Abstract
I tykktarmskreft, en svært aggressiv sykdom, progresjon gjennom ondartet sekvensen er ledsaget av stadig flere kromosomale rearrangements. Å kolon målorganer, invasive celler krysse flere vev av ulike elastisitetsmoduler. Enten bløtvev øker malignitet eller i kontrast grenser invasiv kolon celle spredning fortsatt et åpent spørsmål. Bruke polyelektrolytt flersjiktsfolier ligne microenvironments av ulike elastisitetsmoduler, avslørte vi at menneskelig SW480 tykktarmskreftceller vises økende frekvens i kromosom segregering unormalt når dyrket på substrater med avtagende stivhet. Våre resultater viser at, selv om avtagende stivhet korrelerer med økt celle letalitet, hadde en betydelig andel av SW480 kreftceller å unnslippe fra den meget myke substrater, selv når bærende unormale kromosom segregering, oppnår mitose og gjennomgå en ny syklus for replikasjon i motsetning til human colonic HCoEpiC celler som døde på myke underlag. Denne observasjonen åpner muligheten for at evnen til kreftcellene for å overvinne mangler ved kromosom segregering på myke underlag kan bidra til å øke kromosomale rearrangementer og tumorcelle aggressivitet
relasjon:. Rabineau M, Kocgozlu L, Dujardin D, Senger B, Haikel Y, Voegel JC, et al. (2013) Tilskudd av Soft Underlag til malignitet og Tumor Suppression under Colon Cancer Cell divisjon. PLoS ONE 8 (10): e78468. doi: 10,1371 /journal.pone.0078468
Redaktør: Thomas Claudepierre, Det medisinske fakultet Universitetet i Leipzig, Tyskland
mottatt: 15 april 2013; Godkjent: 13 september 2013; Publisert: 22 oktober 2013
Copyright: © 2013 Rabineau et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet av en bevilgning fra Alsace Contre le Cancer. M.R. er i gjeld til Faculté de Chirurgie dentaire av Strasbourg for økonomisk støtte. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i løpet av de siste 10 årene har det blitt tydelig at celle atferd ikke bare er avhengig av kjemiske signaler, men at mekaniske egenskapene til mobilnettet miljø spiller en like viktig rolle. Dette ble demonstrert ved spektakulært landemerket eksperimenter av Discher gruppe som viste at stamceller enten kan differensiere til osteoblaster, fibroblaster eller nerveceller avhengig av Youngs modulus av adhesjonssubstrat [1]. Det er også godt akseptert at forskjellige celletyper må substrater av forskjellige Young-moduler for å overholde riktig og sprer. Osteoblaster krever Young-moduler i området fra MPa til følge, mens fibroblaster holder seg på mykere underlag som moduler på omkring 10 kPa [2] og nerveceller vokse på ekstremt myke substrater av omtrent 1 kPa [1]. Disse karakteristiske verdier er i henhold til Young modulene som karakteriserer de vev som omgir disse forskjellige celletyper. Disse resultater er av avgjørende betydning for eksempel i tissue engineering å utforme stillaser slik at en passende vekst av celler eller i implantatet integrasjon. Likevel vedheft er ikke det eneste aspektet som preger celle atferd: celledeling er også et viktig aspekt for celle skjebne. Vår gruppe begynte nylig å undersøke innvirkningen av de mekaniske egenskapene til substratet på celledeling [3]. Disse data fremhevet at de mekaniske egenskaper av substratet spiller en kritisk rolle i kromosom segregering under mitose av epitelceller. Faktisk, observerte vi en progressiv økning av kromosomale abnormiteter segregerings med avtagende substrat stivhet i ikke-kreft rottenyreceller kenguru PtK2 [3]. Videre myke underlag (under 50 kPa) ble beskrevet som en fysisk mikro barriere nesten helt hemme PtK2 celler [3].
I løpet av de siste årene, har det blitt fastslått at vev stivhet påvirkninger tumorprogresjon og kan fremme ondartet oppførsel [4-6]. Ved innføring av cancerceller inn i tre-dimensjonale fibrin-matriser, Liu et al. viste at myke matriser av Young modulus ca 100 Pa fremmet veksten av runde kolonier med økende aggressivitet når xenopodet i immunsvikt mus [7]. Ganske nylig, Tang et al. avslørte dempningen av celle mechanosensitivity av tumorceller når det dyrkes på myke underlag [8]. I tykktarmskreft, en svært aggressiv sykdom, progresjon gjennom ondartet sekvensen er ledsaget av økende kromosomale rearrangements [9-12]. Å kolonisere målorganer, invaderende celler krysse flere vev av forskjellige elastisitetsmoduler (som eksempel, 175, 918, 320, 120 og 640 Pa for basalmembran, stroma, lymfe, lymfeknute og lever, henholdsvis) [2,4] og, mens de fleste av disse cellene dør under reisen, noen motstå og kan generere metastaser [13]. Enten bløtvev øker malignitet eller i kontrast grenser invasive celle spredning fortsatt et åpent spørsmål. Bruke polyelektrolytt multilayers filmer (PEM) [14-18], avslørte vi at menneskelig SW480 tykktarmskreftceller vises økende frekvens i kromosom segregering unormalt når dyrket på substrater med avtagende stivhet (figur 1) og [3]. I denne artikkelen rapporterer vi at substrater med stivhet på 50 kPa og lavere årsaken massiv død av mitotiske celler, men at få cellene motstå og oppnå mitose ved å overvinne unormal kromosomsegregering. For dette formål ble synkronisert SW480-celler sådd ut på en serie filmer laget av et poly-L-lysin /hyaluronsyre (PLL /HA)
24 stratum begrenset av poly (styren) sulfonat /polyallylamin (PSS /PAH)
n
lag (
n
= 0, 1 og 2, økt
n
øker underlaget stivhet [19]) og etterfulgt av levende celle bildebehandling.
Fisher Exact Test viser andelen på E
50 (18 celler med kromosomuregelmessigheter på 121 celler analysert) er vesentlig annerledes enn det på glass (6/153,
p
0,003), og andelen på E
20 (14/78) er vesentlig annerledes enn det som på glass (
p
0,001). Feilene søylene representerer 95% konfidensintervall. Diskusjon
1
Resultater og. Påvirkning av myke underlaget på svulsten mitotisk progresjon
For å finne ut om kreftcellene er i stand til å komme seg gjennom mitose på myke underlag, SW480 celler, synkronisert med mitotisk shake-off metode, ble sådd på PEM filmer med avtagende stivhet (Young moduler avtagende fra 50 ned til 0 kPa, tabell 1) og etterfulgt av levende celle bildebehandling i 2h30. Filmene var sammensatt av en (PLL /HA)
24 stratum avkortet med en andre (PSS /PAH)
n
stratum (
n
= 0, 1 og 2 ). Et typisk eksempel på konfokalt z-seksjon observasjon av en film bestående av PLL /HA stratum og PSS /PAH tildekking blir vist i figur 2. Selv om den overflatekjemi av glass og av polyelektrolytt multilayers er forskjellig, vi demonstrert i et tidligere arbeid at mengden av FBS proteiner avsatt på overflaten er avhengig hverken på overflaten kjemi heller ikke på antallet lag som utgjør polyelektrolytt multilayers filmen [16]. Videre kan celler som føler det vesentlige proteinene fra serum som adsorberes på overflaten før celleavsetning. Dermed viktigste parameter som skifter mellom glass, E0 og E50 /E20 er stivhet og det bør være på opprinnelsen til forskjellene i celle atferd observert i vårt system. På E
0, celler raskt gikk gjennom en lytisk prosess, som antydet ved frigjøring av cytoplasma i kulturmediet observert i 100% av tilfellene (figur 3A, pilspiss i rad E
0, Film S1). Men på E
50 og E
20 substrater, oppfølging av kromosom segregering, DNA decondensation og cytokinese (figur 3A og film S2-S4) viste at henholdsvis 60% og 10% av cellene var i stand til å oppnå mitose i 2h30 (figur 3C). De gjenværende cellene enten lyse (18% i E
50 og 88% i E
20) eller holdes blokkert i mitose (22% i E
50, og 2% på E
20). Tilghman et al. viste at kreftceller dyrket på myke polyakrylamid gel substrater oppviste en lengre cellesyklus, på grunn av en forlengelse av G1-fasen av cellesyklusen, i forhold til kreftceller som vokser på mer stive substrater [20]. For å demonstrere at den vesentlig del av SW480-celler i stand til å utvikle seg i mitosen på E
50 var relatert til kreft natur av disse cellene, ble deres oppførsel sammenlignet med de av de ikke-cancerøse humane kolon epitelceller HCoEpiC. Produksjon av mitotiske HCoEpiC celler ved mekanisk shakeoff ble sterkt redusert. Dermed ble standard asynkron HCoEpiC cellekulturer brukes til å undersøke påvirkning av E
50 på menneskelige colonic epitelceller. Resultatene viser at etter 6 timer av kulturen på E
50, asynchronized HCoEpiC celler tatt i bruk en rund morfologi (figur 4A) i motsetning til spredningen formen på disse celler observert på glass (figur 4A). På E
50, HCoEpiC celler gjennomgikk en lytisk prosess, som antydet ved frigjøring av cytoplasma i kulturmediet i 100% av tilfellene (figur 4A). Noen av disse cellene viste fragmentering av deres kjerne som tyder død ved apoptose (figur 4C). I samsvar med disse observasjonene, kunne ingen av mikrotubuli og aktin filamenter bli observert av immunfluorescens eksperimenter med antistoff spesifikt for α-tubulin og phalloidin (figur 4C). Alle interfase HCoEpicC cellene døde på E
50 (figur 4B) avslører at disse cellene er åpenbart ute av stand til å komme videre i cellesyklusen og å gå inn i mitose. Vi kan peke på at våre studier ble utført på underlag med Young-moduler i området 1-50 kPa, og vi har observert at ikke-kreftceller ikke kunne overleve på slike myke substrater. Dette resultatet virker ved første øyekast motstrid med observasjon av celledeling i tykktarmen som Young modulus er 2-25 kPa [21]. Likevel, i tykktarm celler i et spesialisert 3D vev med celle /cellekontakter som sterkt påvirker celle atferd. En slik virkning er ikke gjengitt i vårt 2D in vitro-eksperimenter. Likevel er vår in vitro modellen mer hensiktsmessig for enkelttumorceller eller små grupper av celler som rømmer tumormassen til å invadere stroma og engasjere seg i prosessen som førte til metastasedannelse etter en lang reise gjennom vev av svært forskjellige Unge moduler. Til sammen viser våre resultater at den minskning av stivheten samsvarer med en økning i celle dødelighet in vitro for sunne samt kreftceller. Likevel, veldig viktig, observerte vi at noen kreftceller kan flykte fra svært myke underlag og kan oppnå mitose. Disse funnene er svært relevant for både normal homeostase av solid vev og for patologiske innstillinger Architecture
E
ap (kPa).
en
Notation product: (PLL /HA)
24 ~ 0E
0 (PLL /HA)
24 – (PSS /PAH)
1 ~ 20E
20 (PLL /HA)
24 – (PSS /PAH)
2 ~ 50E
50Table 1. Tilsynelatende elastisitetsmodul (PLL /HA)
24- (PSS /PAH)
n
med
n
= 1 og 2.
filmene var sammensatt av en hyaluronsyre /poly-L-lysin (HA /PLL)
24 stratum avkortet med en andre poly (styren) sulfonat /polyallylamin-hydroklorid (PSS /PAH)
n
stratum. Filmene ble karakterisert ved deres elastisitetsmodul (
E
ap: tilsynelatende elastisitetsmodul), bestemt ved atomkraftmikroskopi nano-skår eksperimenter, som ville svare til den virkelige elastisitetsmodul av laget hvis det oppførte seg strengt elastisk. Elastisitetsmodulen av den native (PLL /HA)
24 arkitekturen er omtrent 0 kPa.
a Verdier hentet fra [19]. CSV Last ned CSV
Vertikalsnitt bilde av en (PLL /HA)
23-PLL
FITC-HA (PSS /PAH)
2-PSS
Rho-PAH flerlags film observert av CLSM.
A) etter såing av synkroniserte SW480 celler på glass, E
50, E
20 og E
0, time-lapse bilde ble tatt hvert 5 min for 2h30; representative bilder vises. Pilen angir den opprinnelige posisjon av den mitotiske celle. Sammenslåtte bilder av fluorescens (DNA i rødt) og fase kontrast (i grått); skala bar: 20 mikrometer. B) Time-lapse overvåking kromosom segregering i SW480 celler utført som beskrevet i A. Representative bilder av kromosom segregering unormalt vises for E
50 og E
20; skala bar: 10 mikrometer. C) Prosent av SW480 celler full mitose vurdert i A, bestemmes på to sammenslåtte uavhengige forsøk. Fisher Exact Test viser at andelen av celler som fullfører mitose på E
50 (46 celler på 77 celler i mitose) er betydelig mindre fra andelen på glass (185/212,
p
0,001) . Andelen på E
20 (16/161) er betydelig mindre enn det på E
50 (
p
0,001) og andelen på E
0 (0/146) er betydelig mindre enn det på E
20 (
p
0,001). D) Prosent av celler med lagging kromosomer. I C, D, de feilfelt representerer 95% konfidensintervall
A) Representative bilder av HCoEpiC celler etter 6t av kultur på glass og på E
50 indikerer pilspiss en lysert celle.; skala bar: 50 mikrometer. B) Prosent av lyserte HCoEpiC celler vurdert i A, bestemmes på to sammenslåtte uavhengige forsøk. Fisher Exact Test viser andelen av lyserte celler på glass (5/142) er betydelig mindre enn det på E
50 (112/112,
p
0,001). Feilstolpene representerer 95% konfidensintervall. C) Fluorescens bilder av DNA, α-tubulin og aktin etter 6t av kultur på E
50 fra faste HCoEpiC celler; skala bar: 20 mikrometer
2.. Opptreden av tumorceller som bærer kromosom segregering unormalt
Time-lapse overvåking kromosom segregering viste at SW480 celler sådd på E
50 og på E
20 vises henger kromosomer (figur 3B, piler) som indikerer feil i kromosomsegregeringsmekanismer. I slutten telophase, kjernene reformert og cytokinese gjennomført (figur 3B, 3D og film S5 og S6). Blant de SW480 celler som utvikler seg gjennom mitose 4,8%, 11% og 13% viste kromosom segregering abnormiteter på glass henholdsvis E
50 og E
20. Resultatene viste at til tross for økende hyppighet av misdannelser indusert av myke underlag, noen SW480 kreftceller er i stand til å komme seg gjennom mitose. Som er i samsvar med observasjonen gjort på stive substrater som celler som har mangelfulle spindel sjekkpunkt mekanismer kan fortsette gjennom mitose selv i nærvær av kromosomer misconnected til spindelen [22].
3. Den β1-inte engasjement av mitotiske tumorceller som svar på myke underlag
Interaksjon med den ekstracellulære matrise via inte har vist seg å påvirke ulike aspekter av mitotisk spindel organisasjon [23,24]. Nærmere bestemt er det velkjent at mitotiske celler blir avrundet i forberedelse for cytokinese og forbli festet til substratet via tilbaketrekk fibre via integrin inngreps [25]. Tilbaketrekkings fibre gir motstandskraft som forplanter seg innenfor mikrotubuli å orientere mitotisk spindel [23-26]. Vi dermed undersøkte effekten av ulike underlag stivhet på β1-integrin i SW480 celler. Som svar på myke underlag (E
50 og E
20), β1-integrin engasjement målt ved ligand-induserte bindingssteder (aktivert ß1-inte LIBS) med conformational-spesifikke antistoffer var uendret sammenlignet med glass substrat (figur 5A-C, den MAPK kjørefelt tilsvarer å kontrollere lasting). Interessant, disse dataene er i kontrast med en tidligere studie med ikke-tumor PtK2 celler som viser gradvis reduseres av β1-integrin engasjement på myke underlag [3]. Disse observasjoner er i overensstemmelse med andre studier som viser at murine brystcancerceller beholde høye nivåer av aktiv β1-integrin etter 24 av kultur på et mykt underlag [27]. Integrin akkumulering i celleMidtSonen er også nødvendig for å indusere mitotiske celle adhesjon og å støtte cytokinese ved å tilveiebringe mekanisk forankring for den kontraktile actomyosin ring [28]. For å undersøke lokalisering av β1-integrin, immunfluorescens utført i celler i telophase viste β1-integrin opphopning i midten av kroppen, på E
50 og på E
20, som på glass (figur 5D). På glass, E
50 og E
20 aktin akkumulert også i denne celle midtsonen (figur 5D). Disse resultatene tyder på kontinuerlig β1-integrin engasjement under mitose til tross for de myke underlag, kompatibel med involvering for å støtte cytokinese.
A) Western blot av β1-inte LIBS og MAPK protein for SW480 celler sådd 30 min post-synkronisering på glass, E
50 og E
20. Histogram viser tilsvarende skanninger fra B) β1-inte libs og C) P44 /p42 MAPK kontroll lasting. Representative resultater fra 2 uavhengige eksperimenter (de Feilstolpene representerer s.e.m .; en vilkårlig verdi på 1 ble tilskrevet den midlere verdi som svarer til cellene på glass). D) α-tubulin og β1-integrin fordeling 30 min post-synkronisering på glass, E
50 og E
20 fra faste SW480 celler, overlagring av celler med anti-α-tubulin (grønn) og anti-β1 -integrin (rød) (α-tubulin /β1-integrin). Pil indikerer en fin spiss på β1-inte konsentrert på midten av kroppen. Representative bilder vises for 2 uavhengige eksperimenter for totalt 10 celler for hver tilstand; skala bar: 10 mikrometer. På glass, E
50 og E
20 fra faste SW480-celler, overlagring av celler med DNA (blå) og aktin (rød) (DNA /aktin). Pilhode angir aktin opphopning i cellen midtsonen. Representative bilder vises for 2 uavhengige eksperimenter for totalt 10 celler for hver tilstand; skala bar: 10 mikrometer
4.. Mitotisk spindel organisering av tumorceller som respons på myke underlag
neste sjekket mitotiske spindelenheten på myke matriser ved immunofluorescens med anti-α-tubulin og DNA-farving med Hoechst. De mitosetråder av SW480 celler, synlige på stive underlag (glass), ble bevart på E
50, og selv på E
20 (Figur 6A og B). Dette resultat står i kontrast til det som ble observert for ikke-kreftceller mitotisk PtK2 seeded på myk matrise siden for Youngs modulus ≤ 50 kPa, kan den mitotiske spindel ikke observeres [3]. I samsvar med vår levende celle analyse (figur 3B og D), unormale kromosom segregering hendelser kunne observeres (figur 6B og D), men uten bevis for multipolar eller monopolare spindler på forskjellige underlag sannsynligvis på grunn av P1-integrin engasjement opprettholdes på veldig myk underlaget. Faktisk ble multipolar spindler observert for celler som bærer muterte β1-inte [23].
SW480 celler 30 min-2t post-synkronisering på glass, E
50 og E
20 fra faste celler. Bilder blir overlagret med anti-α-tubulin (hvitt) og Hoechst for DNA (rød) (α-tubulin /DNA). Pilen angir den mitotiske spindel, uten avvik (A), med uregelmessighet (B), indikerer pilhode anomalien; skala bar: 10 mikrometer. C) Prosent av SW480 celler med mitotisk spindel fra A, bestemmes på tre samle uavhengige forsøk. Fisher Exact Test viser at andelen av celler med en mitotisk spindel på E
50 (93/140) er vesentlig forskjellig fra andelen på glass (139/142,
p
0,001). Andelen på E
20 (16/50) er betydelig mindre enn det på E
50 (93/140,
p
0,001). D) Prosent av celler som bærer kromosom segregering unormalt, blant cellene med mitotisk spindel vurderes i C. I C og D, de feilfelt representerer 95% konfidensintervall.
5. Rac1 ekspresjon av tumorceller som respons på myke underlag
Rac1, proteiner av den lille GTPase Ras-familien er involvert i orientering av den mitotiske spindel og dens aktivitet øker på plasmamembranen til polare sider under cytokinese [29 ]. Vi videre synkronisert en samling av SW480 celler og analysert Rac1 uttrykk gjennom Western blot eksperimenter [29]. Det var ingen forskjell i Rac1 uttrykk for mitotiske SW480 celler seeded enten på myke underlag (E
50 og E
20) eller på stive underlag (glass) (Figur 7A-C). Våre resultater viste at mitotisk kreft SW480 celler opprett Rac1 uttrykk på myke underlag. Tvert imot vi tidligere observert at ikke-kreftceller PtK2 gradvis minsker dette uttrykket på myke underlag [3]. Viktigere, β1-integrin engasjement og Rac1 uttrykk opprettholdes på myke underlag (E
50, E
20) ikke var tilstrekkelig til å tillate massive delingen av svulst SW480 celler. Faktisk, på følgende underlag bare 60% (E
50) og 10% (E
20) av cellene er i stand til å komme videre i mitosen
A) Western blot av Rac1 og MAPK protein for SW480 celler på glass, E
50 og E
20, 30 min post-synkronisering. Histogram viser tilsvarende søker etter Rac1 (B) og for P44 /p42 MAPK (C). Representative resultater fra 2 uavhengige eksperimenter (de Feilstolpene representerer s.e.m .; en vilkårlig verdi på 1 ble tilskrevet den midlere tilsvarende celler på glass).
6. DNA replikasjon aktivitet av tumorceller i respons til myke underlag
For å avgjøre om SW480 celler som var i stand til å komme seg gjennom mitose var i stand til det gjentatte cellesyklus, undersøkte vi deres evne til å gjennomgå DNA-replikasjon 4t etter å ha blitt sådd på forskjellig underlag. SW480-celler seeded på E
50 og E
20 viser området for replikasjon jevnt fordelt i kjernen (figur 8A) med henholdsvis 60% og 23% av celler med atom BrdU-signalet (figur 8B). Det er bemerkelsesverdig at de prosenter av SW480 celler som inkorporerer BrdU korrelert med prosentandelen av celler som oppnådde mitose på E
50 og E
20 (Tall 3C og 8B), noe som tyder på at SW480 celler i stand til å fullføre kromosom segregering på myke underlag er videre i stand til å gjennomgå en ny syklus av DNA-replikasjon.
A) BrdU visualisert ved indirekte immunfluorescens av SW480 celler 4h post-synkronisering på glass, E
50 og E
20; skala bar: 10 mikrometer. B) Prosent av celler med atom BrdU fastsettes på tre samle uavhengige forsøk. Fisher Exact Test viser at andelen celler med atom BrdU E
50 (108/170) er betydelig mindre enn det på glass (400/400,
p
0,001) og andelen på E
20 (35/150) er betydelig mindre enn det på E
50 (
p
0,001). De feilfelt representerer 95% konfidensintervall.
Konklusjon
I konklusjonen, rapporterer vi at til tross for massiv celledød på ekstremt myke underlag (E
0), tumorceller som de SW480 tykktarm kreft celler, selv når bærer unormalt kromosom segregering, motstå de svært myke underlag (E
20 og E
50) og oppnå mitose. Disse funnene kan være svært relevant for patofysiologien av kreft og spredning av tykktarmskreftceller. Faktisk, deres kreft natur i det minste noen av de kreftceller kan hjelpe dem til å overvinne kromosomal segregering unormalt knyttet til endring i underlaget stivhet og dermed slippe unna de myke underlag for å forfølge sin reise opp til stedet for metastasedannelse. Videre kan denne evnen til å overvinne segregerings abnormaliteter resultere i mer kromosomale rearrangementer, som kan bidra til å øke tumorcelle aggressivitet. Videre undersøker responsen av tumorceller til fysiske miljøendringer kan bidra til å identifisere nye potensielle mål for kreftbehandling.
Materialer og metoder
1. Materialer og fabrikasjon av PEM
PLL (MW = 5,7 x 10
4 Da, Sigma, St. Quentin Fallavier, Frankrike) og HA (MW = 4,0 x 10
5 Da, BIOIBERICA, Barcelona ) ble brukt til oppbygging (PLL /HA)
24 filmer, og PSS (MW = 7,0 x 10
4 Da, Sigma, St. Quentin Falla) og PAH (MW = 7,0 x 10
4 Da , Sigma) i (PSS /PAH)
n
capping filmer (
n
tilsvarer antallet av lag par), som ble avsatt på toppen av (PLL /HA)
24 lag. PLL, HA, PSS, og PAH ble oppløst ved 1 mg /ml i en bufferoppløsning inneholdende 150 mM NaCl og 20 mM tris (hydroksymetyl) -aminometan (TRIS, Merck) ved pH 7,4, og alle skylletrinn ble utført i samme buffer. (PLL /HA)
24 lag og (PSS /PAH)
n
lokking av filmene ble utarbeidet med en dipping maskin (Dipping Robot DR3, Riegler Kirstein GmbH, Berlin, Tyskland), på objektglass (VWR Scientific, Fontenay sous Bois, Frankrike). Stivheten på (PLL /HA)
24- (PSS /PAH)
n
film øker med antall avsatt PSS /PAH lag parene (tabell 1) [19]. De korte håndnotasjoner E
0, E
20 og E
50 er for (PLL /HA)
24 (PLL /HA)
24- (PSS /PAH)
n
filmer med
n
= 0, 1 og 2, henholdsvis.
2. PEM karakterisering
CLSM observasjoner ble utført med Zeiss LSM 510 mikroskopet med x40 /1.4 oljeneddyppingsobjektivet objectif. FITC-fluorescens påvises etter eksitasjon ved 488 nm med dichroic cutoff speil 488 nm og emisjon band-pass filter 505-530 nm. Rho-fluorescens påvises etter eksitasjon ved 543 nm, dichroic speil 543 nm, og utslipp lang pass filter 585 nm.
3. Celler og synkronisering
Kolorektal adenokarsinom epitel-SW480-celler (ATCC, CCL-228) ble dyrket i RPMI-1640-medium (Invitrogen) supplert med Glutamax, 10% FBS (Invitrogen), 100 mikrogram /ml penicillin, 100 ug /mL streptomycin (Invitrogen), 0,025 U /ml insulin, 50 mg /ml hydrokortison og 1,25 mg /ml G418 holdt ved 37 ° C med 5% CO
2. Tre dager før synkronisering, ble cellene replated på 1.2×10
4 per cm
2. Celler ble synkronisert med mekanisk shakeoff. Mitotiske celler ble sentrifugert (800
g
, 7 min), resuspendert i kulturmediet, og replated på 1.2×10
4 per cm
2 på filmdrasjerte Dekk for videre analyser. Menneskelig Kolon Epitelceller (HCoEpiC, ScienCell Research Laboratories) ble dyrket på Kolon epitelcelledifferensiering Medium (CoEpiCM, ScienCell reserach Laboratories) supplert med colonic epitelial cellevekst supplement (CoEpiCGS, ScienCell Research Laboratories) og med penicillin /streptomycin løsning (P /S, ScienCell, Research Laboratories) holdt ved 37 ° C med 5% CO
2. 2 populasjonsdoblinger ble sådd på 5×10
5 per cm
2 på underlag for videre analyser.
4. Immunolabeling
Celler ble fiksert /permeabilisert i 3,7% (w /v) PFA i PBS pluss 0,1% Triton X-100 i 15 minutter og blokkert med 10% dekomplementert FBS (Invitrogen). Celler ble inkubert med β1-integrin (fortynning 1:20, Santa Cruz fulgt av rhodamin-konjugert sekundært antistoff (fortynning 1: 250, Santa Cruz), eller med anti-α-tubulin (fortynning 1: 100, Santa Cruz) etterfulgt av FITC-konjugert sekundært antistoff. (fortynning 1: 500, AnaSpec, CA) ble avslørt, og DNA med Hoechst 33258 (20 ug /ml, Sigma) For DNA-replikasjonsstudier cellene på forhånd er dyrket med BrdU (37 ° C) (01:50 , RPN 201, GE Healthcare) ble løst /permeabilisert, inkubert med anti-BrdU og DNase i 1 time ved 37 ° C (fortynning 1: 100, RNP 202, GE Healthcare), etterfulgt av TRITC-konjugert sekundært antistoff (1: 500 , AnaSpec).
5. DNA replikering
1,2 × 10
4 synkroniserte celler ble sådd per cm
2 og inkubert med BrdU (37 ° C) (1:50 ;.. RPN 201, GE Healthcare) celler ble fiksert /permeabilisert i 3,7% PFA i PBS pluss 0,5% Triton X-100 i 15 min etter vasking med PBS, cellene ble inkubert med anti-BrdU og DNase i 1 time ved 37 ° C (fortynnet 1: 100; RNP 202, GE Healthcare). Etter vaskinger med PBS, ble cellene inkubert med TRITC-konjugert sekundært antistoff (1: 500; AnaSpec).
6. Fluorescens mikros
Prøver ble montert i Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA). fluorescens bildene ble tatt med Nikon Elipse TE200 med 63 × PL APO (1,4 NA) objectif utstyrt med Nikon digitalkamera (DS-Q11MC med NIS-Elements programvare), og behandlet med ImageJ (https://rsb.info.nih.gov /ij /).
7. Levende-cell imaging
For å dele analysene ble cellene inkubert 20 min med Hoechst 33242 (0,1 mikrogram /ml, Sigma) før mekanisk shakeoff, replated på 1.2×10
4 per cm
2 på filmdrasjerte Dekk og montert i en Ludin Chamber (Life Imaging Services, Basel Sveits) ved 37 ° C, 5% CO
2, på en Leica DMIRE2 mikroskop utstyrt med en 40 × HCX PL APO PH2 (0,75 NA) objektiv og en Leica DC350FX CCD (Leica FW4000 programvare). Bilder ble kjøpt opp hvert 5 min for 2h30, ved fluorescens og fasekontrast.
8. Western Blot
Cellene ble utsådd på overflater (Nunc) ved 2 x 10
5 per cm
2 og inkubert i 30 minutter ettersynkronisering i kulturmedium ved 37 ° C. Celler ble lysert i 20 mM Tris-base, pH 8, (0,15 M NaCl, 2 mM EDTA, 1% NP-40, 10% glycerol, 1 mM natriumortovanadat inneholdende 1% protease inhibitor cocktail, Sigma). Utvinnings blandinger rystet ved 4 ° C og sentrifugert (3 minutter, 13k rpm ved 4 ° C). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved bruk av DC-proteinanalyse (Bio Rad, USA). Like mengder av de totale proteinekstrakter ble underkastet SDS-PAGE (NuPAGE, Invitrogen, Frankrike) og overført på nitrocellulosemembraner (Iblot Transfer Stack, Invitrogen, USA) blokkert i TBS T- (0,1% Tween 20, 50 mM Tris-base, pH- 7,6, 0,15 M NaCl) inneholdende 1% BSA (Euromedex, Frankrike) og probet over natten ved 4 ° C. Blottene ble inkubert i 2 timer med primært antistoff: p-integrin aktiverte LIBS, (klon B44) (fortynnet 1: 1000, Millipore), anti-Rac1 (fortynnet 1: 1000, Millipore) og P44 /p42 MAPK (fortynnet til 1: 1000, Cell Signaling, USA) ble anvendt. Blottene ble inkubert i 2 timer med HRP-konjugert anti-kanin-anti-muse-antistoffer (fortynnet 1: 2000; GE Healthcare). Band ble oppdaget ved hjelp av ECL Western blotting Analyse System kit (RNP2109, GE Healthcare). Autoradiografer ble kvantifisert med Kodak Digital Science 10 Software. Representative gjennomsnittsverdier for minst to uavhengige eksperimenter med standardfeil (fire tidspunkter per band) presenteres.
Hjelpemiddel Informasjon
Movie S1.
Movie tilsvarende figur 3A for SW480 celler på E
0.
doi: 10,1371 /journal.pone.0078468.s001 plakater (AVI)
Movie S2.
Movie tilsvarende figur 3A for SW480 celler på E
50.
doi: 10,1371 /journal.pone.0078468.s002 plakater (AVI)
Movie S3.
Movie tilsvarende figur 3A for SW480 celler på E
20.
doi: 10,1371 /journal.pone.0078468.s003 plakater (AVI)
Movie S4.
Movie tilsvarende figur 3A for SW480 celler på glass.
doi: 10,1371 /journal.pone.0078468.s004 plakater (AVI)
Movie S5.
Movie tilsvarende figur 3B for SW480 celler på E
50.
doi: 10,1371 /journal.pone.0078468.s005 plakater (AVI)
Movie S6.
Movie tilsvarende figur 3B for SW480 celler på E
20.
