringen status av DNA reguleres ved DNA-metyl-transferaser (DNMTs) og 5-aza er en DNMT inhibitor, blir ofte brukt til å undersøke Virkningen av DNA-metylering [32]. Som vist i figur 3C D, 5-aza behandling av C1-celler reduserer bindingen av MBD2 og H3K9me3 til Nrf2 promoteren, mens den H3Ac oppviser noen observerbar effekt. Men kombinert behandling av C1 celler med 5-aza og en histon deactylase (HDAC) inhibitor, TSA, øker betydelig binding av H3Ac til Nrf2 promoter, og ytterligere reduserer bindingene av MBD2 og H3K9me3 til Nrf2 arrangøren. I samsvar med ovennevnte resultater, rekruttering av Pol II til Nrf2 arrangøren øker også tilsvarende, mens Pol II binding til p-aktin promoter ikke ble endret (figur 3C).
Den Transkripsjonell Induksjon av Nrf2 og NQO- 1 i Tramp cellelinjer var korrelert med CpG øyer Metylering Status og kan gjenopprettes ved 5-aza /TSA Behandling
Vi og andre har tidligere rapportert at uttrykket av Nrf2 og dets mål gener er undertrykt i Tramp prostatakreft [10], [11]. Marvis et al., Har rapportert at ekspresjon av GST familie gener er undertrykt i TRAMP C2 celler og 5-aza og TSA behandling kunne gi ekspresjon [9]. Her undersøkte vi uttrykket av Nrf2 og en av dens nedstrøms målgener NQO1 i TRAMP C1 og C3 celler. Som vist i figur 4A, mRNA nivået av Nrf2 er betydelig lavere i C1-celler enn i C3-celler. Ekspresjon av NQO1 lett ble indusert av TBHQ, en klassisk Nrf2 agonist, i C3-celler, mens for eksempel induksjon ble avstumpet i C1-celler (figur 4A & C). Behandling av C1 celler med 5-aza og TSA beskjedent restaurert Nrf2 uttrykk og betydelig forbedret induksjon av NQO1 av TBHQ. Imidlertid er behandling av C3-celler under de samme forhold viste ingen effekt på ekspresjonen av Nrf2 eller NQO1 (figur 4A, B & C). Western blotting ble utført for å undersøke protein uttrykk nivåer av Nrf2, NQO1, MBD2, H3Ac og H3K9me3 (figur 4D). Protein nivåer av Nrf2 og NQO1 var lavere i C1-celler enn i C3-celler, og 5-aza og TSA behandling forbedret induksjon av NQO1 protein ved TBHQ. Selv om 5-aza og TSA behandling ikke øke basalnivået Nrf2 protein behandlingen betydelig utvidet TBHQ-indusert Nrf2 protein uttrykk. TSA behandling sterk økning av acetylert histon-3-protein mens hadde ingen effekt på histon-3 metylering status. Interessant, selv om proteinnivået av MBD2 ikke ble påvirket av 5-aza og TSA behandling, var det mye høyere i C1-celler enn i C3 celler (Figur 4D).
TRAMP C1 og C3-celler ble behandlet med 2- uM 5-aza, 200 nM TSA, eller 1 uM 5-aza pluss 100 nM TSA i 60 timer eller 48 timer, etterfulgt av inkubering i nærvær av 5 uM TBHQ i ytterligere 12 timer. Etter behandling ble cellene høstet for totalt protein eller RNA-ekstraksjoner. (A) mRNA nivåene av Nrf2 og NQO1 ble bestemt ved hjelp av RT-PCR, med GAPDH tjener som intern kontroll, og resultatene fra 3 uavhengige eksperimenter ble kvantifisert ved densitometri, og resultatene er vist i B og C (D) proteinet nivåer av Nrf2, NQO1, MBD2, H3K9me3 og H3Ac ble bestemt ved Western blotting, med aktin som en lasting kontroll. Hvert eksperiment ble gjentatt minst to ganger med samme resultat.
Diskusjoner
Tidligere funn fra flere laboratorier inkludert vårt laboratorium har vist at Nrf2 spiller en viktig rolle i utviklingen av ulike kreftformer [ ,,,0],33]. Nrf2 regulerer uttrykket av antioksidanter og fase II avgifte enzymer inkludert NQO1, HO-1 og GST [33]. Derfor vil kontroll av transkripsjonelle aktivering av Nrf2 og Nrf2-målgener synes å være en viktig homøostatisk mekanisme som beskytter cellulære skader eller ødeleggelser resulterte fra oksidativt stress [33]. Nrf2 mangel kan føre til feil i mobilnettet forsvar mot oksidativt stress, potensielt resulterer i kreft initiering, promotering og progresjon [34]. Den undertrykte uttrykk for antioksidant og avgifte enzymer som GSTP1 i prostatakreft har grundig studert [2], [5]. Imidlertid rolle Nrf2 i prostata kreft har ikke fått nok oppmerksomhet inntil nylig [10], [11].
Frølich et al. rapporterte at nedregulering av Nrf2 ser ut til å være ansvarlig for den reduserte GST uttrykk, forhøyet oksidativt stress og DNA-skade i prostata tumorigenesis i Tramp mus [11]. Vi har nylig funnet at ekspresjonen av Nrf2 samt Nrf2-målgener er gradvis nedregulert i løpet av utviklingen av prostatakreft i tramp mus [10]. Forrige analyse av elektroniske menneskelige prostata genuttrykk datasett viste at uttrykket av Nrf2 og GST [11] samt NQO1 ble gradvis avta i løpet av menneskelige prostata kreftutvikling (figur S4). Videre har det blitt rapportert at flere GST-gener er nedregulert i primær men ikke i metastatiske tumorer tramp [9]. I denne studien fant vi at uttrykket av Nrf2 og induksjon av NQO1 ble kompromittert i tumorigent Tramp C1 celler, men ikke i ikke-tumorigene TRAMP C3 celler (figur 4A). Dette undertrykkelse av Nrf2 uttrykk og Nrf2-target genet NQO1 i begge disse TRAMP cellelinjer ville utelukke at Nrf2 uttrykk ville bli berørt av SV40 transgenet, siden disse TRAMP cellelinjer ikke uttrykker SV40 transgenet [30].
DNA metylering har vært implisert i den stanse av den GSTP1 genet i human prostata cancer, og likeledes DNA-metylering stanse av flere andre gener er også implisert i TRAMP prostatatumor [5], [23], [24]. Men vises Interessant MassARRAY Kvantitativ DNA metylering Analyser (MAQMA) analyse av 5 «regionen i flere GST gener ingen signifikante forskjeller mellom normale prostata epitelceller og prostata svulst fra Landstrykeren mus [9]. Nylig, flere rapporter viser at både TRAMP og Rb – /- prostatakreft, en Rb /E2F avhengig økning av DNMT1 uttrykk og metylering aktivitet [25], [35]. Hypermethylation Nrf2 promoter ble utelukket ved hjelp av MSP og at 5-aza behandling hadde ingen virkning på Nrf2 uttrykket (med data ikke vist) [11]. Vi analyserte den 5»-flankerende region av Nrf2 gen og identifisert et CpG øy som strekker seg i posisjon -1175 (figur 1A). Ved hjelp bisulfite sekvensering, noe som ville være mer spesifikk i å identifisere CpG metylering og vil avsløre flere detaljer om DNA metylering enn MSP, fant vi at de første 5 CPGs i CpG island er hypermethylated i TRAMP prostatakreft og i tumorigent TRAMP C1 celler, men ikke i normal prostata vev og ikke-tumorigene TRAMP C3-celler (figur 1B). Bemerkelsesverdig er disse 5 CPGs ligger i tilknytning til tidligere rapportert Nrf2 promoter [17]. Således synes det metylering statusen til disse spesifikke CPGs å være korrelert med tumordannelse samt Nrf2 ekspresjon og NQO1 induksjon (figur 1 og 4). Spesielt, har lignende mønster av spesifikk metylering av det distale CpG øya også blitt observert i Keap1 genet i lungekreftceller [26]. Det er viktig å merke seg at noen av våre funn synes å være noe motstridende med resultatene rapportert tidligere [11], men tidligere funn av omfattende nedregulering av Nrf2 og GST i løpet av prostatatumorprogresjon i tramp mus [11], er i overensstemmelse med våre nåværende resultater.
for å bestemme den funksjonelle rollen metylering av disse 5 CPGs i undertrykkelsen av Nrf2 expession, ble luciferase reportere i Nrf2 arrangøren med eller uten disse 5 CPGs konstruert (figur 2A). Den Nrf2 promoteren besitter meget GC-rike ikke-kanonisk promoter som inneholder hverken TATA-boks eller en CCAAT boks [28], men dette Nrf2-promoteren aktivert potent transkripsjon av luciferase reporter-genet (figur 2B). Interessant, tilsetning av sekvenser -1065 til -1367 synes å være undertrykkende til den transkripsjonelle aktivitet av Nrf2 promoteren (figur 2B). En slik undertrykkende sekvens kunne fungere ved å rekruttere spesifikke undertrykke faktorer [36], men den eksakte mekanismen regnskap for denne undertrykkende funksjon av denne sekvens, selv i fravær av metylering ville kreve ytterligere undersøkelser. Likevel, når journalister ble metylert
in vitro
av CpG metyltransferase, luciferase reporter aktiviteten av Nrf2 arrangøren med den ekstra sekvens inneholder 5 CPGs (PGL-1367) ble redusert med ca 84%. I motsetning til dette, metylering av reporter uten den ekstra sekvensen resulterte i omtrent 23% reduksjon (figur 2B). Dette er sannsynligvis på grunn av den tunge metylering av hele konstruksjonen, inkludert luciferasegenet (men videre studier ville være nødvendig for å bevise dette). Til sammen disse resultatene tyder på at de ekstra 5 CPGs (-1065 til -1367) kan spille en avgjørende rolle i metylering avhengig undertrykkelse av Nrf2 promoter aktivitet.
Rollen CpG metylering undertrykke Nrf2 uttrykk og aktivering var testet ved behandling med 5-aza i tramp celler. 5-Aza har tidligere blitt vist å være i stand til å hindre tidlig sykdomsprogresjon forsinke androgen-uavhengig sykdom og forbedre overlevelse av mus tramp [25], [37]. I tillegg har scene og fenotype-spesifikke CpG øy metylering og DNA-metyltransferase-ekspresjon er godt dokumentert i løpet av prostatakreft progresjon i tramp mus [38], [39]. Disse publiserte funn tyder på relevansen av å bruke denne TRAMP system for å avhøre den mulige rollen epigenetiske forandringer i prostata kreftutvikling. 5-aza behandling av TRAMP C1-celler beskjedent øket mRNA-nivå av Nrf2, mens kombinerte behandlinger av 5-aza og TSA induserte en mer fremtredende økning av Nrf2 (figur 4A). Dette resultatet er i samsvar med rapporten fra Mavis et al., I hvilket kombinerte 5-aza og TSA behandlinger betydelig forbedret ekspresjon av GST-gener [9]. Proteininnholdet av Nrf2 i TRAMP C1-celler forble upåvirket av enten 5-aza-eller 5-aza /TSA-behandlinger, men tilsetningen av en potent Nrf2-aktivator TBHQ ville forbedre akkumuleringen av Nrf2 protein (figur 4B). Som ventet, viste induksjon av NQO1 mRNA og proteinnivåene en lignende trend med den for Nrf2 proteinet. Det er høyst sannsynlig at siden Nrf2 signale reguleres primært via posttranslasjonelle mekanismer, uten utfordringer med Nrf2-aktivatorer som TBHQ, ville Nrf2 protein bli raskt slått over av proteosom avhengig nedbrytning [18]. Den nøyaktige årsaken til hvorfor TBHQ er nødvendig for NQO1 induksjon ville kreve videre studier.
For ytterligere å avgrense den molekylære mekanismen som den spesifikke CpG-metylering undertrykker Nrf2 uttrykk, chip ble utført. Resultatet viser at binding av MBD2 og H3K9m3 til de spesifikke CPGs var betydelig høyere i TRAMP C1-celler enn i TRAMP C3 celler korrelerer med det faktum at CPGs ble minimalt metylert i TRAMP C3-celler (figur 3A). I motsetning til dette, viste AcH3 en motsatt bindingsmønsteret til den samme CPGs sekvensen i TRAMP C1 celler sammenlignet med TRAMP C3-celler, og likeledes bindingen av Pol II til transkripsjonsstartsetet viste tilsvarende mønster som AcH3 (figur 3A). Disse metylering avhengige sammenslutninger av corepressors kan moduleres av 5-aza og TSA behandlinger og våre resultater (figur 3B) korrelerte meget godt med transkripsjon nivået Nrf2 (mRNA nivå) i disse to cellelinjer (figur 4A). MBD2 er blitt rapportert å formidle epigenetisk stanse av 14-3-3σ i TRAMP C1-celler og humane LNCaP prostataceller [24], og er blitt vist å være involvert i den transkripsjonelle undertrykkelse av GSTP1 i MCF-7 brystkreftceller [40] . MBD2 og andre MBD proteiner binde til denaturert CPGs og rekruttere corepressor komplekser som inneholder HDACs, kromatin remodeling proteiner samt andre proteiner fører til undertrykkelse av uttrykket av hypermethylated gener [31]. Interessant, proteinnivået MBD2 var mye høyere i TRAMP C1 celler enn i TRAMP C3 celler (figur 4A), noe som tyder på en mulig felles MBD2-mediert epigenetisk undertrykkelse av Nrf2 i TRAMP C1 celler. I motsetning til dette proteinnivået AcH3 var tilsynelatende lavere i TRAMP C1-celler enn i TRAMP C3-celler, men ble øket enormt med TSA behandling (figur 4D). Siden ekspresjonen av MBD2 vil være avhengig av HDAC-aktivitet, vil våre ovenfor angitte resultater potensielt forklare kravet til HDAC-inhibitorer for effektivt å modulere corepressors binding og til maksimalt gjenopprette reexpression av Nrf2 så vel som induksjon av NQO1 i TRAMP C1-celler. I tillegg, når det undertrykkende sekvens inneholdende de ekstra 5 CPGs ble ytterligere analysert ved anvendelse av den transkripsjonelle elementer Search System (Tess, https://www.cbil.upenn.edu/tess) basert på TRANSFAC V6.0 databasen, flere transkripsjonsfaktor bindingsseter ble identifisert, inkludert bindingsseter av E2F1-p107 og NF-E2 (data ikke vist).
