Abstract
Sikt
For å undersøke den hemmende effekten av pseudolaric syre B på subkutane xenografter av human adenokarsinom i ventrikkel og de underliggende molekylære mekanismene som er involvert i sin multiresistens.
metoder
Menneskelige mage adenokarsinom SGC7901 celler og multiresistent SGC7901 /ADR-celler ble injisert inn i nakne mus for å etablere en subkutan xenograft modell. Virkningene av pseudolaric syre B med eller uten adriamycin behandling ble sammenlignet ved bestemmelse av tumorstørrelse og vekt. Cyklooksygenase-2, ble protein kinaseC-α og P-glykoprotein uttrykk nivåer bestemt av immunhistokjemi og western blot.
Resultater
Pseudolaric syre B undertrykte betydelig tumorvekst indusert av SGC7901 celler og SGC7901 /ADR celler. Kombinasjonen av pseudolaric syre B og den tradisjonelle kjemoterapi stoffet adriamycin oppviste mer potent hemmende effekter på veksten av magekreft in vivo enn behandling med enten pseudolaric syre B eller adriamycin alene. Protein ekspresjonsnivåene av cyklooksygenase-2, ble protein kinaseC-α og P-glykoprotein inhibert av pseudolaric syre B alene eller i kombinasjon med adriamycin i SGC7901 /ADR-celletransplantater.
Konklusjon
Pseudolaric syre B har en betydelig inhiberende virkning og en hemmende virkning additiv i kombinasjon med adriamycin på veksten av magekreft in vivo, noe som reverserer flermedisinresistens av mave neoplasme til cytostatika ved downregulating den Cox-2 /PKC-α /P- gp /MDR1 signalveien
Citation. Sun Q, Li Y (2014) hemmende effekt Pseudolaric Acid B på magekreft og multiresistens via Cox-2 /PKC-α /P-gp pathway. PLoS ONE ni (9): e107830. doi: 10,1371 /journal.pone.0107830
Redaktør: Soumitro Pal, Barnesykehuset i Boston Harvard Medical School, USA
mottatt: May 15, 2014; Godkjent: 20 august 2014; Publisert: 24.09.2014
Copyright: © 2014 Sun Li. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Program Foundation of Shenyang Science and Technology Bureau (1091136-9-02) Science. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mage~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er en av verdens mest vanlige krefttyper [1], og kjemoterapi er en viktig strategi mot magekreft [2]. Fordi flere kjemoterapeutiske legemidler av forskjellige klasser anvendes for å behandle magekreft, følsomheten av anticancermedikamenter til magekreft avtar gradvis, og resistens overfor mange forskjellige stoffer med forskjellige kjemiske strukturer og forskjellige virkningsmekanismer kan forekomme. Denne type motstand som kalles multiresistens (MDR) og reduserer effektiviteten av behandlingen på magekreft betydelig. MDR er blitt et stort problem for vellykket behandling av kreft [3]. Det er blitt oppdaget at den viktigste årsak til MDR i kreft er overekspresjon av P-glykoprotein (P-gp), et produkt av den menneskelige MDR1 genet. P-gp er en ATP-avhengig efflukspumpen som kan redusere narkotika opphopning i kreftceller. Det er foreslått at P-gp, en godt akseptert biomarkør av MDR, bør også betraktes som et molekylært mål i multilegemiddelresistent cancer [4]. Nylige studier har vist at i kreftceller med MDR, uttrykket nivåer av cyklooksygenase-2 (COX-2) og en isoform av protein kinaseC (PKC-α) er begge oppregulert, og deres hemming kan reversere neoplastisk MDR [5] -. [10]
Pseudolaric syre B (PAB, figur 1), en diterpene syre isolert fra roten og stammen bark av treet
Pseudolarix kaempferi
Gordon (Pinaceae), er brukt i tradisjonell kinesisk medisin for sitt brede spekter av biologiske funksjoner, for eksempel anti-sopp effekter og anti-fruktbarhet effekter. I tillegg sin anti-angiogene effekter har også blitt gradvis anerkjent de siste årene [11], [12]. Nyere studier har vist at PAB induserer veksthemming, cellesyklus og apoptose. Dessuten, PAB reverserer multimedikamentresistens av cancerceller [13], [14]. PAB undertrykker veksten av neoplastiske gastrisk AGS-cellelinje og dens induserer apoptose [15]. Vår tidligere forskning vist at PAB har også en dramatisk hemmende effekt på menneskelige mage kreft SGC7901 celler in vitro [16]. Men in vitro studier av anticancer effekten av PAB er sjeldne, og verken in vivo effekt av denne romanen urte sammensatte mot svulster eller dets nøyaktige molekylære mekanismen mot MDR er ferdig etterforsket.
Målet med denne studien er å evaluere den anti-neoplastiske effekt av PAB in vivo, inkludert reversering av MDR, ved hjelp av en xenograft modell i nakne mus og undersøke om PAB underliggende molekylære mekanisme er relatert til hemming av MDR via Cox-2 /PKC-α /P-gp veien.
Materialer og metoder
Material
RPMI-1640 dyrkningsmedium og fosterets bovint serum (FBS) for cellekultur ble kjøpt fra Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA. Kanin anti-COX-2 monoklonalt antistoff, anti-mus PKC-a og mus anti-P-gp-monoklonale antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Corporation, CA, USA. Sekundære antistoffer mot kanin og muse-antistoffer, streptavidin-peroksidase (SP) kits, og 3,3′-diaminobenzidin (DAB) ble oppnådd fra Beijing Zhongshan Biotechnology, Kina. BCA protein analysesett og SDS-PAGE gel forberedelse kits ble hentet fra Beyotime Institutt for bioteknologi, Shanghai, Kina. PAB ble kjøpt fra Liaoning Institute for Drug Control, Kina No. 201003 (renhet: 98%). Adriamycin (ADR) ble hentet fra Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd., Kina No. 120906. Tween80 og polyetylenglykol ble kjøpt fra Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA.
Cell kultur
menneske~~POS=TRUNC mage adenokarsinom SGC7901 celler ble dyrket i sentrallaboratoriet av Shengjing Hospital Affiliated til Kina Medical University [16], og adriamycin-resistente SGC7901 /ADR-celler ble begavet fra Institute of Digestive Diseases i Xijing Hospital Affiliated til fjerde Military Medical University [17]. Humant gastrisk adenokarsinom SGC7901 celler og adriamycin-resistent SGC7901 /ADR-celler ble dyrket i RPMI-1640 medium supplert med 10% FBS og antibiotika (100 U /ml penicillin og streptomycin) med 5% CO
2 i en fuktet inkubator ved 37 ° C. ADR (1 pg /ml) ble tilsatt til SGC7901 /ADR cellekulturmedium for å bidra til å opprettholde sin MDR. Celler i den logaritmiske vekstfase ble sentrifugert og fortynnet med RPMI 1640-medium for å fremstille enkeltcellesuspensjoner med en konsentrasjon på 2,5 x 10
6 /ml for såing.
Etablering av en naken mus xenograft modell
in vivo antitumor effekt av PAB ble undersøkt i en murine xenograft modell. For modellen, 4-6 uker gamle mannlige og kvinnelige immunodeficient BALB /c (nu /nu) mus, som veier 18-22 g, ble kjøpt fra Beijing HFK Bioscience Co., Ltd (Kina) og holdt i akkrediterte anlegg under standard betingelser for gnagere (SPF klasse) ved Institutt for laboratorie Animal Science. Femti-mus ble valgt og tilfeldig inndelt i to grupper (25 per gruppe). Totalt 25 mus ble subkutant injisert med 2,5 x 10
6 /ml SGC7901 celler i 0,2 ml RPMI-1640 medium inn i venstre axillae, og de andre 25 mus ble injisert med SGC7901 /ADR celler inn i høyre armhule region etter bakterie-frie forhold.
Eksperimentelle grupper og medisiner
Syv dager etter celle implantering, svulstene ble følbar (ca. 3 mm × 3 mm i diameter), og deretter de to gruppene injisert med to forskjellige typer celler ble tilfeldig delt i fem undergrupper (5 mus pr gruppe): normal saltløsning (NS) kontroll gruppe, Tween kontrollgruppen, ADR-gruppe, PAB gruppe, og PAB + ADR gruppe. For PAB-gruppene, PAB (25 mg /kg /dag i 0,1 ml) oppløst i en vandig løsning av 6% polyetylenglykol, 3% etanol og 1% Tween80 ble administrert intraperitonealt (i.p.) daglig i 20 dager [13]. Et identisk volum av vandig oppløsning eller NS ble injisert i den TWEEN kontrollgruppen eller NS kontrollgruppen, respektivt. For ADR gruppe, ADR (1,25 mg /kg i 0,1 ml) fortynnet i NS ble administrert i.p. daglig i 20 dager [18]. Tumor-bærende mus ble administrert både PAB (25 mg /kg /d) og ADR (1,25 mg /kg /dag) i.p. for samme periode i PAB + ADR gruppe. Etter behandling ble mus fra hver gruppe avlivet, og prøver av tumor bilaterale aksillære regioner ble veid og resekterte for immunhistokjemisk og western blot analyser. Denne studien ble utført strengt i samsvar med anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk i Shengjing Hospital Affiliated til Kina Medical University (Permit Number: 2013PS144K). Mus ble ofret underkant av 10% kloralhydrat anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Måling og beregning av tumorvolum og vekt
Kroppsvekt ble overvåket hver dag, og to vinkelrette diametre (lengde og bredde i millimeter) av tumorene ble målt hver to dager av målepunkter over hele behandlingsperioden. Tumorvolumene ble beregnet ved bruk av to-dimensjonale målinger, og beregnes som følger: tumorvolum (mm
3) = lengde (mm) x bredde
2 (mm) /2. Den relative tumorvolum (RTV) ble beregnet som følger: RTV = (gjennomsnittlig tumorvolum under behandling) /(midlere tumorvolum ved begynnelsen av behandlingen). Den antitumor-virkningene av PAB og /eller ADR ble beregnet med den midlere hemningsgraden (IR) av tumorvekst ved hjelp av følgende ligning: IR (%) = [(1-midlere RTV av medikament-behandlede gruppen /bety RTV av NS kontrollgruppe ) x 100] [19]. Den relative kroppsvekt av musene ble beregnet ved bruk av W
t /W
0 indeks, hvor W
t var kroppsvekten på dagen av måling, og W
0 var kroppsvekten hos den første dag av behandlingen. Den endring i kroppsvekt på dag 1 og 20, som representerer starten og slutten av forsøket, henholdsvis, ble brukt til å evaluere og analysere effektene av medikamenter på kroppsvekt [20].
Immunohistokjemisk farging for ekspresjon av Cox-2, ble PKC-a og P-gp
vevsprøver fast med paraformaldehyde, behandles rutinemessig ved å bygge inn i parafin, og deretter skiver i 4-mikrometer seksjoner. Etter hematoxylin og eosin (HE) farging, ble celler av magekreft xenotransplantater observert under et lysmikroskop. Uttrykket nivåer av Cox-2, ble PKC-α og P-gp i høstede tumorceller fastsatt ved bruk av SP-metoden. I korthet, etter å ha blitt avvokset og rehydrert, ble objektglass inkubert i 0,3% H
2o
2-oppløsning og tørket i en mikrobølgeovn i sitronsyrebuffer i 15 minutter for å hente antigener. Skivene ble blokkert med normalt geiteserum i 30 minutter ved 37 ° C og probet med et kanin-monoklonalt antistoff til Cox-2 og mus-monoklonale antistoffer mot PKC-α og P-gp ved 4 ° C over natten (alle antistoffer ble fortynnet til 1 :300). Biotinylert anti-kanin-IgG og anti-rotte-IgG ble tilsatt og inkubert ved 37 ° C i 30 minutter før enzymkonjugerte HRP-streptavidin ble tilsatt. I tillegg er 3, ble 3′-diaminobenzidin (DAB) anvendt som kromogen. Lysbilder ble kontra med hematoxylin, dehydrert i alkohol, og montert på nøytral balsam. Kontrollene ble tilberedt med kun sekundære antistoffer. Fem felt av hver del fra hver mus i hver gruppe ble valgt for bildesamling. Resultatene ble analysert og sammenlignet statistisk ved hjelp av NIS-elementer Br 3,0-programvare, og den gjennomsnittlige optiske densitet ble oppnådd for å kvantifisere uttrykket nivåer av COX-2, PKC-α og P-gp.
Western blot av Cox -2, PKC-α og P-gp i nakne mus xenotransplantater
En samlet mengde av 100 mg friskt-frosset tumorvev fra minst tre mus i hver gruppe ble veid og supplert med radio- immunutfelling analyse (RIPA) lyseringsbuffer [inneholdende 100 ug /ml fenylmetansulfonylfluorid (PMSF)]. Etter pulverisert ved hjelp av saks, ble ekstrakter homogenisert ved hjelp av ultralyd. Etter sentrifugering ved 14 000 rpm ved 4 ° C i 30 minutter, ble en supernatant prøve frosset ved -80 ° C for Western blotting. Proteinkonsentrasjonen av ekstraktene ble bestemt ved bruk av en bicinchoninic syre (BCA) protein assay kit. En samlet mengde av 100 mikrogram protein per mus i henhold denaturerende betingelser (100 ° C, 5 min) ble elektroforert ved hjelp av natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) på 8% separasjon gel og elektrooverført til PVDF-membraner ved anvendelse av en våt overføringssystem ved 100 V (Cox-2, PKC-α, β-actin til 100 min, og P-gp i 3 timer). Etter blokkering med 5% fettfri tørrmelk i 1 x TBST (Tris-bufret saltvann inneholdende 0,1% Tween 20) i 90 min, ble membranene deretter inkubert med det primære antistoff [kanin-monoklonalt antistoff til Cox-2 (1:400) eller mus monoklonale antistoffer mot PKC-α (1:200) og P-gp (1:200), med β-actin som en intern kontroll for protein lasting] natten ved 4 ° C. Antistoffet binding ble visualisert ved anvendelse av en peroksidase-koblet sekundært geite-anti-kanin-antistoff (1:2000) og geit anti-mus antistoff (1:2000) i 1,5 timer ved romtemperatur. Deretter ble membranene visualisert ved forsterket kjemiluminescens (ECL) reagens. Resultatene ble analysert ved bruk av bilde J programvare.
Statistisk analyse
Alle data er presentert som middelverdier ± standardavvik, og multiple sammenligninger mellom hvilke som helst to av de behandlede grupper ble evaluert ved en- veis ANOVA, ved hjelp av SNK og LSD metoder med SPSS 17,0 programvare. Forholdet mellom kroppsvektendring og tumorvolum ble analysert med Pearson korrelasjonsanalyse. p-verdier mindre enn 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant.
Resultater
Hemmende effekt av PAB på veksten av menneskelig magekreft
Svulster i alle behandlede grupper dannet lett etter implantasjon av enkeltcellesuspensjoner, og dannelseshastigheten var 100%. Når xenotransplantater ble tydelig, var det ingen signifikante forskjeller i det gjennomsnittlige volum av xenotransplantater blant de forskjellige gruppene (Tabell 1), og tumorvolumene ble overvåket ved forskjellige tidspunkter i alle grupper. Kurvene på tumorvekst av de to cellelinjene ble fremstilt grafisk (figur 2A, 2B). Som vist i tabell 1, for SGC7901 celle-behandlede gruppene ble det ikke observert noen signifikant forskjell mellom PAB-gruppen og ADR-gruppe i de gjennomsnittlige relative volumer av xenotransplantater (p 0,05), og IR var 56,4% og 59,0%, henholdsvis. Tilsetningen av ADR til PAB resulterte i høyere antitumoraktivitet enn for PAB alene eller ADR alene (p 0,05) med en IR på 88,1%. Den inhiberende effekt av PAB-gruppen var sterkere sammenlignet med den til ADR gruppe på xenotransplantater av SGC7901 /ADR-celler, og IR-verdiene var 64,1% og 21,9%, henholdsvis (p 0,05). Tumorvekst-hemming ble mer tydelig i mus behandlet med PAB kombinert med ADR, med en IR på 85,8%. Resultatene av tumorvekten i forskjellige grupper ytterligere understøttet våre resultater med hensyn til volumet av muse-xenografter. Figur 2C og 2D viser endringer av den relative kroppsvekt av musene i ti grupper. Kroppsvekt var lik mellom kontrollgruppene og PAB-behandlede grupper. Men redusert kroppsvekt i kombinasjon behandlede grupper og ADR-grupper, og nedgangen av ADR gruppene var mer tydelig (p 0,05). Videre Figur 3 gir en direkte sammenligning av tumor størrelsene av SGC7901 celler og SGC7901 /ADR-celler i de forskjellige grupper. Forholdet mellom kroppsvektendring og tumorvolum var ikke signifikant (p 0,05). Dosene undersøkt ble godt tolerert av mus, og ingen dyr letalitet ble observert under forsøket
A:. Vekstkurve av SGC7901 celle xenotransplantater B: vekstkurve av SGC7901 /ADR-celler xenoimplantater C: relativ kroppsvektendring av mus med SGC7901 celletransplantater D: relative kroppsvektendring hos mus med SGC7901 /ADR celle xenografter. SGC7901 celler og SGC7901 /ADR-celler (2,5 x 10
6 /ml) ble injisert subkutant i aksillære områder i nakne mus, og da åpenbare tumorer ble observert, fikk musene en daglig dose på 25 mg /kg pseudolaric syre B og /eller 1,25 mg /kg adriamycin eller normal saltløsning (kontroll) /tween-løsning (kontroll) (n = 5 pr gruppe). Tumorvolumene ble overvåket ved ulike tidspunkt (Dag 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19). IR av tumorvekst i de medikamentbehandlede grupper ble sammenlignet med den i kontrollgrupper ved slutten av forsøket ved en-veis ANOVA. *
p
0,05 vs kontrollgruppe
A:. Isolerte svulster SGC7901 celler (over) og SGC7901 /ADR celler (nedenfor) B: subkutane xenografter av SGC7901 cellelinje i nakne mus C: subkutane transplantater i SGC7901 /ADR-cellelinjen i nakne mus. (Gruppe 1): NS kontrollgruppe (gruppe 2): Tween kontrollgruppe (gruppe 3): ADR gruppe (gruppe 4): PAB gruppe (gruppe 5): PAB + ADR gruppe
immunhistokjemisk farging for ekspresjon av COX-2, PKC-α og P-gp
Alle tumorer i hver gruppe, via immunhistokjemisk farging, viste positiv ekspresjon av COX-2, PKC-α og P- gp proteiner. Cox-2 og PKC-α ekspresjon ble definert som positiv dersom farget region av tumorcellene var i cytoplasmaet, og P-gp-farging ble vurdert som positive hvis farging ble observert i membranen og cytoplasma. Proteinene ble farget gul eller brun henhold optisk mikroskop observasjon (figur 4). For SGC7901 /ADR-cellelinjen, fargingen av disse proteinene i kontrollgruppene var sterkere enn i de andre gruppene (p 0,05). PAB behandling reduserte intracellulære farging av Cox-2, PKC-α og P-gp sammenlignet med ADR-behandlede gruppen (p 0,05). Etter PAB og ADR behandling, den intracellulære farging av disse proteinene var sparser og svakere sammenlignet med de andre gruppene. For xenotransplantater i de to NS kontrollgruppene, farging av P-gp i SGC7901 cellene var betydelig lavere enn den for SGC7901 /ADR-celler (p 0,05). Analysen av fargeintensitet av Cox-2, PKC-α og P-gp ekspresjon viste de samme resultater (tabell 2)
A:. Ekspresjon av COX-2 i mus xenotransplantater B: ekspresjon av PKC- α i mus xenografter C: uttrykk for P-gp i mus xenografter D: negativ kontroll E: xenograft av HE F: normal mage vev av HE. Vev ble fikset, forankret, montert og farget av SP-metoden eller HE farging ved hjelp av standard prosedyrer. Scale bar, 25 mikrometer.
Effekt av PAB på Cox-2, PKC-α, og P-gp uttrykk i mus xenografter
For å belyse den molekylære mekanismen involvert i reverserings virkningene av PAB på SGC7901 /ADR xenograft in vivo ekspresjon av COX-2, PKC-α, og P-gp i tumorer fra forskjellige reagens-behandlede grupper ble bestemt ved western blot-analyse. Som vist i figur 5, for NS-kontrollgruppen, ble uttrykket nivåer av COX-2, PKC-α, og P-gp i SGC7901 celle xenotransplantater lavere sammenlignet enn de i de SGC7901 /ADR celletumorer (p 0,05) . For tumorer i SGC7901 /ADR-celler, uttrykket nivåer av de tre proteinene av interesse i NS kontrollgruppen og Tween kontrollgruppen var signifikant høyere sammenlignet med de andre gruppene (p 0,05), og det var ingen signifikant forskjell mellom to gruppene (p 0,05). Uttrykket nivåer av COX-2, PKC-α, og P-gp i PAB-behandlede gruppen var signifikant lavere sammenlignet med de av ADR-behandlede gruppen (p 0,05). Ekspresjonen av β-aktin ble benyttet som en intern kontroll, og uttrykket nivåer av COX-2, PKC-α, og P-gp ble redusert sekvensielt mellom kontrollgruppene, ADR-gruppe, PAB gruppe og PAB + ADR gruppe (p 0,05 vs kontrollgruppe
Diskusjoner
PAB er en av de viktigste biologisk aktive komponenter i roten bark av medisinsk plante
Pseudolarix kaempferi Hotell og viser betydelig cytotoksisitet mot flere kreftcellelinjer. In vitro studier har også vist at det reverserer MDR av carcinoma ved å hemme overekspresjon av P-gp uten åpenbare bivirkninger [13], [15], [20], [21]. Det er også blitt vist at PAB har en antitumoreffekt i mus har blitt rapportert xenograft-modeller av human kolonkreft og leverkreft [13], [20], og ingen kjente bivirkninger av PAB på dyr. Vår tidligere studie viste at PAB har en sterk hemmende effekt på SGC7901 cellelinje in vitro og induserer apoptose av magecancerceller via caspase veien [16]. Vår nåværende in vivo studien gir ytterligere bevis på at PAB er beskyttende mot mage svulster i murine xenograft modeller using SGC7901 celler og SGC7901 /ADR celler. Våre foreløpige forsøk har vist at PAB ved 25 mg /kg ikke bare hemmer veksten av magekreft, men er også godt tolerert av mus. Videre har vi inkludert den Tween kontrollgruppen for å utelukke påvirkning av den vandige løsning som ble brukt for å oppløse PAB på tumorer [13]. For sensitive celler, de kreft effekter av PAB ingen signifikante forskjeller sammenlignet med ADR, en tradisjonell kjemoterapi narkotika. I tillegg er PAB en biologisk aktiv forbindelse som utøves dens reversering virkning mot SGC7901 /ADR-cellelinje tumorer ved å målrette den signalveien aktiveres av P-gp overekspresjon in vivo.
P-gp er et 170-kDa membran protein som fungerer som et medikament efflux pumpe, noe som resulterer i en kontinuerlig defekt i den intracellulære akkumuleringen av medikamenter [22]. Den multiresistens fenotype er den viktigste årsaken til tumor kjemoterapi svikt, og er hovedsakelig et produkt av overekspresjon av P-gp i de fleste kreftformer, inkludert gastrisk neoplasmer [23]. Videre kan inhibering av denne reaksjonsveien være en måte for å reversere MDR av magekreftceller [3], [24].
Cox-2, et induserbart enzym som katalyserer omdannelsen av arachidonsyre til prostanoider ( PG) og deltar i flere fysiologiske og patologiske hendelser, er indusert av forskjellige inflammatoriske og mitogene stimuli [25]. En sterk assosiasjon mellom MDR og overekspresjon av Cox-2 har blitt rapportert i mange forskjellige typer av tumorer. Disse tidligere resultater antyder at Cox-2 modulerer ekspresjon og aktivitet av P-gp og er involvert i utviklingen av MDR-fenotypen [26] – [28]. Videre har samlet seg bevis vist at COX-2-inhibitorer er i stand til å sensibilisere kreftceller for den anti-proliferative effekt av kjemoterapeutiske midler ved å endre aktiviteten av ATP-bindende kassett protein. COX-2-hemmere kan til og med reversere MDR ved blokkering av Cox-2-mediert økning i MDR1 ekspresjon og aktivitet i kreft, både in vitro og in vivo [6], [7], [29]. Derfor hypoteser vi at Cox-2 kan regulere uttrykket av P-gp i tumorvev og at hemme denne veien er av stor betydning for å snu motstanden av kreft til cellegifter.
Vi fant ut at for SGC7901 /ADR celle svulster, uttrykket nivåer av Cox-2 og P-gp i NS kontrollgruppen var tydeligvis høyere enn for de xenografter av SGC7901 celler. Etter injeksjonen av PAB, ble det observert en tydelig nedgang i disse ekspresjonsnivåer. Imidlertid ADR var mindre effektiv for undertrykkelse av Cox-2 og P-gp ekspresjonsnivåer av det SGC7901 /ADR-celletransplantater, og når kombinert med PAB, ble det observert et lavere nivå av proteiner. Således foreslo vi at modulering av Cox-2-ekspresjon ved PAB kunne redusere ekspresjon og aktivitet av P-gp, hemme vekst og induserer apoptose, i tillegg til å fungere samvirkende med ADR i undertrykkelse av medikamentresistente svulster, og til og med reversering av MDR-fenotypen av magekreft.
PKC er en serin /treonin kinase som er involvert i signaltransduksjon som er nødvendig for cellulær proliferasjon og differensiering [30]. Av PKC isoformer, er overekspresjon og økt aktivitet av PKC-α mest nært forbundet med reguleringen av MDR-fenotypen i human magekreft [31]. Resultatene som presenteres her støtter forestillingen om at PKC-α phosphorylates P-gp, modulerer P-gp effluks funksjon, og til slutt fører til resistens [32]. Inhiberingen av PKC-α med en spesifikk hemmer eller banket ned PKC-α med siRNA fører til redusert MDR1 uttrykk, økt toksisitet av legemidler mot kreft, og reversert MDR [8] – [10]. Derfor spekulere vi at en PKC-α signaltransduksjon system kan spille en rolle ved modulering av MDR1 ekspresjon i magekreft.
Under normale omstendigheter, er PKC inaktiv i celler, og dens aktivering er relatert til oppstrøms PGE aktivering. COX-2 er koplet til membranassosiert prostaglandin E2-syntase (MPGES-1), og syntese av PGE mediert av disse proteiner øker og aktiverer den nedstrøms PKC-α veien [33]. Det har blitt vist at selektiv COX-2 inhibering av bestemte inhibitorer eller siRNA har en terapeutisk effekt på inhibering av ekspresjonen av PKC-α og P-gp, samtidig som, på samme tid, å reversere MDR [26], [34]. En studie har vist at PGE2 formidler induksjon av MDR1 uttrykk via PKC vei [35]. Resultatene av forsøkene viste at PAB kan hemme PKC-α ekspresjon av xenografter av SGC7901 /ADR-cellelinjen, kan effekten av som var sterkere enn den for ADR. I tillegg, når PAB ble kombinert med ADR, PKC-α uttrykk inhibering effekt var enda sterkere. Variasjonen tendens PKC-α uttrykk er konsistent med at av Cox-2 og P-gp i ulike reagenvolumer behandlede grupper av multiresistent SGC7901 /ADR svulster. Det har vist seg at PAB induserer vekststans og apoptose via inhibering av COX-2-reaksjonsvei i kreftceller [20], [21]. Vi hypotese at PAB hemmer ekspresjon av COX-2 i SGC7901 /ADR celler xenografter, og at koplingen mellom COX-2 og MPGES-1 reduserer syntesen av PGE, noe som reduserer aktivering av PKC nedstrøms-α. Som fosforyleringen av P-gp hemmes, er flere legemidler akkumuleres i kreftceller, den toksisitet av ADR er forbedret og MDR er reversert. Disse resultatene gir innblikk i en ny strategi som innebærer bruk av PAB å hemme MDR av menneskelige mage kreft.
En fokus for vårt eksperiment er hemmende effekt pseudolaric syre B på subkutane xenografter av human adenokarsinom i ventrikkel og sammenligningen av anti-tumor effekter av narkotika mellom ulike behandlingsgruppene. Videre er det karakteristisk for SGC7901 celler og SGC7901 /ADR-celler er forskjellige. Gjennom to pre-eksperiment, og en formell eksperiment fant vi alle tumorvolumet av SGC7901 /ADR-celler var ikke større enn for SGC7901 celler. Vi hypotese tumorvolumet kan være assosiert med celletall, veksttid, karakteristisk for celler og andre typer faktorer. Derfor har vi ikke sammentumorvolumet mellom SGC7901 celletransplantater og SGC7901 /ADR celle xenografter. I tillegg spekulerer vi at kroppsvekten endring av mus kan være i hovedsak knyttet til toksisitet av narkotika, og har ikke signifikant sammenheng til tumorvolumet i vårt eksperiment.
Den andre fokus for vårt eksperiment er den underliggende molekylære mekanismer som er involvert i multimedikamentresistens. Dermed har vi kun laget NS kontrollgruppe på SGC7901 celle xenografter til kontrast og bekreft uttrykk for de tre typer protein fra SGC7901 /ADR celletransplantater er faktisk betydelig høyere enn fra SGC7901 celle xenografter. Dessuten, ettersom responsen av SGC7901 celler til kreftmedisiner er noe mer følsom enn SGC7901 /ADR-celler i både basiske og kliniske forsøk, hvordan man kan forbedre følsomheten av flermedisinresistens celler til kreftmedisiner er vår forskning fokus. Derfor har vi ikke sammenlignet uttrykk for Cox-2, PKC-α og P-gp for svulster fra SGC7901 og ulike behandlinger av denne gruppen unntatt NS kontrollgruppe av western blot og immunhistokjemisk farging.
vår studie oppdaget at urte diterpenoid PAB ikke bare undertrykte betydelig magekreft SGC7901 celler in vivo, men også vises åpen hemmende effekt mot svulster i multiresistent SGC7901 /ADR celler. Videre kan en kombinasjon av PAB med ADR hemme veksten av magekreft og utvikling av transplantater i nakne mus. Det er verdt å nevne at som en type tradisjonell kinesisk medisin, er effekten av PAB på kroppsvekten til nakne mus var ganske lavere enn for ADR i våre forsøk, noe som er en åpenbar fordel som gjør PAB en sikrere og mer tålelig medikament for kreftterapi. PAB kan ikke bare være en ny effektiv medikament for inhibering av veksten av magekreft og reverserings dens MDR, men det kan også brukes som et utmerket hjelpestoff sammen med tradisjonelle kjemoterapeutika og kirurgisk behandling etter videre utvikling og forskning.
i den foreliggende undersøkelse har vi undersøkt, for første gang, den hemmende effekten av PAB mot human magekreft og dens reversering virkning på MDR in vivo via en xenograft nakne mus-modellen. Vi har fastslått at dens inhibering av MDR ble mediert gjennom Cox-2 /PKC-α /P-gp veien, noe som gir en teoretisk basis avgjørende om de molekylære mekanismer for magekreft terapi. Vi har imidlertid ikke studert MDR mekanisme i forhold til genekspresjon og regulering. Når de molekylære mekanismer for å reversere MDR er usedvanlig kompliserte og flere typer av proteiner, gener og faktorer som kan være involvert, kan løkken som vi har foreslått å være bare en del av mekanismen for å reversere MDR. Mer detaljert og konkrete reguleringsmekanismer må belyses i fremtidige studier.
I konklusjonen, PAB har en signifikant hemmende effekt på magekreft in vivo og kan reversere MDR av magekreft til kjemoterapi narkotika. Mekanismen mot MDR er mediert i det minste delvis gjennom Cox-2 /PKC-α /P-gp pathway. Vår studie gir store muligheter for fremtidige undersøkelser av PAB i mage kreftbehandling.
Hjelpemiddel Informasjon
Sjekkliste S1.
