Abstract
Aberrant glykosylering er et felles trekk ved mange kreftformer, inkludert kolorektal kreft (CRC). Ca 15% av CRC viser mikro ustabilitet (MSI) fenotype som er forbundet med en høy frekvens av biallelic rammeskifte mutasjoner i A10 koding mononukleotid mikro av
transformerende vekstfaktor beta-reseptor 2
(
TGFBR2
) genet. Hvis og hvordan nedsatt TGFBR2 signalering i MSI CRC celler påvirker celleoverflaten sukker mønsteret er stort sett uutforsket. Her har vi brukte TGFBR2-manglende MSI colon carcinoma cellelinje HCT116 som et modellsystem. Stabil kloner overdragelse doksycyklin (DOX) -inducible uttrykk for en enkelt kopi hvete
TGFBR2
transgen ble generert av recombinase-mediert kassett utveksling (RMCE). I to uavhengige kloner ble DOX-induserbar uttrykk for hvete TGFBR2 protein og tilberedning av sin signalfunksjon vist. Metabolsk merking eksperimenter ved hjelp av tritium sialsyre forløper
N
acetyl-D-mannosamine (ManNAc) viste en signifikant nedgang (~ 30%) av sin innlemmelse i nye syntetiserte sialoglycoproteins i en TGFBR2 avhengig måte. Spesielt vi har oppdaget en betydelig reduksjon av sialylert SS1-inte på rekonstituert TGFBR2 signalering som ikke påvirker SS1-inte protein omsetning. Spesielt, har TGFBR2 rekonstitusjon ikke påvirke transkripsjonsnivåer fra enhver av de kjente humane sialyltransferaser når undersøkt ved hjelp av sanntids-RT-PCR-analyse. Disse resultatene tyder på at rekonstituert TGFBR2 signalisering i en isogen MSI cellelinje modellsystem kan modulere sialylering av celleoverflateproteiner som SS1-integrin. Videre vil vår modell systemet være egnet til å avdekke de underliggende molekylære mekanismene for endret MSI svulst glykobiologi
Citation. Lee J, Ballikaya S, Schönig K, Ball CR, Glimm H, Kopitz J et al. (2013) transformerende vekstfaktor beta-reseptor 2 (TGFBR2) Endringer sialysering i mikro Ustabil (MSI) tykktarmskreft cellelinje HCT116. PLoS ONE 8 (2): e57074. doi: 10,1371 /journal.pone.0057074
Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, Taiwan
mottatt: 17 november 2012; Godkjent: 17 januar 2013; Publisert: 27 februar 2013
Copyright: © 2013 Lee et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Økonomisk støtte ble gitt av DFG (GE592 /6-1) til JK og J. G. og DFG (KFO 227) til C.R.B. og HG De finansiører hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Om 15% av arvelige og sporadiske kolorektale svulster vise mikro ustabilitet høy frekvens (heretter kalt MSI) fenotype. MSI manifesterer seg som lengdevariasjoner av en rekke korte repetitive sekvenser (mikro) forårsaket av tap av normal DNA mismatch reparasjon (MMR) funksjon i disse tumorcellene. Hvis MSI påvirker kodende mikro av uttrykte gener de resulterende rammeskiftmutasjoner føre til for tidlig translasjons-terminering og nedsatt proteinfunksjon [1] – [3]. Et stort antall gener som bærer mikro i deres kodende områder er identifisert og funnet å være ofte påvirket av rammeskifte mutasjoner i MSI tykktarmssvulster [4] – [7]. Mutasjoner i et begrenset antall av disse genene er antatt å drive MSI tumorgenese.
TGFBR2
er en av de mest interessante MSI målgener fordi det er en del av en nøkkel signalveien i tykktarm epitelceller og funnet å være inaktivert ved høy frekvens av biallelic rammeskifte mutasjoner i MSI tykktarmssvulster [8]. TGFBR2 er et transmembran serin-treonin-kinase som er i stand til å undertrykke proliferasjon og også induserer apoptose og differensiering utløst av transformerende vekstfaktor beta (TGF-ß) aktivering [9] – [11]. Ved binding av liganden TGF-SS1 dannelse av en hetero-tetramer-reseptor-kompleks utgjøres av type 1 (TGFBR1) og type 2 (TGFBR2) reseptorer blir initiert og nedstrøms-proteiner som SMAD2 og SMAD3 bli fosforylert [10], [12] . Disse fosforylerte Smad proteiner så forbinder med SMAD4 og ved translokasjon til kjernen direkte transkripsjon av ulike målgener som
SMAD7 product: [13] eller
SERPINE product: [14].
Mange proteiner, spesielt celleoverflateproteiner, er glykosylert og krever glykan modifikasjoner for å gi normal funksjon i cellekommunikasjon, gjenkjennelse og adhesjon. Videre har endret celleoverflaten glykosylering vært implisert i tumordannelse og metastase [15] – [17]. I tykktarmskreft, ble mRNA-ekspresjon i ulike glycosyltransferases funnet økt sammenlignet med tilsvarende normal tykktarmsslimhinne [18], [19]. I tillegg har fucosylation av celleoverflateproteiner også blitt implisert i kreft [20]. Fucosyltransferases er forbundet med dannelsen av tumorantigener som sialyl-Le
x og -Le
a [21]. Sialsyre er en viktig del av glykoproteiner og har blitt korrelert med metastase [22]. Ulik plassering av sialsyre på celleoverflaten fører til maskering eller avsløring av spesifikke sakkarider som er viktige for metastasering [23]. Det har vist seg, korrelerer som sialinsyre med
in vivo
tumorgenicity i CRC HCT116-cellelinjen [24].
SS1-inte er et medlem av en stor familie av proteiner adhesjonsproteiner kjent å være sterkt sialylert. Inte er glykoproteiner som danner hetero-dimer komplekser av a- og ß-subenheter overdragelse forskjellige ligand slektskap. Siden signale av griner er involvert i flere viktige cellulære prosesser som brennvidde heft og bevegelighet, har nedsatt intesignale vært innblandet i kreft metastase [25], [26]. Det har blitt rapportert at binding til lektin til SNA sialylert SS1-integrin er økt i colon tumorvevet sammenlignet med normal kolonepitelet [27]. Dessuten ble de-sialylering av SS1-integrin vist seg å stimulere dets binding til glykoproteiner av den ekstracellulære matrisen [28], [29].
Selv om TGFBR2 signalering er involvert i celle-celle-kommunikasjon, celleadhesjon og celle migrasjon rollen til denne bane i glykosyleringsmønster av celleoverflateproteiner er stort sett uutforsket. Eksperimentelle bevis antydet en mulig sammenheng mellom muterte MSI målgener og glykosyleringsmønster på celleoverflaten [30]. I denne studien har vi brukt TGFBR2-rekonstituerte MSI tykktarmskreft cellelinje HCT116 som modellsystem for å analysere TGFBR2-avhengige endringer i protein glykosylering. Vi oppdaget en nedgang i global sialylering av nylig syntetiserte proteiner dermed omvendt gjenspeiler den økte sialysering observert i primære kolorektal tumorer. Spesielt identifiserte vi TGFBR2 signalering som en modulator av sialysering nivåer av SS1-inte.
Materialer og Metoder
Plasmider
S2F-cLM2CG-FRT3 [31] inneholder en tet-styrt toveistranskripsjonsenhet for samtidig regulering av de to rapportørgener ildflue
luciferase
og rødt fluorescerende protein
mCherry.
Denne ekspresjonskassett er flankert av to hetero-spesifikk FLP-gjenkjenningsseter, en mutert F3 og hvete F side [32]. For retroviral montering brukte vi vektorene pVPack-GP og pVPack-VSV-G (Stratagene). Rekombinasjon ble formidlet av enzymet Flpo-rekombinase som kodes for av plasmidet pCAGGS-Flpo-IRES-Puro oppnådd fra Michael Hahn (DKFZ, Heidelberg). Plasmidet pE11.F3.HygTK.F [31] som koder for et hygromycin B-fosfotransferase-tymidin kinase (HygTK) translasjonelle fusjonsprotein ble brukt for antibiotisk seleksjon og genereringen av HCT116-HygTK hovedcellelinje. Den retrovirale vektor S2F-cLM2CG-FRT3-TGFBR2 ble generert ved PCR forsterkning av villtype
TGFBR2
cDNA fra uttrykket plasmid pcDNA3.1 /Hans-TGFBR2 [30] med primere som bærer
EcoRI
eller
NotI plakater (NEB) restriksjonsseter (Tabell S1) og utskifting av
EcoRI Twitter /
NotI mCherry
fragment av S2F-cLM2CG-FRT3. Verifisering av riktig innstikkstedet og sekvens av villtype
TGFBR2
genet ble bekreftet ved DNA sekvensanalyse.
Cellelinjer
Alle cellelinjer ble dyrket i DMEM (PAA) supplert med 10% varme-inaktivert FBS gull (PAA) og 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (PAA) ved anvendelse av standard betingelser. Foreldre CRC cellelinje HCT116 har blitt kjøpt fra European Innsamling av cellekulturer (ECACC). Dette MMR-mangelcellelinje viser MSI fenotype og er ildfast til TGF-ß-mediert signale grunn biallelic rammeskifte mutasjoner i A10 koding mikro av endogen
TGFBR2
genet. Den HCT116 AWE17 (HCT116-Tet-On) cellelinje er et stabilt transfektert derivat av foreldre HCT116 cellelinje overdragelse konstituerende uttrykk for det motsatte transcriptional transaktivatorprotein (rtTA) og EGFP protein [33]. HepG2-cellelinjen ble brukt som en positiv kontroll for SMAD2 signalering. 293T-celler ble erholdt fra ATCC. For signalisering eksperimenter ble cellene sultet i 17 timer i nærvær og fravær av 1 ug /ml DOX (Sigma) og deretter inkubert med 10 ng /ml rekombinant TGF-SS1 (Cell Signaling) i 1 time. Transfeksjon eksperimenter ble utført med Fugene HD Transfeksjon Reagens henhold til produsentens instruksjoner (Roche). Antibiotika utvalg ble utført ved hjelp av hygromycin B (HYG, 100 mikrogram /ml, PAA), puromycin (1,5 mikrogram /ml, Sigma) og ganciklovir (Gan, 40 mikrometer, Roche) for de angitte trinnene.
generasjon HCT116-TGFBR2 Cells
Vi har brukt en retroviral basert tilnærming beskrevet tidligere [31]. I korthet, 10
6 293T-celler ble ko-transfektert med plasmidene 3 provirale [34], [35]. 10
5 HCT116-Tet-On-celler (~ 30% konfluens) ble infisert med en MOI på 0,01 og 0,05 for å sikre ett eksemplar virus integrering. Vellykket transduced HCT116-Tet-On celler ble indusert med 0,2 mikrogram /ml DOX og mCherry-positive celler ble undersøkt og isolert ved FACS (av-på-på). Enkelt mCherry-positive celler ble valgt for klonal ekspansjon (HCT116-mCherry). I det første trinnet rekombinasjon (RMCE), 5 x 10
5 HCT116-mCherry-celler ble ko-transfektert på 6-brønners plater med 2 ug pE11.F3.HygTK.F plasmid som bærer et Hyg-TK ekspresjonskassetten flankert av to rekombinasjonsseter (F3 /F) og 2 mikrogram pCAGGS-Flpo-IRES-Puro (Figur 1a). De resulterende HCT116-HygTK mester celle kloner, som er Hyg motstandsdyktig og følsomme for Gan (Adm
r, Gan
s), gjennomgikk en andre RMCE resulterer i HCT116-TGFBR2 kloner som er tillagt DOX-induserbar uttrykk for TGFBR2 og luciferase samtidig (figur 1A). Kvantifisering av DOX-induserbar ekspresjon nivåer ble bestemt ved luciferase-analyser.
(A) Skjematisk oversikt over rekombinasjon-mediert kassett utveksling (RMCE). Retroviral transduksjon ble utført ved hjelp av førvirus vektor S2F-cLM2CG-FRT3 som inneholder en toveis DOX-induserbar promoter (P
tetbi) tillater samtidig uttrykk for to markørgener (
luciferase Hotell og
mCherry
) i HCT116-mCherry kloner. Expression kassetter er flankert av mutant (F3) og hvete Flp-loxP (F) som tillater rettet kassettutveksling via Flpo-recombinase. Retroviral emballasje signal (Ψ
+) og lange terminale gjentagelser (LTR) er angitt. (B) Karakterisering av virus integrering områder av nrLAM-PCR og sekvensering. I den øvre delen, klone spesifikke integrasjons nettsteder og berørte genomisk loci (åpen leseramme (ORF);
aldehyd dehydrogenase familie 1 medlem L1 product: (
ALDH1L1
)) er avbildet. I den nedre delen, 5′- og 3’viral LTR DNA-sekvenser (små bokstaver) samt de flankerende genomiske DNA-sekvenser (store bokstaver) er vist.
PCR og sekvense
Standard PCR ble utført ved hjelp av HOT FIREPol DNA Polymerase (Solis biodyne) med følgende sykkelforholdene: innledende denaturering 95 ° C 15 min; 35 sykluser av 95 ° C denaturering i 30 sekunder, 60 ° C gløding i 30 s, 72 ° C forlengelse i 1 min og en endelig forlengelse trinn ved 72 ° C i 2 min. DNA-sekvensering ble utført ved anvendelse av BigDye Terminator v1.1 sekvenseringssett (Invitrogen). Analysen ble utført på en ABI3100 genetisk analysator (Applied Biosystems).
Lineær forsterkning-mediert (LAM) -PCR
Genomisk DNA ble ekstrahert fra cellelinjer i henhold til produsentens protokoll bruker DNeasy Blood Tissue Kit (Qiagen). Ikke-begrensende (nr) LAM-PCR ble utført som tidligere beskrevet [36]. I korte trekk, ble 1 pg av gDNA avledet fra transduserte cellekloner som brukes for den lineære forsterkningen av vektorgenomet knutepunktene med biotinylert primer (tabell S1). Etter anrikning av de amplifiserte fragmentene via magnetiske kuler, ble den andre DNA-tråd som genereres. Etter ligering av en kjent oligonukleotid til det ukjente del av amplikonene ble to nestede eksponentielle PCR utført. For ytterligere fremstilling av prøvene adaptere ble tilsatt til begge ender av amplikoner med ytterligere eksponensiell PCR for å tillate Roche 454-spesifikk amplifikasjon og sekvensering. For parallell sekvensering av forskjellige prøver en 6-10 bp strekkode ble brukt. 40 ng av DNA ble amplifisert ved anvendelse av følgende PCR-program: innledende denaturering i 120 s ved 95 ° C; 12 sykluser ved 95 ° C i 45 s, 58 ° C i 45 s og 72 ° C i 60 sekunder; endelig forlengelse 300 s ved 72 ° C. Rå LAM-PCR fragment sekvenser ble skilt i henhold til den innførte strekkode, ytterligere trimmet og justert til det menneskelige genom sekvens ved hjelp BLAT (Assembly februar 2009) [37].
Luciferase Assay
Luciferase aktivitet ble målt ved luciferase assay System (Promega) i to eksemplarer i henhold til produsentens instruksjoner og normalisert til proteinkonsentrasjonen bestemmes ved Bradford assay (BioRad).
Western blot analyse
Cell pellets var resuspendert i RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% natrium-deoksycholat, 0,1% SDS, 0,1 mM CaCl
2 og 0,01 mM MgCl
2) . Etter ultralydbehandling, inkubering (1 time, 4 ° C) og sentrifugering (12.000 g, 20 min, 4 ° C) Proteinkonsentrasjonen av løsningen ble målt ved Bradford-analysen. For immunoblotting ble 50 ug protein separert på 4-12% Bis-Tris Geler (NuPAGE, Invitrogen) og elektroblottet på en nitrocellulosemembran. Etter blokkering av membranen i 30 minutter ved romtemperatur (RT) i 5% skummet melk /TBST (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 M NaCl og 0,1% Tween-20), de følgende primære antistoffer ble brukt i blokkeringsløsning: mus anti-TGFBR2 (SC-17799, Santa Cruz, 1:500, 4 ° C, over natten); mus anti-ß-Actin (MP Biomedicals, 1:30,000, RT, 1H); kanin anti-fosfor-SMAD2 (Ser465 /467, Cell Signaling, 1:1000, 4 ° C over natten); kanin anti-SMAD2 (86F7, Cell Signaling, 1:1000, 4 ° C over natten). Etter flere vasketrinn (10 min hver på RT) i TBST, blotter ble inkubert med sekundær antistoffer sau anti-mus-IgG HRP (1:5000, GE-Healthcare) og geit anti-kanin-IgG HRP (1:2500; Promega) i 1 time ved RT. Etter tre vasketrinn (10 min hver på RT) i TBST, ble signalene oppdaget ved hjelp av Western Lightning Plus ECL (PerkinElmer).
Real-Time RT-PCR
1 mikrogram total RNA var isolert med RNeasy Kit (Qiagen) og revers transkribert ved hjelp av oligo-dT primere og Super II revers transkriptase henhold til produsentens protokoll (Invitrogen). For sanntids revers transkripsjon (RT) -PCR forsøkene ble det spesifikke primere (tabell S1 og S2), og PowerSYBR Grønn Master Mix (Applied Biosystems) anvendt. Triplikater med forskjellige cDNA-prøver (-dox versus + DOX) ble analysert i den StepOnePlus termo cycler (Applied Biosystems) med følgende program: 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Data ble analysert ved StepOne programvare v2.1 (Applied Biosystems). Genekspresjon ble normalisert til uttrykk av referansegener
GAPDH Hotell og
hydroxymethylbilane syntase product: (
HMBS
).
Proliferation Assay
MTS spredning ble utført i tre eksemplarer med CellTiter 96 Vandig kit (Promega) i henhold til produsentens anvisninger.
innlemmelse av radioaktivt merkede Monosakkarider
5-10 × 10
4 celler /brønn ble sådd ut i triplikat i en 6-brønns plate. Etter 24 timer ble cellene på ny tilført 2 ml nye medier inneholdende 0,185 MBq av de respektive
3H-merket sakkarid (
3H-ManNAc (
N
– [mannosamine-6-
3H]), [185-370 GBq /mmol] eller
3H-L-fucose (L-6-
3H), [1,48 til 2,22 TBq /mmol], Amerikansk Radiomerket Chemicals, Inc.) og 10 ng /ml TGF-SS1. Celler ble dyrket i nærvær eller fravær av 0,5 ug /ml DOX for å oppnå en konfluens på 60-80%. Etter 72 timer ble cellene vasket 3 ganger med PBS og avskrapet. Cellene ble sentrifugert 5 minutter ved 1000 g ved romtemperatur og vasket med PBS. Cellepelleten ble oppløst i 400 ul 0,2 N NaOH i 1 time ved 56 ° C. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved Lowry-analysen. 1 ug BSA og 400 ul 10% TCA ble tilsatt for å felle ut proteinene ved sentrifugering (10 min, 12 000 g, RT) og for å fjerne uinkorporerte merket sakkarider. Pelleten ble deretter resuspendert i 400 ul 1 N NaOH og nøytralisert med 200 ul 2,5N eddiksyre og blandet med 10 ml scintillasjons-cocktail (Ultima Gold, PerkinElmer). Prøvene ble telt ved hjelp av en flytende scintillation analysator (TRI-CARB 2900TR, Packard) og DPM målinger ble utført med automatisk slukke korreksjon påføre forvandlet Spectral Index of External Standard /automasjon Effektivitet kontroll (tSIE /AEC) -metoden. Resultatene ble uttrykt som DPM og normalisert til protein mengde (mg).
radioaktiv merking og SS1-Inte Immunpresipitasjon (IP)
For dual merking ved hjelp av
35S-L-metionin [37 TBq /mmol] (American Radiomerket Chemicals, Inc.) og
3H-ManNAc, 1-2 × 10
6 celler ble sådd i tre eksemplarer på 10 cm plater. Etter 24 timer ble mediet erstattet med 5 ml nye medier inneholdende 1,11 MBq av
3H-ManNAc, 0,37 MBq av
35S-L-metionin og 10 ng /ml TGF-SS1. Celler ble dyrket i nærvær eller fravær av 0,5 ug /ml DOX. Etter 72 timer ble cellene vasket 3 ganger med PBS og avskrapet. Cellene ble sentrifugert i 5 minutter ved 1000 g ved 4 ° C og vasket med PBS. Pelleten ble resuspendert i 150 ul RIPA-buffer. Cellene ble ultralydbehandlet og inkubert i 1 time ved 4 ° C under rotasjon. Etter sentrifugering ved 4 ° C i 30 minutter ved 12 000 g av den resulterende lysatet ble benyttet for å bestemme proteinkonsentrasjonen ved Bradford-analysen. For SS1-integrin IP, ble 1,6 mg lysat ble inkubert med 1,7 ug SS1-integrin-antistoff (P5D2 fra DSHB, Iowa) i et volum på 300 ul i 2 timer ved 4 ° C. Som en kontroll for uspesifikk binding til kulene, ble hver celle klon inkubert uten antistoff i nærvær eller fravær av DOX og tellinger ble subtrahert fra resultatene. 25 ul protein A /G-agarose (Oncogene) ble vasket 3 ganger med 1 ml RIPA-buffer og deretter inkubert med lysatet og antistoffet over natten ved å dreie ved 4 ° C. Kulene ble vasket 5 ganger med 500 ul RIPA-buffer og eluert med 2 x 200 ul av 1 x proteinprøvebuffer (106 mM Tris-HCl, 141 mM Tris-base, 2% SDS, 10% glyserol, 0,51 mM EDTA) ved 99 ° C i 5 min. Prøvene ble blandet med 10 ml scintillasjonsvæske og telt ved hjelp av en scintillasjons-analysator luquid påføring av tSIE /AEC-metoden. Resultatene ble uttrykt som dpm. Som en kontroll for uspesifikk binding av eluering av IP ble analysert ved SDS-PAGE og farget med påfølgende SYPRO-Ruby (Invitrogen). Parallelt ble de tilsvarende bånd påvist ved Western blotting ved anvendelse av en SS1-integrin-antistoff (Cell Signaling) (data ikke vist). For den puls-chase eksperimentet ble cellene podet og behandlet som beskrevet ovenfor, pulset i 72 timer med 1,11 MBq
35S-L-metionin /5 ml friskt medium og deretter høstet ved 5 forskjellige tidspunkter (0h, 4h, 8h , 16h, 24h, jage). Deretter ble cellene lysert som beskrevet ovenfor. 1,5 mg lysat ble inkubert med 1,3 ug SS1-integrin-antistoff i et totalt volum på 300 ul av RIPA-buffer, og rotert i 2 timer ved 4 ° C. Etter tilsetning av protein A /G agarose, ble prøvene behandlet som beskrevet ovenfor.
Resultater
Generering av Doxycycline-induserbar HCT116-mCherry Clones
For å undersøke TGFBR2- avhengige endringer av protein glykosylering, søkte vi å generere en MSI tykktarmskreft cellelinje modellsystem som gjør det mulig induserbar tilberedning av TGFBR2 uttrykk i en isogen bakgrunn. Generelt er dette systemet reflekterer omvendt situasjon primære MSI kolorektale svulster som har mistet TGFBR2 ekspresjon i løpet av tumorprogresjon. Som et første skritt, MSI cellelinje HCT116-Tet-On som konstitutivt uttrykker DOX-regulert rtTA- [33] ble genmodifisert ved transduksjon med selv inaktivere retrovirus uttrykker tet styrt luciferase og mCherry (S2F-cLM2CG-FRT3) på lav mangfold av infeksjon (MOI) for å favorisere én kopi integrering. Kvantitativ analyse av stabile kloner identifiserte to HCT116-mCherry kloner (# 5 og # 22) med 40-70-fold DOX-regulerte induksjon av reportergenekspresjon som bestemmes av luciferase-analyser. Identifikasjon og molekylær karakterisering av de retrovirale integrasjons områder ved nrLAM-PCR og sekvensering bekreftet at bare en enkelt kopi hadde blitt satt inn. Integrering av
luciferase-mCherry
ekspresjonskassett ble lokalisert på kromosomer 1 (
C1orf159)
for klon # 5 og på kromosom 5 (
ALDH1L1
) for klon # 22, henholdsvis (figur 1B). Enda viktigere, gjorde integrerte ekspresjonskassetter ikke endre veksten av HCT116-mCherry kloner i forhold til deres HCT116-Tet-On stamfedre. For å direkte innsetting og DOX-induserbar uttrykk for
TGFBR2
transgen på akkurat disse genomiske områder, fulgt vi en to-trinns strategi (figur 1A). I en første rekombinasjon skritt,
luciferase-mCherry
kassett ble erstattet av et uttrykk kodende den Hyg-TK fusjonsprotein og dermed generere to master-cellelinjer HCT116-HygTK # 5 og # 22 som tillater integrering av genspredning av interesse på disse to genomisk loci. Følgelig erstattet vi
HygTK
uttrykk kassett i en andre RMCE av en
luciferase-TGFBR2
uttrykk kassett som resulterer i HCT116-TGFBR2 kloner # 5 og # 22 som ble preget og brukt for senere analyser .
Karakterisering av HCT116-TGFBR2 Clones
Deretter analyserte vi disse HCT116-TGFBR2 celler i mer detalj. Luciferase analyse viste at reporter gen induksjons nivåer, opprinnelig fremstilt i HCT116-mCherry celler (40-70 ganger), ble også påvist i HCT116-TGFBR2 celler. Dette utelukker eventuelle effekter av RMCE-basert strategi eller uttrykket kassetten brukes på induserbarheten av vår modellsystem. Dessuten, når vi brukte transkripsjon spesifikke primere i real-time RT-PCR-analyse for å sammenligne uttrykket av den endogene A9 mutant
TGFBR2
avskrift, den transgene A10
TGFBR2
hvete avskrift eller begge transkripsjoner på DOX eksponering, ingen endring i den endogene
TGFBR2
karakternivået ble observert. I stedet DOX behandling førte til en sterk induksjon av den transgene
TGFBR2
hvete transkripsjon (Figur 2A). For å utelukke at det rekonstituerte
TGFBR2
villtype-genet kan ha kjøpt tilsvarende inaktive mutasjoner på grunn av mangel på DNA MMR funksjon i disse cellene, sekvensert vi karakterspesifikke
TGFBR2
cDNA og identifisert utelukkende A9 mutante eller A10 hvete gjentar i den endogene eller transgene henholdsvis
TGFBR2
transkripsjoner,. Dermed mutasjonsinaktivering av den rekonstituerte
TGFBR2
transgenet i disse MSI og MMR-mangel HCT116-TGFBR2 kloner kunne utelukkes. I tillegg til disse transkripsjons analysene, vi også undersøkt induserbarhet og funksjonaliteten til TGFBR2 protein ved immunblotting. I fravær av DOX, ble det ikke TGFBR2 proteinet detektert, mens i nærvær av DOX, spesifikke TGFBR2 proteinbånd av det forventede størrelsesområdet (75 kDa) ble observert. Når ble utført tidsforløp analyse, TGFBR2 protein nivåer nådde en topp i løpet av 6 timer, men senere falt innenfor 24 til 48t (figur 2B). For bevis av funksjonalitet av den rekonstituerte TGFBR2 protein, undersøkte vi av signalanlegget evne. Følgelig, fosforylering av SMAD2, den første nedstrøms effektor av TGFBR2 signalering, ble undersøkt ved Western blot-analyse (figur 3A). I fravær av TGFBR2 uttrykket (-dox), TGF-SS1 behandling induserte et basalnivå av pSMAD2 i begge paren HCT116-Tet-on og HCT116-celler TGFBR2. Imidlertid, når TGFBR2-ekspresjon ble indusert (+ DOX) i nærvær av sin ligand, TGF-SS1, en betydelig økning av pSMAD2 nivåer langt ut over basalnivået ble observert. Videre analyserte vi enten disse
TGFBR2
-reconstituted cellene er i stand til å regulere transkripsjon av flere kjente TGFBR2 målgener som
SMAD7 Hotell og
SERPINE
. Real-time RT-PCR-analyse avslørte DOX avhengige
SMAD7 Hotell og
SERPINE
oppregulering og dermed bekreftet normal signalaktivitet (figur 3B). Videre er spredning reduseres når TGF-SS1 signalisering er fremkalt i HCT116-celler TGFBR2 på DOX og TGF-SS1 behandling sammenlignet med HCT116-TGFBR2 celler eksponert for TGF-SS1 i fravær av DOX. Imidlertid forble upåvirket spredning mellom ikke-indusert (-dox) og induserte (+ DOX) foreldre HCT116-Tet-on celler eller HCT116-TGFBR2 (- /+ DOX) celler i fravær av TGF-SS1 ligand (figur S1A). Ingen av disse cellene viste ingen morfologiske endringer (figur S1B). Samlet viser disse resultatene at begge TGFBR2 klonene uttrykker et funksjonelt intakt TGFBR2 proteinet og utviser riktig TGFBR2-mediert signalisering.
(A) Sanntid RT-PCR-analyse av endogene mutant (A9), transgene villtype (A10 ) eller begge
TGFBR2
transkripsjoner i fravær og nærvær av DOX (1 mikrogram /ml) er vist. Resultatene representerer gjennomsnittet av tre uavhengige observasjoner ± S.D. (B) Western blot-analyse, demonstrerer nærværet av DOX-induserbare (1 pg /ml) TGFBR2 ekspresjon i en tidsavhengig måte. ß-Actin fungert som en lasting kontroll. Data er vist for HCT116-TGFBR2 klone # 5, men også søke å klone # 22 (data ikke vist).
(A) Fosforylering av SMAD2 (pSMAD2) ble oppdaget av Western blot analyse. Behandling med DOX (1 pg /ml) og TGF-SS1 (10 ng /ml) utviste høyere nivåer av pSMAD2 sammenlignet med celler dyrket i fravær av DOX. Den paren HCT116-cellelinjen tjente som negativ kontroll, mens TGF-SS1 responsive HepG2-celler ble anvendt som en positiv kontroll. Total SMAD2 har vært brukt som en lasting kontroll. (B) Target gentranskripsjon av TGFBR2 signalering. Real-time RT-PCR eksperimenter viste DOX avhengige
SMAD7 Hotell og
SERPINE
oppregulering. Data er vist for HCT116-TGFBR2 klone # 5, men også gjelde klone # 22 (data ikke vist). Verdier representerer de hjelp av tre uavhengige forsøk ± SD
TGFBR2 avhengig Glycan Endringer
Siden vi ikke oppdage eventuelle endringer i steady state nivåer av celleoverflateproteiner av lektin-FACS analyse (figur S2) og lektin-Western blotting (figur S3), utførte vi radioaktiv merking eksperimenter ved hjelp av to uavhengige
3H-merket monosakkarider, ManNAc og L-fucose. Med denne tilnærmingen fokuserte vi våre målinger på nylig syntetiserte glykoproteiner. I innledende forsøk, ble ulike tidsperioder (24h, 48h og 72H-enheten) undersøkt. Inkorporering av
3H-ManNAc, en forløper av sialinsyre, økt over tid med en topp ved omtrent 72 timer. Ved DOX eksponering og tilsetning av TGF-SS1 i 72 timer, en signifikant reduksjon av inkorporert
3H-ManNAc forekom i begge TGFBR2 kloner, men ikke i den paren Tet-On cellelinje (figur 4A). Derfor analyserte vi alle 20 kjente sialyltransferaser og to sialidases (Neu1 og Neu3) i real-time RT-PCR på 24t, 48t og 72t etter induksjon (tabell S2). Men vi var ikke i stand til å oppdage eventuelle endringer i mRNA uttrykk nivåer (figur S4). Re-ekspresjon av TGFBR2 førte til en betydelig reduksjon i protein fucosylation i en av begge kloner ved hjelp av
3H-L-fukose (figur 4B). Disse resultatene tyder på at TGFBR2 regulerer sialylering av
de novo
proteiner.
radioaktiv merking ble utført i nærvær og fravær av DOX (0,5 ug /ml) og ved eksponering for TGF-SS1 ( 10 ng /ml) i 72 timer. (A) Inkubasjon med
3H-ManNAc resulterte i en betydelig reduksjon av innlemmet ManNAc i TGFBR2 kloner # 5 og # 22, men ikke i foreldre HCT116-Tet-On cellelinje. (B) Innblanding av
3H-L-fukose ble svakt redusert i nærvær av DOX i begge TGFBR2 kloner i motsetning til HCT116-Tet-On-celler. Verdiene representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter ± SD
SS1-integrin Ekspresjon og sialylering
Siden det er kjent at SS1-integrin er et meget sialylert protein hvis ekspresjon blir endret av TGF -ß1 [38], neste undersøkte vi om SS1-inte sialysering kan bli påvirket av TGFBR2 uttrykk og signalering. Basert på vår iakttagelse at TGFBR2 ser ut til å modulere bare sialylering av
de novo
proteiner, utførte vi radioaktiv merking med to eksperimenter (
3H-ManNAc og
35S-L-metionin) for å bestemme inkorporering av sialinsyre og som en kontroll syntese av SS1-integrin i TGFBR2-induserte celler (figur 5). Når du har merket i 72 timer, ble cellene høstet og SS1-inte var immuno-utfelt. Mens rekonstituerte TGFBR2 signale førte til øket ekspresjon av SS1-integrin mRNA (to ganger) (ikke vist) og protein som bestemt ved metabolsk merking (figur 5A), inkorporering av ManNAc viste en TGFBR2 avhengig reduksjon (figur 5B). Ved å normalisere sialinsyre inkorporering til SS1-integrin syntese virkningen av TGFBR2 på SS1-integrin kan bli illustrert mer påfallende, vist i figur 5C. For å bestemme hvorvidt virkningen av TGFBR2 på SS1-integrin uttrykk er på grunn av en effekt av endret sialylering på SS1-integrin stabilitet, ble en puls-chase eksperimenter utført. Som antydet på figur 5D halveringstiden av SS1-integrin-proteinet var omtrent 16 timer og dette omsetningshastigheten var uendret i nærvær eller fravær av TGFBR2 uttrykk. Samlet er disse data tyder på at TGFBR2 signale regulerer sialylering av
de novo
proteiner generelt og av SS1-inte spesielt uten å påvirke omsetningen.
(A-C) Dual merking av celler med
3H-ManNAc og
35S-L-metionin ble utført i nærvær og fravær av DOX (0,5 ug /ml) og i nærvær av TGF-SS1 (10 ng /ml) i 72 timer.
