Abstract
Aberrant glykosylering av slimstoffer og andre ekstracellulære proteiner er en viktig begivenhet i kreftutvikling og de resulterende kreft forbundet glykaner har blitt foreslått som mål i kreft immunterapi. Vi vurderte rollen til O-bundet glykosylering GalNAc på antigen-opptaket, behandling og presentasjon av MHC klasse I og II molekyler. Effekten av GalNAc O-glykosylering ble overvåket med et modellsystem basert på ovalbumin (OVA) -MUC1 fusjonspeptider (+/- glykosylering) applisert på dendrittiske celler ko-dyrket med IL-2 sekresjon OVA peptid-spesifikke T-celle-hybridomer. For å evaluere
in vivo
svar på en kreftrelatert tumor antigen, Balb /c eller B6.Cg (CB) -Tg (HLA-A /H2-D) 2Enge /J (HLA-A2 transgene) mus ble immunisert med en ikke-glykosylert eller GalNAc-glykosylert MUC1 avledet peptid, etterfulgt av sammenligning av T-celleproliferasjon, IFN-γ frigivelse, og antistoffinduksjon. GalNAc-glykosylering fremmet fremstilling av OVA-MUC1 fusjonspeptider av MHC klasse II-molekyler og antigen-fremkalte MUC1 spesifikk Ab produksjon og T-celle-proliferasjon i begge Balb /c og HLA-A2-transgene mus. I motsetning til dette, GalNAc-glykosylering inhiberte fremstilling av OVA-MUC1 fusjonspeptider av MHC klasse I og opphevet MUC1 spesifikke CD8 + -T-celleresponser i HLA-A2-transgene mus. GalNAc glykosylering av MUC1 antigen letter opptaket derfor MHC klasse II presentasjon, og antistoffrespons, men kan blokkere antigen presentasjon til CD8 + T-celler
Citation. Madsen CB, Petersen C, Lavrsen K, Harndahl M, Buus S , Clausen H, et al. (2012) Kreft Associated Aberrant Protein O-glykosylering kan endre Antigen Processing og immunrespons. PLoS ONE 7 (11): e50139. doi: 10,1371 /journal.pone.0050139
Redaktør: Isaac Yang, UCLA, USA
mottatt: May 1, 2012; Godkjent: 17 oktober 2012; Publisert: 26.11.2012
Copyright: © 2012 Madsen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble støttet av Novo Nordisk Foundation, den danske Medical Research Council, den danske Cancer Research Foundation, de Agnes og Poul Friis Foundation, den danske Kreftforeningen, Københavns universitet (Program of Excellence), EU-FP7, dansk Agency for Science og teknologi og innovasjon (FTP). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft vaksiner holde store løftet for langvarig terapeutisk effekt [1]. Nåværende eksperimentelle kreftvaksiner primært sikte på å lokke fram cellulær immunitet gjennom induksjon av bestemte CD8 + T-celler [2] – [5]. Imidlertid økende bevis demonstrerer verdien av antistoff i tumor utrydding [6], [7]. Følgelig er det en økende interesse for å designe vaksiner som kan aktivere både CD4 + og CD8 + T-celler og derved samtidig fremkalle humoral og cellulær immunitet kreft [8]. Endrede proteiner som presenteres på kreftceller er viktige tumorantigener, som kan være målrettet av vaksiner og terapeutiske antistoffer. De fleste celleoverflateproteiner er glykosylert, og ondartet transformasjon av celler er alltid ledsaget av endringer av posttranslational modifikasjoner av proteiner [9]. Aberrant mucin-type O-glykosylering representerer en av de mest tallrike posttranslational kreft forbundet endringer skaper et variert sett av molekylære strukturer som finnes på overflaten av kreftceller, men ikke på normale celler [9], [10]. Som et resultat av den spesifikke mønster av kreft forbundet korte glykan strukturer på cancerassosierte proteiner som frembringer nye glykopeptid epitoper som kan bli målrettet ved å immunsystemet [11], [12].
Kreft assosiert glykaner påvirke kreft immunitet på flere måter. De avvikende glykaner er immunogen av seg selv, og avkortede O-glykaner (TN: GalNAc-S /T, STN: NeuAcα2,6GalNAc-S /T, og T: Galβ1,3 GalNAc-S /T) er anerkjent som pan-karsinom antigener hvortil sirkulerende antistoffer er funnet ved høyere nivåer i kreftpasienter. Avvikende glykaner kan også føre til nye epitoper på proteinene ved å forårsake konformasjonsendring eller ved etablering av nye O-glycopeptide epitoper [13], [14]. I tillegg kan kreft assosiert glykaner inngå i utformingen av immunogene epitoper som kan indusere
in vivo
anti-tumor immunresponser [15]. Et viktig grunnlag for sukker indusert immunitet er at avvikende glykaner kan binde lektin reseptorer. For eksempel, makrofag galaktose bindende lektin (MGL) -mediates opptak av spesifikke O-glykoproteiner i dendrittiske celler [10], [16]. Faktisk, dendrittiske celler er de mest potente antigenpresenterende celler for grunning av naive CD8 + og CD4 + T-celler. De bærer en rekke karbohydrat reseptorer av lektin familien C-typen (oversikt i [17]), og har en enestående evne til å tverrliggende ekstracellulære antigener til CD8 + T-celler [18]. Den selektive opptaket av GalNAc-glykosylert antigener (Tn-antigener) ved den vanlige humane og murine dendrittcelle (DC) C-type lektin MGL, [19], [20], blir det mulig å fremkalle kreft spesifikk glykopeptid antistoffer i mus og menneske ved induksjon av et CD4 + Th-celler [11], [13], [14], [21]. Slik Tn-glykopeptid spesifikke antistoffer formidle antistoffavhengig cytotoksisitet [11], [12], [22], [23], og forekomsten av naturlige glykopeptid spesifikke antistoffer hos kreftpasienter er foreslått å være assosiert med økt overlevelse [21]. I motsetning til svært få CD8 + T-celler rettet mot glykopeptidepolymerenhetene epitoper av ekstracellulære tumorantigener (f.eks slimstoff 1 (MUC1)) har blitt beskrevet [24], [25].
kreft assosiert glykoprotein MUC1 er en viktig modell molekyl i kreft immunterapi og er abnormt glykosylert i de fleste adenokarsinomer [26]. Det ekstracellulære domene av MUC1 består av 20-120 tandemrepetisjoner (VNTR), hver inneholdende 20 aminosyrer med 5 mulige O-glykosyleringsseter [27]. Immunisering av B6.Cg (CB) -Tg (HLA-A /H2-D) 2Enge /J (HLA-A2 transgene mus) [28] og sjimpanser [29] med ikke-glykosylert MUC1 antigener har utløst MUC1 peptid spesifikke CD4 + og CD8 + -T-celleresponser og flere CD8 + T-celle epitoper er blitt identifisert i de ekstracellulære og intracellulære domener av MUC1 [28], [30] – [33]. I MUC1 transgene mus responsen på ikke-glykosylert MUC1 peptid-baserte vaksiner har imidlertid vært meget lav med liten eller umulig å oppdage CD4 + og CD8 + -T-celleresponser [34], [35]. Ikke-glykosylert MUC1 peptid konjugert til den immunogene glykokonjugat mannan fremkalte sterke immunresponser, inkludert CD8 + -T-celler [31]. Hos mennesker har de ikke-glykosylert MUC1 peptid vaksiner primært utløste humorale og CD4 + T-celle responser [36] – [38], mens virus og DC baserte vaksiner har også generert cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) responser [39] – [44] . Induksjon av CD8 + T-celler ble observert bare i noen få pasienter eller etter flere runder med re-stimulering
in vitro product: [39] – [44], men flere av de vaksiner har vist effekt, om enn begrenset [38 ] – [41], [44] – [57]. To virusvaksiner som uttrykker MUC1, enten i kombinasjon med IL-2 (TG4010) [41], [48] – [51], eller i kombinasjon med carcinoembryonic antigen (PANVAC) [52], har vist klinisk effekt i pasienter med ikke små celle lunge og bukspyttkjertel [39] – [41], [48] – [52]. I tillegg har kliniske effekten også blitt demonstrert med den liposomale vaksine (BLP25) som består av en 25-mer ikke-glykosylert peptidet fra MUC1 tandem repeterende regionen [53] – [57]. Interessant, i en liten klinisk studie i tidlig stadium brystkreft pasienter vaksinert med mannan-MUC1, vaksinen forårsaket både humorale og T-celle responser til ikke-glykosylert MUC1 og eliminert tilbakefall av sykdommen [45].
De fleste tidligere vaksiner har målrettet ikke-glykosylert MUC1, selv om dette kanskje ikke er det mest kreftspesifikke mål. Målretting av kreft forbundet glykopeptid epitoper i MUC1 som GalNAc-MUC1 [11], [12], [58] ville være gunstig, men biosyntese av MUC1 glykopeptid epitoper uttrykt av tumorer har vært hemmet av mangel på relevante teknologier og høye kostnader. Således er det for tiden ikke klart hvordan glykaner vil påvirke opptak, presentasjon, gjenkjennelse, og induksjon av immunresponser til CD8 + T-celle epitoper. Selv om tilstedeværelsen av glykaner kan ha en positiv effekt på opptaket av glykosylert antigener [19], [20], [59], glykaner kan kompromittere inntreden i immun proteasome [60], proteasomal cleavage, TAP-mediert trans, og peptid lasting på MHC klasse i molekyler [60], [61].
i denne studien har vi undersøkt konsekvensen av MUC1 GalNAc-glykosylering på kjente CD8 + og CD4 + T-celle aktivering antigener. Vi tok fordel av ovalbumin modellsystemet ved hjelp av OVA-MUC1 fusjonspeptider inneholder immunodominant MHC klasse I (SIINFEKL) og MHC klasse II (ISQAVHAAHAEINEAGR) OVA epitoper som avlesning for antigen opptak og behandling. Epitopene ble flankert av GalNAc glykosylerte eller ikke-glykosylerte MUC1 avledede peptidsekvenser. I tillegg, undersøkte vi effekten av GalNAc glykosylering av et fysiologisk tumorassosierte MUC1 glykopeptid kjent for å indusere CD4 + og CD8 + T-celleresponser. Dette peptid (AHGVTSAPDNRPALGSTAPPVHNV) har nær sekvens homologi med tandem gjentakelse av MUC1, men inneholder en HLA-A2 epitop mangler i tandem repeat. Vi presenterer data tyder på at GalNAc rester hjelp antigen opptak og MHC klasse II presentasjon for generering av et potent cancer-spesifikk antistoffrespons, og blokk presentasjon til CD8 + T-celler.
Resultatene
GalNAc- glykosylering Forbedrer CD4 + T-celleresponser
Vi først undersøkt rollen til GalNAc-glykosylering på peptidantigen prosessering og presentasjon peptid på MHC klasse II-molekyler (figur 1). Den potente I-A
b binding OVA peptidet ble kondensert til en MUC1 avledet sekvens med og uten GalNAc-glykosylering (tabell 1), og ble applisert på DC som ble ko-dyrket med ovalbumin peptid /MHC klasse II-komplekset spesifikke T-celle-hybridomer. DC lastet med glykopeptider økte OVA spesifikke CD4 + T-cellehybridomen respons til OVA avledet peptid sammenlignet med ikke-glykosylerte peptid, uavhengig av hvor de OVA-epitopen ble plassert i peptid-sekvensen (figur 1B). Peptider inneholdende fire GalNAc-rester induserte en høyere respons enn peptider inneholdende to GalNAc-rester [62], [63] (figur 1B). Selv meget lave konsentrasjoner (30 nM) av glykopeptider stimulerte CD4 + T-cellehybridom, mens lave konsentrasjoner av den ikke-glykosylerte peptid induserte ingen respons (data ikke vist).
A) O-glykan syntese oversikt. B) IL-2-produksjon fra OVA spesifikke CD4 + T-cellehybrid (BO.97.10) co-kultivert med benmarg avledet DC pulsert med to peptid varianter med og uten 2 og 4 sukkerrester (GalNAc). Full lengde OVA anvendt som en positiv kontroll. Individuelt dyrkede T-celler og DC hadde en OD verdi lik bakgrunnen.
GalNAc glykosylering Hemmer bearbeiding og presentasjon av en MHC klasse I Binding Peptide
in vitro
den samme modellen systemet ble brukt for å undersøke påvirkning av GalNAc glykosylering på MHC klasse i presentasjonen.
In vitro
generert, samt renset CD11c + milt DC, var lastet med GalNAc glykosylert eller ikke-glykosylert MUC1-SIINFEKL fusion peptider (tabell 1). I motsetning til de resultater som ble oppnådd med MHC klasse II-presentasjon, GalNAc glykosylering av MUC1-SIINFEKL resulterte i lavere aktivering av SIINFEKL /H2-K
b spesifikke T-celle-hybridomer sammenlignet med ikke-glykosylerte peptider uavhengig av opprinnelsen til DCS (Figur 2A-B). Vi testet neste hvordan plasseringen av sukkerrester i forhold til MHC klasse I bindende epitop påvirket CD8 + T-cellerespons. DC ble stimulert ved hjelp av fusjonspeptider med SIINFEKL enten flankert av glykosyleringsseter eller lokalisert til den C-terminale ende av peptidet. Fusjonspeptider med terminal SIINFEKL viste en økt T-cellehybridom respons sammenlignet med fusjonspeptid SIINFEKL lokalisert inne i MUC1 gjenta uansett om peptidene var glykosylert eller ikke. Strømningscytometrisk analyse av SIINFEKL /H2-K
b kompleks på DC etter peptid behandling bekreftet lavere MHC klasse I presentasjon av GalNAc-glykosylerte peptider sammenlignet med ikke-glykosylerte peptider (figur 2C-E).
IL-2-produksjon fra OVA spesifikke CD8 + T-cellehybridom (RF 33,70) ko-dyrket med benmargs avledet DC (A) eller CD11c + DC renset fra musemilt (B). DC ble pulset med to peptid varianter med og uten 2 og 4 sukkerrester (GalNAc). Full lengde OVA ble anvendt som en positiv kontroll. Individuelt dyrkede T-celler og DC hadde en OD-verdi lik til bakgrunnen. C, D) Overflate ekspresjon ved strømningscytometri av SIINFEKL i H2kb peptid-bindende spor på DC etter pulsering med de to peptid-varianter (ikke-glykosylerte peptid (tynn lilla stiplet linje), peptid med 2 GalNAcs (tykk grønn linje), eller 4 GalNAcs (rosa linje)). E) Surface uttrykk for SIINFEKL i H2kb peptid binding sporet på DC uten å pulsere (blå linje) og etter pulserende med OVA kontroll (lilla linje). Grå histogrammet representerer celler farget bare med sekundært antistoff.
GalNAc glykosylering av en MUC Avledet Antigen utløser spesifikke IgG antistoffer og T-celle spredning
in vivo
amino syresekvensen av de 24 mere syntetiske MUC1 peptid (degMUC1) ligner den MUC1 tandem gjentagelse, er imidlertid dets aminosyresekvens litt endret som resulterer i en HLA-A2-epitopen (ALGSTAPPV) [28]. DegMUC1 er derfor optimal for inkludering i humane kreftvaksiner som tar sikte på å fremkalle MUC1 spesifikke CTL-responser. For å undersøke rollen til GalNAc glykosylering
in vivo
for denne MUC1 modellen tumorantigen, immunisert vi Balb /c-mus og HLA-A2-transgene mus med degMUC1 med og uten glykosylering GalNAc. Balb /c-mus immunisert med GalNAc-glykosylert degMUC1 utviklet en sterk IgG respons spesifikk for degMUC1, mens det ikke var noen respons hos mus immunisert med ikke-glykosylert degMUC1 (figur 3A). Vaksinasjoner med KLH-konjugerte glykosylerte og ikke-glykosylerte degMUC1 resulterte i en IgG-respons i begge musestammer, skjønt den glykosylerte variant resulterte i en mer fremtredende respons (data ikke vist). I overensstemmelse med den humorale IgG respons, Balb /c-mus immunisert med GalNAc degMUC1 fremkalte betydelig T-celleformering etter re-stimulering med enten GalNAc eller ikke-glykosylerte degMUC1 (P≤0,0004). Ingen T-celleformering ble detektert i mus immunisert med ikke-glykosylert degMUC1 (figur 3B). Lignende, ble en høyere proliferativ respons fremgår av HLA-A2-transgene mus immunisert med glykosylert i forhold til ikke-glykosylerte degMUC1 bekrefter den positive effekten av GalNAc glykosylering på CD4 + T-celle-reaktivitet og humoral immunrespons (figur 3C). Som en kontroll tuberkulin renset protein-derivat (PPD) stimulering resulterte i tilsvarende T-celle-proliferasjon i begge grupper av HLA-A2-transgene mus.
A) Serum reaktiviteten til forskjellige glykoformer mucin fra Balb /c-mus immunisert med degMUC1 + /- GalNAc ved hjelp av ELISA. Dataene er representative for et minimum av 4 Balb /c mus immunisert med hvert antigen. (B) T-celle-proliferasjon av mus Balb /c-mus eller (c) HLA-A2-mus immunisert med GalNAc degMUC1 (hvite streker) og ikke-glykosylert degMUC1 (grå søyler) for hvert peptid som brukes til
in vitro
re-stimulering (100 ug /ml) som angitt på x-aksen. D) Lymfocytter fra immuniserte HLA-A2-mus pulsert med de ni mer degMUC1 peptid, ALGSTAPPV, med og uten glykosylering. DegMUC1 spesifikke CD8 + T-celler ble selektert på grunnlag av anti-CD8 Ab (x-aksen) og anti-IFNy Ab (y-aksen) etter 4 timers Golgi stopp behandling. E) Miltceller etter 24 dager med re-stimulering med den ikke-glykosylert ALGSTAPPV peptid. Alle T-celle data genereres fra milt eller lymfeknuter fra minst 4 mus, men i de fleste tilfeller 6 mus.
GalNAc glykosylering av en MUC1 Avledet Antigen Block CD8 + T celle respons
i vivo
Vi neste undersøkte CD8 + T celle respons etter immunisering av HLA-A2 transgene mus med degMUC1 (+/- GalNAc glykosylering) etterfulgt av re-stimulering med degMUC1 9 mer CD8 + epitop ALGSTAPPV (+ /- GalNAc glykosylering). Bare de mus som ble immunisert og re-stimulert med ikke-glykosylert degMUC1 peptid generert IFN-γ produserende, ALGSTAPPV spesifikk, CD8 + -T-celler, mens det ikke ble sett hos mus immunisert med de GalNAc glykosylerte degMUC1 (figur 3D). T-celler fra immuniserte mus ble utvidet ved å re-stimulering
in vitro
for en total av 24 dager med ALGSTAPPV bekrefter at bare de mus immunisert med de ikke-glykosylerte degMUC1 reagerte for å re-stimulering med ALGSTAPPV (figur 3E) . Deretter analyserte vi stabilitet og tilhørighet av HLA-A * 02:01-ALGSTAPPV kompleks med og uten GalNAc glykosylering. HLA-A * 02:01-ALGSTAPPV Komplekset hadde en halveringstid på 19 timer og en affinitet på 100 nM, mens den HLA-A * 0201-ALGST [GalNAc] APPV Komplekset hadde en halveringstid på 11 timer med en affinitet på 300 nM. Således ALGST [GalNAc] APPV er fremdeles et fast mellomliggende bindemiddel, og bør være i stand til å fremkalle en CD8 + T-cellerespons basert på MHC binding data.
High Density GalNAc Glykosylering øker opptak av MUC1 og MUC2 peptider, men hemmer MHC klasse i Presentasjon
Tetthet av glykosylering kan påvirke opptaket formidles av lektin reseptorer, som MGL. Derfor spekulert vi at mangelen på CD8 + T-cellerespons mot GalNAc degMUC1 peptider kan være forårsaket av lavt opptak av de korte GalNAc modifiserte MUC1 peptider. Selv om et begrenset antall av GalNAc-rester er nok til å indusere en potent I-Ab respons, kan det være utilstrekkelig for et innlegg presentasjon som kreves for å indusere en H-2K
b respons. For å teste effekten av GalNAc tetthet vi pulset DC med GalNAc-glykosylert biotinylated 60 merMUC1-peptid som dekker tre MUC1 tandem repetisjoner (60 merMUC1). Mens GalNAc inkorporering ikke øke opptaket av monomer form av 60 merMUC1, økt opptak ble observert når kompleksdannelse ble indusert ved streptavidin (data ikke vist). Deretter testet vi opptak av fluoriserende perler belagt med MUC1 med og uten glykosylering. Kuler belagt med GalNAc MUC1, som gir en meget høy tetthet av GalNAc MUC1, resulterte i en markert økning i opptak sammenlignet med ikke-glykosylert MUC1 (figur 4A). Effekten av flere GalNAc rester på DC opptak bedt oss om å teste om syntetiske peptider som inneholder flere GalNAc rester kan overvinne mangelen på korset presentasjon av CD8 + T-celle epitoper observert med kortere MUC1 peptider. En MUC2 fusjonspeptid som inneholder flere GalNAc glycosylations sider er utformet og
in vitro
glykosylert for å fremstille et peptid med og uten 9-10 GalNAc rester lokalisert i MUC2 sekvensen. Den GalNAc MUC2 fusjonspeptid ble lett tatt opp av DC (figur 4B). Imidlertid GalNAc glykosylering likevel inhibert overflate ekspresjon av SIINFEKL /H2-K
b komplekser og T-cellehybridom-aktivering var lavere (figur 4C-D). Avbildning av internalisert MUC2 fusjonspeptid med og uten GalNAc bekreftet økt opptak av GalNAc-glykosylerte peptid med DC (figur 4E-F). Den GalNAc MUC2 peptid overveiende samlokalisert med lysosomal markør LAMP-2, mens ikke-glykosylert MUC2 fusjon peptid overveiende samlokalisert med tidlig endosomal markør EØS-en (figur 4E-F, figur S1). I konklusjonen, øker GalNAc glykosylering opptak, men hindrer behandling av de to fusjonspeptider inneholder MHC klasse I bindende epitoper.
A) DC opptak av ubestrøket fluoriserende perler, MUC1-fluoriserende perler, eller GalNAc MUC1 fluoriserende perler. DC uten perler ble anvendt som referanse. B) Opptaket av MUC2 fusjonspeptid +/- GalNAc ble evaluert ved flow cytometri etter 48 timer med peptid pulsing. Ufargede DC (lilla fylt) og DC uten peptid belastning (grønn) ble brukt som bakgrunn kontroll. C) Evaluering av overflate-ekspresjon ved strømningscytometri av SIINFEKL i H2kb peptid-bindingen spor. DC ble pulset med MUC2 fusjon peptid (høyeste konsentrasjon fra D) med GalNAc (grønn linje) og uten GalNAc (lilla fylte) 48 timer før farging. D) IL-2-produksjon fra SIINFEKL spesifikke CD8 + T-cellehybridom (RF 33,70) ko-dyrket med benmarg-avledede DC pulset
in vitro
i to dager med MUC2 fusjonspeptid både med og uten glykosylering på en konsentrasjonsgradient . Full lengde OVA ble anvendt som en positiv kontroll. Representative data for minst to uavhengige forsøk er vist. E, F) Confocal avbildning av DC internalisert GalNAc MUC2 fusjon (E, grønn) og MUC2 fusion (F, grønn) co-farget med endosomal markør EØS-en (rød) og lysosomal markør LAMP-2 (rød).
Diskusjoner
kreft~~POS=TRUNC forbundet avvik glykaner representerer potente tumorantigener [11], [12]. Ved hjelp av MUC1 og ovalbumin som modellmolekyler presenteres data som tyder på at glykosylering GalNAc øker antigen opptak, MHC klasse II-presentasjon, og CD4 + T-celleaktivering indusere potente antistoffresponser. I motsetning til dette, kan GalNAc glykosylering hemme MHC klasse I antigen presentasjon og aktivering av antigen-spesifikke CD8 + T-celler.
Det er klart at GalNAc glykosylering potenserer antistoffresponser og T-celleproliferasjon etter immunisering med en GalNAc modifisert MUC1 peptid ( degMUC1) (Figur 3A). En forklaring på dette GalNAc induserte antistoffrespons
in vivo
er sannsynlig å være økningen i antigenpresentasjon, og etter T-cellestimulering observert ved GalNAc glykosylering av modell peptid degMUC1 inneholdende en OVA avledet IA
b bindende peptid (figur 1). Dette er i tråd med våre tidligere funn av sterke IgG respons på GalNAc MUC1 i menneskelige MUC1 gene mus [11], [12] og kreftpasienter [13], [14]. Videre er det i overensstemmelse med forbedrede CD4 + T-celleresponser til OVA konjugert til GalNAc rester i andre studier [59]. Evnen til GalNAc til å bryte immunologisk toleranse og for å hjelpe til generering av en CD4 + T-celleavhengig humoral immunrespons er av særlig viktighet i cancer immunoterapi med sikte på å generere IgG-antistoffer. Dessuten har den spesifikke induksjon av CD4 + T-celler blitt foreslått å føre til tumor utrydding av forsinkede overfølsomhetsresponser [64] og nylig kreftpasienter har blitt kurert etter adoptiv overføring av CD4 + T-celler med svulst reaktivitet [65].
immunodominant H2-K
b bindende peptid SIINFEKL, avledet fra OVA, ble brukt som avlesning for MHC klasse i presentasjonen. Her, GalNAc glykosylering av den flankerende MUC1 peptidet inhibert MHC klasse I presentasjon av SIINFEKL på DC, så vel som aktivering av en spesifikk CD8 + T-cellerespons (figur 2). I samsvar med disse funn GalNAc glykosylering hemmet induksjon av CD8 + T-celleresponser
in vivo
etter immunisering av HLA-A2-transgene mus med et GalNAc glykosylert degMUC1 peptid inneholdende den HLA-A * 02:01 bindende epitop (ALGSTAPPV ) sammenlignet med den ikke-glykosylert variant (figur 3D-E). Dette kan delvis forklares ved den reduserte stabiliteten til HLA-A * 02:01-ALGSTAPPV kompleks når peptidet er GalNAc-glykosylert. Men selv om HLA-A * 02:01 bindingsaffinitet og stabilitet av GalNAc-glykosylerte peptid er svakt redusert det vises fortsatt til å binde seg på et nivå som er tilstrekkelig for immunogenisitet. Dermed våre observasjoner foreslå alternative forklaringer. En mulighet er at glykopeptider endre DC-aktivering, for derved å endre T-celle-aktivering. For å understøtte dette har det blitt vist at selektive glykoformene MUC1 indusere T-celletoleranse [66]. Men den hemmende effekt finner sannsynligvis sted i løpet av behandlingen, siden mindre peptid /MHC-komplekser nådde overflaten av DC. Således kan effekten av GalNAc på CD8 + T-cellerespons være grunn av hemming av proteasomal spaltning. Denne forklaringen har også blitt bekreftet av biokjemiske studier av spalting av MUC1 peptider av renset immunoproteosomal enzymer [60]. I denne studien glykosylering på både -VTS- og -GST- områder i MUC1 tandem repeat sekvens (VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG) resulterte i totalt blokk av antigen prosessering, mens GalNAc glykosylering i bare ett av disse områdene hemmet antigen prosessering. Dette ville forklare vår delvis presentasjon av CD8 + epitop, SIINFEKL, når bare to GalNAcs var tilstede i SIINFEKL-MUC1 fusjonspeptid, mens glykosylering med fire GalNAcs per gjentakelse fører til en nesten total blokk av presentasjonen. I overensstemmelse med våre
in vitro
funn, har det blitt demonstrert at CD8 + T-cellefunksjonen er inverst korrelert med graden av glykosylering av det MUC1 proteinet anvendt for priming av CD8 + -T-celler [67]. Dette underbygger at glykosylering kan representere et problem i CD8 + T-celleinduksjon.
Økt antigen opptak av APCer er av stor betydning for å bestemme T-celleresponser [19], [20]. Det har blitt demonstrert at GalNAc MUC1 belagt på fluorescerende mikroperler blir internalisert av humane DC via binding til makrofag-galaktose-type C-type lektin (MGL) og leveres til HLA-klasse 1 og 2 oppbevaringsrom innenfor DC [19], [20] . Det har også blitt vist at GalNAc konjugert OVA protein mål MGL og gir et bedre opptak og CD8 + T-cellerespons [59]. Dette er i kontrast til våre funn med små peptidantigener. Den glykosylering tetthet kan delvis forklare dette. Fra resultatene er det klart at tett glykosylert 60 mer MUC1 i kompleks med streptavidin og belagt på mikroperler induserte markert øket opptak (figur 4A). For å teste om innføring av multiple GalNAc rester øket CD8 + T-celleaktivering, laget vi en tett glykosylert MUC2 fusjonspeptid med en spaltbar linker mellom de to peptid-elementer [68], [69]. MUC2 ble valgt fordi den har flere glykosyleringsseter med mye høyere tetthet enn MUC1 resulterer i et peptid med mer enn dobbelt så mange GalNAc rester på 25 aminosyresekvens. Som forventet, ble GalNAc MUC2 fusjons tatt opp mer effektivt enn ikke-glykosylert motstykke (figur 4B). Dette ble imidlertid ikke reflektert i aktivering av spesifikke CD8 + T-celler eller peptid /MHC overflate-ekspresjon (figur 4C-D). Antagelig den tette GalNAc glykosyleringsseter blokker CD8 + T-celleaktivering, enten ved å inhibere antigen behandling eller ved å dirigere immunogenet til ikke-MHC I kammere. Støtte til sistnevnte, konfokal mikroskop bildebehandling demonstrert samlokalisering av internalisert GalNAc MUC2 fusjonsprotein med LAMP-2. I motsetning til dette, ikke-glykosylert MUC2 samlokalisert med den endosomale tidlig markør EAA-1 (figur 4E-F, figur S1). Det bør imidlertid bemerkes, at en robust induksjon av GalNAc-MUC1 og MUC1 spesifikke CTL har blitt rapportert i murine studier ved hjelp av en TLR-2 agonist adjuvans koblet til en polio-avledet T-hjelper epitop og et enkelt GalNAc glykosylert tandem gjenta MUC1 [70 ]. Graden og lokalisering av glykaner, inkluderingen av hjelper epitoper, og ruten for opptak er av stor betydning for immunresponsen.
Som konklusjon, tyder våre data på at aberrant GalNAc O-glykosylering kan hemme dannelse av en cancer spesifikk CD8 + T celle respons til tross for økt antigen opptak av DC. Dette kan være en potensiell fallgruve for utforming av MUC1 rettet mot kreftvaksiner. Opprettelsen av fusjonspeptider med to eller flere CD4 + og CD8 + T-celleantigener, i hvilke spesifikke cleavage og prosessering nettsteder har blitt innført, kan løse dette problemet. Imidlertid kan slike fremgangsmåter vise seg å være vanskelig på grunn hemming av CD8 + T-celleresponser er blitt observert selv når GalNAc residuer ble separert fra den CD8 + T-celle-epitop med en linkersekvens. I konklusjonen, kan GalNAc glykosylering av peptid antigener øke produksjonen av CD4 + T-celle responser, men hemme CD8 + T-celle responser.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyr forsøkene ble godkjent av den lokale dyre anlegget og den danske Fødevare Administration med godkjenningsnummer: 2008 /561-1460. Dyrene ble overvåket daglig etter injeksjonen for å oppdage eventuelle uønskede bivirkninger og avlivet ved cervikal dislokasjon ved slutten av forsøket.
Peptider
MUC1 60 mer-peptid (VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG
)
3 med og uten biotinylering (Bio) ble oppnådd som tidligere beskrevet [19], MUC2 (ITTTTTVTPTPTPTGTQTPTTTP), MUC2 fusjon peptid (Biotin-PTTTPITTTTTVTPTPTPTGTQTPTAAAAAAPSIINFEKL), degenerert (grader) MUC1 24 mer (AHGVTSAPDNRPALGSTAPPVHNV), 9 Meric peptid ALGSTAPPV og OVA-MUC1 fusion peptider (Tabell 1) ble kjøpt fra Schafer-N (Danmark) og glykosylert
in vitro
bruker rekombinante humane glycosyltransferases GalNAc-T2, T4 og -T11 som tidligere beskrevet [12]. Konsentrasjoner av alle peptider ble ekvilibrert ved HPLC standardkurver og nedbrytning av peptidene i serum var ubetydelig for den aktuelle 48 timers periode (data ikke vist). KLH konjugerte peptider ble fremstilt som tidligere beskrevet [11].
Måle peptid-MHC-I Affinity og stabilitet
peptid-HLA-A * 0201-affinitets-målinger ble utført ved anvendelse av et homogent AlphaScreen baserte analysen [71]. pMHC-I stabilitet ble målt ved anvendelse av et homogent scintillasjonsproksimitetsanalyse [72]
Cellelinjer
Følgende OVA peptid /MHC-kompleks spesifikke hybridomer ble anvendt:. ISQAVHAAHAEINEAGR /IA
b kompleks spesifikk T-cellehybrid BO-97,10 [73] var en slags gave fra John Kappler og Philippa Marrack og SIINFEKL /H-2K
b kompleks bestemt B-celle hybridoma 25- D1-16 [74] var en slags gave fra Ronald D Germain (NIH). SIINFEKL /H-2Kb-komplekset begrenset T-cellehybridom RF33.70 [75] ble også anvendt. Alle celler ble holdt i RPMI 1640 med Glutamax, 100 U /ml penicillin og 0,1 mg /ml streptomycin og 10% FCS (standardmedium). Ytterligere 5% berikelse supplement ble lagt T-celle-hybridomer. Anrikningen supplement inneholder: glukose, essensielle og ikke-essensielle aminosyrer, etanolamin, Na.pyrovat, insulin, testosteron, 2-ME og linolsyre. For B-cellehybrid 5% FCS, 0,1% av SSR-3 og 5% av anrikning supplement ble tilsatt.
Mus og Immunlseringsprotokoll
Alle mus ble holdt i dyrehuset fasilitetene på Avdeling for helsefag og Medical Sciences (Københavns universitet). Alle forsøk har blitt godkjent av danske myndigheter.
