Abstract
Menneskelig småcellet lungekreft (SCLC) er svært aggressive, og raskt utvikler resistens mot behandlingen . SCLC cellene er vanligvis ufølsomme for glukokortikoider grunn av svekket glukokortikoid reseptor (GR) uttrykk. Dette er viktig som vi tidligere har vist at uttrykk for en GR transgenet induserer celledød
in vitro
, og hemmer tumorvekst
in vivo
. Men den underliggende mekanisme for tap av GR uttrykk er ukjent. Den SCLC-cellelinjen, DMS79, har lav GR ekspresjon, sammenlignet med ikke-SCLC-cellelinjer og normale bronkiale epitelceller. Retroviral GR ekspresjon i DMS79 celler forårsaket aktivering av apoptotiske reaksjonsvei som vist ved markert induksjon av caspase-3 aktivitet. Metylering analyse av GR arrangøren avdekket noen metylering i 1D og 1E arrangører av GR-genet, men den allestedsnærværende konstitutivt aktiv 1C arrangøren var tungt denaturert. I 1C-promotoren var det en svært signifikant økning i DNA-metylering i et panel av 14 humane SCLC-cellelinjer sammenlignet med en blandet panel av GR uttrykke, og ikke-uttrykkende cellelinjer, og for å perifere mononukleære blodceller. Videre, innenfor panel av SCLC-cellelinjer var det en signifikant negativ korrelasjon mellom sett metylering av 1C-promoteren, og GR proteinekspresjon. Tilbakeføring av GR genet metylering med DNA metyltransferase hemming forårsaket økt GR mRNA og protein uttrykk i SCLC men ikke non-SCLC celler. Dette resulterte i økt følsomhet Gc, redusert Bcl-2-ekspresjon og økt caspase-3 aktivitet i SCLC-celler. Disse dataene tyder på at DNA-metylering avtar GR-genekspresjon i humane SCLC-celler, på en lignende måte som for konvensjonelle tumorsuppressorgener
relasjon:. Kay P, Schlossmacher G, L Matthews, Sommer P, Singh D, hvit A, et al. (2011) Tap av glukokortikoidreseptorer Expression av DNA Metylering Hindrer Glukokortikoid apoptose i Human-småcellet lungekreft celler. PLoS ONE 6 (10): e24839. doi: 10,1371 /journal.pone.0024839
Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center i Dallas, USA
mottatt: 22 desember 2010; Godkjent: 22 august 2011; Publisert: 03.10.2011
Copyright: © 2011 Kay et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NIHR Manchester Biomedical Research Centre og University of Manchester Alumni forening. PK og GS har mottatt en BBSRC student award (https://www.bbsrc.ac.uk). GS har også en Barbara Mawer utrustet student. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
endringer i epigenetisk status av gener som er viktige i mange menneskelige sykdommer, men spesielt i kreft [1]. Noen av disse er mediert av endringer i uttrykk og aktivitet av DNA metyltransferaser, DMNT1, DNMT3A og DNMT3B [2], [3]. Kreftceller karakteristisk har hypermethylated CpG øyer forbundet med tumorsuppressorgener [1], og DNMT1 er rapportert å være over-uttrykt i lungekreftpasienter som røyker [4]. Nyere studier har identifisert at en tobakksrøyk karsinogen, nitrosamin 4- (methylnitrosamino) -1- (3-pyridyl) 1-butanon (også kjent som nikotin avledet nitrosamin keton, NNK) ikke bare induserer genmutasjoner, men øker også hypermethylation av multippel tumorsuppressorgen promotere innbefattet cyklinavhengig kinase inhibitor 2A (p16INK4a), død assosiert proteinkinase 1 (dapk1), og retinsyrereseptor b (RaRb) [4]. Røyking er hovedrisikofaktoren for human småcellet lungekarsinom, og røyking er i seg selv forbundet med metylering av mer enn 20 tumorsuppressorgener [5], [6].
Mange faktorer kan påvirke følsomhet glukokortikoid, inkludert genetiske variasjon i GR-gen locus, og ekspresjon av interagerende proteiner [7] – [10]. Vi har tidligere vist at humane SCLC-cellelinjer er resistent mot glukokortikoid (Gc) hormoner og legemidler, og at denne motstanden er på grunn av nedsatt GR uttrykk [11], [12]. Restaurering av GR ekspresjon i cellene ved transfeksjon, transduksjon eller viral er tilstrekkelig til å gjenopprette Gc følsomhet [12]. Men enda viktigere, restaurering av GR uttrykk er også tilstrekkelig til å indusere apoptose av SCLC-celler både in vitro [13], og også i en xenograft modell [14]. Dette øker muligheten for at GR er en roman tumor suppressor genet for SCLC, og at tap av GR uttrykk er innblandet i SCLC patogenesen.
GR-genet (NR3C1) er en allestedsnærværende uttrykt, ligand aktivert transkripsjonsfaktor, en medlem av den nukleære reseptor super. Det er en enkelt kopi gen på kromosom 5, men dens struktur er komplisert, og forholdsvis lite er kjent om hvordan transkripsjon reguleres fra det [15]. Transkripsjonen er kontrollert av 9 promotorer, som hver er knyttet til en alternativ transkripsjonsstartsetet. Sju av disse arrangørene er gruppert sammen i en CpG island, en felles trekk ved husholdningsgener [16]. Alle transkripsjoner generere ekte full-lengde GR protein som oversettelsen start området ligger i den felles ekson 2.
GR aktiveres ved GC hormoner fra binyrebarken, under streng kontroll av hypothalamus-hypofyse-binyre (HPA) aksen. Denne aksen er under feedback kontroll på hippocampus og hypothalamus gjennom aktivering av GR protein uttrykt i disse områdene. Variasjon i rotte HPA-aksen tone har blitt tilskrevet endringer i hippocampus GR uttrykk, regulert av endrede metylering av rotte GR ekson 1-7 promoter [17]. Denne er plassert, som i den menneskelige, i oppstrøms CpG øya. Nyere studier har undersøkt metylering status fra et antall av alternative humane GR promotorer i perifere mononukleære blodceller [16]. Disse studiene har avdekket omfattende, og variabel metylering.
hippocampus og hypothalamus GR spiller en nøkkelrolle i den negative tilbakemeldinger kontroll av hypothalamus-hypofyse-binyre-aksen. Altered GR uttrykk i hjernen fører til re-innstilling av tonen i denne nevroendokrin aksen og dette er forbundet med endret metylering av nervevekstfaktor induserbar-A (NGFI-A, eller KROX, EGR1) bindingssetet i rotte ekson 1,7 promoter , homolog til det humane ekson 1F-promotoren [17] – [19]. Dette metylering kontrollert endring i GR uttrykk gir konsekvenser for hele organismen, ved å regulere adrenal glukokortikoid produksjon.
I denne studien undersøkte vi mønsteret av GR promoter metylering i humane SCLC celler, og viste at reversering av metyl merker økt GR protein uttrykk og funksjon. Videre identifiserte vi en negativ sammenheng mellom GR 1C promoter metylering og GR protein uttrykk over et panel av humane SCLC cellelinjer, og menneskekontrollceller.
Materialer og metoder
Cell Kultur og vedlikehold
A549 human lunge epithelial carcinoma celler, HEK-293 humane embryonale nyreceller, HeLa menneskelige livmorhalskreft celler og U20S menneskelig osteosarkom celler (European Collection of Cell Cultures, Wiltshire, UK) var alle dyrket i DMEM (Invitrogen) supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS) (Invitrogen).
ikke-småcellet lungekreft linjer NCI-H358 og -H727 (European Innsamling av cellekulturer, Wiltshire, UK) og NCI-H23, -H441 , -H1299 (American Type Culture Collection, USA) ble dyrket i RPMI 1640-medium (Invitrogen) supplert med 10% FCS og 10 mM HEPES som anbefalt av leverandøren.
småcellet lungekreft (SCLC) cellelinjer benyttet i denne studien var 10’COR «cellelinjer Cor L24, Cor L27, Cor L31, Cor L32, Cor L42, Cor L47, Cor l51, Cor L88, Cor L99 og Cor L103. Også brukt var DMS 79, DMS 153, HC12 og HX 148. Alle disse cellelinjer ble avledet fra pasienter med patologisk bekreftet SCLC [20], [21] med unntak av Cor L32, som ble avledet fra en pasient med dårlig differensiert plateepitel karsinom i lungene. Denne cellelinje har imidlertid oppvise de samme egenskapene av SCLC [21]. Alle SCLC-cellelinjer ble dyrket i RPMI 1640-medium (Invitrogen) supplementert med 10% FCS og 10 mM HEPES, som tidligere beskrevet [12].
Humane perifere blodmononukleære celler ble erholdt fra friske donorer lokale, ifølge lREC godkjenning 09 /H1013 /6.
Normal menneskelig bronkialepitelet ble høstet fra lunge reseksjon prøver etter operasjon for lungekreft, med full, informerte pasienten samtykke.
behandlinger
der det er hensiktsmessig, ble cellene behandlet med bærer eller 100 nM deksametason (Sigma-Aldrich) i 24 timer ved 37 ° C, 5% C0
2 før lysis. I enkelte eksperimenter ble celler inkubert med bærer eller 5 uM 5’Azadeoxycytidine (Sigma-Aldrich) i 72 timer eller 5 dager. Etter behandling med 5’Azadeoxycytidine noen celler ble behandlet i ytterligere 72 timer med 100 nM deksametason.
immunoblotanalyse
Celler ble lysert ved hjelp av 1 x RIPA buffer (100 mM Tris base, 150 mM NaCl, 1% Igepal, 2,5% natriumdeoksykolat, 1 mM EDTA) .Denne buffer også inneholdt protease-inhibitorer (Roche). Etter sentrifugering i 30 minutter ved 10 000
g
supernatanter ble høstet og analysert for proteininnhold ved hjelp av en Bradford-analyse (Bio-Rad). Prøvene ble så fortynnet i ladningsbuffer [0,125 M TrisCl (pH 6,8), 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS), 20% glycerol, 0,2% β-merkaptoetanol, 0,001% bromfenolblått]. Celleekstrakter (50 ug) ble deretter analysert ved SDS-PAGE og Western-blotting som beskrevet [22], [23]. Primære antistoffer ble brukt var mus monoklonalt anti-HGR (klon 41, 1:2500), som binder i det N-terminale område av GR (BD Biosciences), kanin-polyklonalt anti-HGR (P-20, 1:500) frembrakt mot en peptidkartlegging ved C-terminalen av GRα (Santa Cruz) og mus-monoklonale α-tubulin (1:5000) (Sigma-Aldrich). Sekundære antistoffer som ble benyttet var den pepperrot-peroksidase-konjugert anti-mus (1:5000) og anti-kanin (1:5000) (GE Healthcare). For å kvantifisere protein nivåer, ble densitometrisk analyse utført. Blotter ble skannet og densitometry av hvert band ble analysert ved hjelp ImageJ programvare. Den interne lastekontroll (αTubulin) var også tallfestet, og resultatene ble normalisert mot disse målingene. Denne analysen ble utført på 3 separate blotter for hvert forsøk og gjennomsnittlig beregnet.
reportergenet Analyser
Celler ble ko-transfektert med to mikrogram av en tat3-luciferase konstruere [13] og 0,5 mikrogram av en pCMV-
Renilla
Luciferase konstruksjon (for å korrigere for transfeksjon effektivitet) ved hjelp Fugene 6 (Roche). I noen tilfeller ble cellene også transfektert med 1 ug av et GR ekspresjonsvektor (pFUNC1-GR-EYFP) [13]. Celler ble behandlet med dex som beskrevet før luciferase-analyser ble utført ved anvendelse av den doble luciferase reporter Assay System (Promega), som beskrevet tidligere [8].
retrovirale infeksjoner
pFUNC1-EYFP eller pFUNC1 -GR-EYFP ble transfektert inn HEK293 for retroviral produksjon ved hjelp Fugene HD (Roche, UK), som transfeksjon reagens på en 03:02 reagent:DNA forhold. Infeksjon av retroviruspartikler i DMS 79 celler ble utført som beskrevet før. Etter infeksjon, ble cellene dyrket i normale vekstmedia inneholdende serum i 72 timer.
spaltet caspase-3-assay
DMS 79 celler som uttrykker GR-EYFP eller EYFP ble påført på poly-L-lysin belagt dekkglass og festes med 4% formaldehyd. Celler ble permeabilized med PBS /0,2% Triton × 100. Etter vasking ble cellene blokkert i PBS /0,1% Tween-20 + 5% serum esel. Anti-ACTIVE Caspase-3-Pab (Promega, UK) fortynnet 1:250 i blokkeringsbuffer ble tilsatt til cellene og inkubert over natten. Sekundære antistoff inkubasjon ble utført i mørket ved hjelp av Alexa Fluor 546 esel-anti-kanin IgG (Invitrogen, UK) fortynnet 1:500 i PBS. Dekkglass ble montert ved hjelp forlenge gull med DAPI (Invitrogen, UK).
Bilder ble samlet på et Olympus BX51 oppreist mikroskop ved hjelp av en 60 × /1,40 UPlanApo objektiv og tatt med en Coolsnap ES kamera (fotometriske) gjennom MetaVue programvare (Molecular Devices). Spesifikke båndpassfiltersett for DAPI, FITC og Texas rød ble brukt for å hindre blø gjennom fra en kanal til den neste. Bilder ble behandlet og analysert ved hjelp ImageJ (https://rsb.info.nih.gov/ij).
natriumbisulfitt Sekvense
Genomisk DNA ble ekstrahert fra flere av cellelinjer som brukes i denne studien, hvorav noen var blitt behandlet med 5 «Azadeoxycytidine (se resultater) ved hjelp av DNeasy blod og vev kit (Qiagen). Renset genomisk DNA ble så bisulfitt omregnet til Epitect bisulfitt Kit (Qiagen). Det konverterte DNA ble deretter anvendt som et templat i PCR-reaksjon for å amplifisere spesifikke GR promotorområdene. GR promotorområdene forsterket (og primerene anvendt) var som følger:
Promoter
1C (forover- 5′-AGGTGGATCCGGAAGGAGGTAGYGAGAAAAGAAATT-3 «, 5′-reverse AGGTGAATTCACACRAACTCRCAAAATAAAAAAAA-3»).
Arrangøren
1D (fremtids 5′-AGGTGGATCCTTTTATAAAAATTTTTTTGGTTGAGG-3 «; reverse 5’AGGTGAATTCCCCCCTACTCTAACATCTTAAAAA).
Arrangøren
1E (fremad 5’AGGTGGATCCTTAGAGTTATAAAAATTATAATTTGTGT-3.. «; reverse 5’AGGTGAATTCATACAAACAACTTTAAAATACCAAC-3»)
Alle primere ble levert av MWG-Eurofins
PCR ble utført ved hjelp av Immolase Polymerase (Bioline) etter produsentens anvisninger. Sykkelforholdene var som følger: 95 ° C i 10 minutter, 30 sykluser ved 95 ° C i 30 sekunder, ved 56 ° C i 45 sekunder, og ved 72 ° C i 30 sekunder, ble dette etterfulgt av en endelig forlengelse på 72 ° C i 10 minutter.
PCR-produktene ble elektroforesebehandlet på en poly-akrylamidgel og renset ved anvendelse av en gel ekstraksjon kit (Qiagen). Ligations ble deretter utført ved hjelp av disse PCR-fragmenter med pGEM-T-lett vektorsystem (Promega) etter produsentens anvisninger. Etter transformasjon inn i kompetente JM 109-bakterier (Promega), ble kolonier plukket og inkubert over natten i LB-næringsløsning ved 37 ° C. Mini-preps (Qiagen) ble utført på disse cellesuspensjoner, etterfulgt av en restriksjonskutting ved hjelp av EcoRI (Roche) for å bekrefte tilstedeværelsen av det riktige innskuddet. Plasmider som inneholder innsatsen ble deretter sendt til sekvensering ved hjelp av en SP16 primer på DNA Sekvense Facility, University of Manchester. En innledende studie ble utført for å analysere potensialet metylering og effekten av 5’Azadeoxycytidine, ved hjelp av DNA fra DMS 79 celler. I dette tilfellet ble en klon analysert for hver tilstand (enkelte promoter, ubehandlet eller behandlet med 5’Azadeoxycytidine). En mer inngående studie ble utført for å analysere metylering av 1C promoter i et panel av SCLC cellelinjer. I dette tilfellet ble 3 kloner analysert per cellelinje.
statistikker
All statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS for Windows versjon 16. Andre statistisk analyse ble utført for å sammenligne metylering nivåer av Dr Steve Roberts, Universitetet i Manchester; ved bruk av en lineær regresjonsmodell. Ligningen brukes for denne analysen var som følger:
Resultater
Uttrykk for GR er svekket i menneske SCLC cellelinje, ble DMS79
GR protein målt i hSCLC cellen linje, DMS79 og sammenlignet med to Gc sensitive cellelinjer, HeLa og A549, og to Gc-resistente cellelinjer, U2OS og HEK293. Den SCLC-cellelinjen DMS79 uttrykker lave nivåer av GR-protein, ligner U2OS celler og klart langt mindre enn den HeLa og A549-celler (Fig. 1a). Sammenligning med et panel av ikke-SCLC-cellelinjer indikerer at ekspresjon av GR er lavere i SCLC-celler (Fig. 1b). GR-protein ble funnet å bli uttrykt i normal human bronkial epitel, høstet fra lungevev ved reseksjon av lungekreft (Fig. 1c).
(A) Western blot-analyse av GR, og tubulin protein ekspresjon i U20S, HEK, HeLa, A549 og DMS 79 celler. Blot er representative for 3 separate eksperimenter. (B) Sammenligning av GR protein uttrykk mellom SCLC og ikke-SCLC (NS) cellelinjer. Kvantifisering av GR uttrykk i forhold til tubulin er presentert som gjennomsnitt +/- S.E.M. (N = 3) med * indikerer p 0,05, t-test for uavhengige utvalg. (C) Sammenligning av GR protein ekspresjon i normalt humant bronkiale epitel (NBE) sammenlignet med ikke-SCLC-cellelinje (A549), og et panel av humane SCLC-cellelinjer. Kvantifisering av GR uttrykk i forhold til tubulin er presentert. Gjennomsnitt av n = 2. (D) Analyse av GR-proteinekspresjon ved bruk av en GR pan-antistoff dannet mot GR N-terminale (N-term), og en GRalpha spesifikt GR antistoff dannet mot den C-terminale (C-term).
GR migrerte som to store arter, og den relative overflod syntes å variere mellom celletyper (fig. 1a, b). Dette kan reflektere alternativ spleising til GRβ isoform, eller alternativ oversettelse start nettstedbruk [22] – [24]. For ytterligere å karakterisere arten, ble immunoblot gjentatt ved anvendelse av en C-terminal spesifikt antistoff som spesifikt gjenkjenner GRα (Fig. 1d). Den ligner banding mønster observert med de to antistoffer indikerer begge proteiner har en felles C-terminal domene, noe som tyder på at proteinet mangfold ligger med alternative oversettelse start bruken av nettstedet.
Restaurering av GR uttrykk induserer apoptose
i DMS79 celler ekspresjon av et GR-EYFP transgen av retroviral infeksjon resulterte i økt GR-EYFP-proteinet (fig. 2a) og apoptose som vist ved øket spaltet caspase-3 i SCLC celler som uttrykker GR-EYFP (fig. 2b). I disse studiene bare et mindretall av celler blir effektivt transdusert, derav den lave overflod av uttrykte fusjonsprotein i bassenget av celler. I tillegg uttrykk av transgenet indusert apoptose, som ytterligere reduserer GR-EYFP konsentrasjon i sammenslåtte cellelysater [13], [14].
(A) DMS 79 celler ble infisert med enten GR-EYFP eller EYFP retrovirus og GR protein vurdert til 72 timer. (B) DM79 celler behandlet som ovenfor ble løst for immunhistokjemi for å påvise kløyvde caspase-3. Cellene ble farget for aktivert caspase-3 og deretter analysert for samlokalisering med enten GR-EYFP eller EYFP. Prosent av celler positive for kløyvde caspase-3 og EYFP eller GR-EYFP. Legemer avledet fra 3 uavhengige infeksjoner og representert i prosent av caspase-3-positiv til positiv EYFP som gjennomsnitt +/- S.E.M. (N = 3) med *** indikerer p 0,001, t-test for uavhengige utvalg
Metylering status av GR promoter i SCLC celler
redusert GR uttrykk. SCLC-celler kan resultere i endring i GR promoter metylering, eller fra en indirekte mekanisme. Derfor metylering status for GR promotorene i DMS79-celler ble undersøkt ved bisulfitt-sekvensering. Vi gjorde ikke oppdage eventuelle DNA metylering i arrangører 1B, og 1F. 1D og 1E promoter hver hadde bare en enkelt metyl CpG, som er merket med en åpen boks (fig. 3a, b). I motsetning til 1C arrangøren hadde fire metyl CPGs (Fig. 3c). De observerte denaturert CPGs ligger i potensielle transkripsjonsfaktorbindingsseter, (CPGs 6, 44 og 52), eller ligger nær et slikt nettsted (CpG 69) (Fig. 3c).
bisulfitt sekvensering ble utført på ekstraheres genom-DNA fra DMS 79 celler inkubert med 5’Azadeoxycytidine i 5 dager (ubehandlet som kontroll). Den opprinnelige sekvens (oppnådd fra genomet Browser) ble sammenlignet med bisulfitt behandlede DNA fra kontroll og 5’Azadeoxycytidine behandlede prøver. Fet, åpne bokser markere bestemte denaturert CPGs, som viste reversering av metylering etter 5’Azadeoxycytidine inkubasjon. Potensialet transkripsjonsfaktor bindingsseter i umiddelbar nærhet til denaturert nettstedene er angitt med grå skyggelegging for SP1 bindingssete og mørk grå skyggelegging for C /EBPβ bindingssete. (A) CpG metylering i GR 1D promotorområdet i DMS-79-celler. Individuelle CPGs er nummerert og i hovedstedene. (B) CpG metylering i et område av den GR-promoteren 1E fra DMS 79 genomisk DNA. Individuelle CPGs er nummerert og i hovedstedene. (C) Genomisk DNA fra et område av den GR-promoteren 1C fra DMS 79 celler. Individuelle CPGs er nummerert og i hovedstedene. Kursiv tekst indikerer starten av exon 1C.
SCLC cellelinjer har økt metylering av GR 1C arrangøren
For å finne ut om de observerte endringene i GR promoter metylering ble funnet i andre menneskers SCLC-cellelinjer, et panel av 14 hSCLC cellelinjer med varierende GR ekspresjon ble sammenlignet med to GR uttrykkende cellelinjer (A549 og HeLa) en ikke-uttrykkende cellelinje, (U2OS), og perifere mononukleære blodceller som en primær celle sammenligning (fig. 4a, b). Kulene representerer CpG-dinukleotider fra posisjon 1 til posisjon 69. Det er innlysende at det er hyppig metylering ved de to siste perler på den høyre, som representerer CpG 68 og 69. Dette er til stede over hele panelet av SCLC-celler, og er også sett i kontrollcellene. Men det er også en markert økning i metylering i posisjonene 1-67 tvers av SCLC panel, uten noen nevneverdig gruppering. I motsetning til dette er det svært lite CpG metylering sett i posisjonene 1-67 i kontrollcellepanelet (fig. 4a, b).
Genomisk DNA ble ekstrahert fra (A) spesifikke kontrollcellelinjer, inkludert primær perifert blod mononukleære leukocytter fra en frisk donor og (B) 14 hSCLC cellelinjer. Etter bisulfitt omdannelse den 1C promotorområdet ble PCR-amplifisert. 3 kloner per cellelinje ble deretter sekvensert. Metylering i panelet av SCLC-cellelinjer og kontrollcellelinjer er vist som «perler». Hver enkelt perle betegner en enkelt CpG i GR 1C promoteren i numerisk rekkefølge fra venstre til høyre. Hvite perler indikere unmethylated CPGs mens sorte perler indikere denaturert CPGs. Alle 3 kloner vises for hver cellelinje analysert.
Logistisk regresjon ble brukt for å sammenligne metylering mellom SCLC panel, og alle kontrollceller (tabell 1). Denne viste at det var en signifikant forskjell mellom gruppene med metylering ved CpG 69 individuelt; og med CpG 68 og 69 i kombinasjon, og i hele promoter-regionen. En vesentlig forskjell ble også observert mellom gruppene for alle CPGs unntatt 68 og 69 (tabell 1).
GR promoter metylering er korrelert med GR uttrykk
På tvers av alle de hSCLC cellelinjer der var et bredt spekter av GR ekspresjon, selv om i alle tilfeller GR var mindre enn rikelig i HeLa og A549 kontrollcellelinjer (fig. 5a, b). Det var også en markert variasjon i mengden av de to GR proteinarter på tvers av cellelinjene som ble undersøkt, men for denne analysen både GR protein isoformene ble vurdert sammen. Forholdet mellom GR 1C promotoren metylering og GR-protein-ekspresjon ble undersøkt over hele panelet av hSCLC cellelinjer. Det var en signifikant korrelasjon mellom antall metylerte CPGs, og GR proteinekspresjon i panel av hSCLC cellelinjer; r
2 = 0,54 og p = 0,01 (Fig. 5c).
(A) Representant western blot for GR og tubulin i 10 SCLC cellelinjer samt kontroll cellelinjer HEK (humane embryonale nyre ), U2OS (osteosarkom), HeLa (livmorhalskreft) og A549 (ikke-småcellet lungekreft). (B) Densitometry ble utført på 5 separate blotter å kvantifisere nivåene av GR uttrykk i forhold til tubulin. Grafen viser gjennomsnittlig korrigert GR uttrykk ± SEM (C) Forholdet mellom metylering av GR Arrangøren 1C og GR uttrykk i et panel av humane lungekreftcellelinjer. Samlet metylering (i prosent) på tvers promoter 1C ble plottet mot GR uttrykk, med standard feil for hver cellelinje. Regresjonslinjen var signifikant forskjellig fra null (P = 0,01), og egnethets var r
2 = 0,54.
Restaurering av GR uttrykk ved reversering av DNA metylering
Hvis tapet av GR uttrykk i DMS79 celler resulterte fra DNA metylering, kanskje påfølgende til kreftutvikling, ville GR uttrykk bli spådd å øke etter reversering av metylering. Etter 72 timer med behandling med 5’Azadeoxycytidine, GR mRNA nivåer økt dramatisk i DMS79 celler sammenlignet med HEK og A549 cellene der ingen endringer i uttrykket ble sett (Fig. 6a). Videre, etter 72 timer, og etter 5 dagers inkubering med 5’Azadeoxycytidine, var det en slående økning i GR-proteinet (fig. 6b). I motsetning til økningen i GR ekspresjon sett i DMS79, ble det redusert ekspresjon i U2OS celler, muligens på grunn av toksisitet (Fig. 6b).
(A) GR mRNA ekspresjon normalisert til GAPDH som reaksjon på 72 timer behandling med 5’azadeoxycytidine (5’Aza) i DMS 79 celler, GR mangel HEK-celler og GR uttrykker A549 celler. (B) To GR mangelfulle cellelinjer, DMS 79 og U2OS, ble behandlet med 5’Azadeoxycytidine (5’Aza) i 72 timer og 5 dager (ubehandlede celler som kontroll). Lysatene ble så analysert ved hjelp av western blot for GR ekspresjon. For DMS 79 celler ble GR uttrykk normalisert mot α tubulin, og plottet som gjennomsnitt GR uttrykk pluss S.E.M. (N = 3). * Angir p 0,01 sammenlignet med vehikkel behandlet kontrollgruppe. (C) Et panel av humane SCLC-cellelinjer (øvre panel) ble sammenlignet med et panel av ikke-SCLC-cellelinjer (nedre panel) for responsen av GR protein til inkubasjon med 5’Azadeoxycytidine (5’Aza).
effekten av 5’Azadeoxycytidine ble så sammenlignet i humane SCLC-cellelinjer og ikke-SCLC-cellelinjer for å bestemme om reguleringen av ekspresjonen GR ved metylering var utbredt i lunge cancer. Tre av de fire SCLC-cellelinjer viste forsterket GR uttrykk etter 5’Azadeoxycytidine behandling, i forhold til bare en av de fire ikke-SCLC-cellelinjer (Fig. 6c).
Økningen i GR ekspresjon sett i DMS79 cellene er spådd å gjenopprette Gc følsomhet for disse cellene. Faktisk ble der øket Gc transaktivering av en enkel reporter-gen (fig. 7a). Størrelsen av Gc induksjon var betydelig mindre enn det som ble sett med GR overekspresjon, men det sistnevnte resulterer i suprafysiologiske GR konsentrasjoner i målceller (Fig. 7a).
(A) Behandling av DMS 79 celler med 5’Azadeoxycytidine (5’Aza) gjenoppretter Gc følsomhet. DMS 79 celler behandlet med 5’Aza i 72 timer ble transfektert med den tat3-luciferase reporter-konstruksjonen. Cellene ble deretter inkubert over natten med eller uten 100 nM deksametason. Grafen viser gjennomsnittlig ganger endring (Dex behandlet /ubehandlet), (relative lysenheter), (tre eksemplarer) pluss SEM (* = P 0,05). DMS 79 celler ble også ko-transfektert med pFUNC1 GR-EYFP (som positiv kontroll) og den tat3-luciferase reporter-konstruksjonen. Cellene ble deretter inkubert over natten med eller uten 100 nM deksametason. Grafen viser gjennomsnittlig ganger endring (dex behandlet /ubehandlet) pluss SEM Alle resultater ble normalisert mot en Renilla kontroll. Resultatene er representative for 3 separate eksperimenter. (B) Bcl-2-mRNA-ekspresjon normalisert til GAPDH i respons til 72 timer behandling med 5’Azadeoxycytidine (5 «Aza) i DMS79 og HEK-celler. (C) Behandling av celler med Aza og deretter deksametason resulterer i apoptose. Representative bilde av SCLC-celler (CORL47) og ikke-SCLC-celler (NCI-H358) som ble behandlet med Aza som beskrevet ovenfor. Cellene ble deretter behandlet med deksametason i 72 timer, fiksert og farget for aktiv caspase-3. (D) Demetylering fører til markert økning i Gc-mediert apoptose i SCLC-celler sammenlignet med ikke-SCLC-celler. Apoptose målt ved hjelp av kaspase-3 aktivering etter 5’Aza og deksametason som beskrevet ovenfor. Grå stolper representerer celler behandlet med deksametason, svarte striper for celler behandlet med 5’Aza og deretter med deksametason. Hver cellelinje ble inkubert i triplikat og 100 celler tellet for å vurdere% positiv farging. Uavhengig t-test * = p 0,05, ** = p 0,01, *** = p. 0,001
Den økte GR uttrykk i respons på behandling med 5’Azadeoxycytidine resulterte i undertrykkelse av pro-overlevelse Bcl-2-genet i både HEK, og DMS79-celler (fig. 7b). Det ble også øket spaltet kaspase-3 aktivering i SCLC celler, men ikke de ikke-SCLC-celler (figur 7c og amp;. 7d). Det er viktig å merke seg at etter 5 dager inkubasjon med 5’Azadeoxycytidine var det induksjon av celledød, muligens på grunn av reacquisition av GR uttrykk, eller regulering av andre overlevelse gener.
Diskusjoner
epigenetiske lidelser er implisert i mange menneskelige sykdommer, inkludert kreft. Sigarettrøyk er den viktigste miljø agenten fremme SCLC og nylig, har en sigarett røyk kreftfremkallende, NNK, er vist å utøve en bestemt effekt fremme DNMT1 uttrykk og aktivitet [4]. Derfor denne kreftfremkallende kan virke ved å fremkalle epigenetiske forandringer i viktige gener involvert i patogenesen av kreft.
Vi har tidligere vist at glukokortikoid reseptoren er effektivt en tumor suppressor genet for SCLC, hvis uttrykket er hemmet [12] . Vi har utvidet analysen i denne studien med ytterligere bevis på at den GR uttrykket er lavere i et panel av SCLC-celler sammenlignet med ikke-SCLC celler eller normale bronkiale epitelceller. Innhenting av GR uttrykk, og glukokortikoid følsomhet i SCLC-celler
in vitro
, eller i xenograft tumorer fører til apoptose [13], [14]. GR er uttrykt i de fleste celler og vev, og utøver pleiotropiske virkninger på celler. Men relativt lite er kjent om hvordan GR genuttrykk reguleres, da den har en usedvanlig kompleks promoter struktur. Nyere studier i grunnskolen perifere mononukleære blodceller definert svært individuelle mønstre av GR promoter metylering [16]. Dette arbeidet har også kartlagt potensialet, og bevist transkripsjonsfaktor bindingssteder innenfor arrangører, de fleste som inneholdt CpG områder som kan bli metylert. Dette antydet at differensial metylering av det humane GR-promoteren er en mekanisme for å kontrollere promoter utnyttelse, og så GR genekspresjon.
Tre GR promotorer ble undersøkt i indeksen cellelinje, DMS79, og alle tre inneholdt metylert CpG sider . Ytterligere analyse ble utført på den 1C promoter som det har vist seg å være ubikvitært uttrykt i alle vev som ble testet, inkludert lungekreft [15]. Det var en åpenbar og svært signifikant økning i CpG metylering på tvers av et panel av hSCLC cellelinjer sammenlignet med den ikke-SCLC-cellelinjen A549. Viktigere var det ingen økning i de to ikke-uttrykkende kontrollcellelinjer (U2OS og HEK293), noe som indikerer at 1C promoter metylering ikke er nødvendig for å begrense GR uttrykk, men at andre mekanismer kan anvende for å regulere GR ekspresjon i forskjellige celletyper. En bredere sammenligning mellom hSCLC celler og en heterogen panel av GR uttrykke, og ikke-uttrykker cellelinjer også funnet en meget betydelig økning i denaturert CpG steder i hSCLC cellene.
