Abstract
metastaser fører til dårlig prognose i pasienter med kolorektal kreft, og det er et økende behov for nye terapeutiske mål. TMEM16A (ANO1, DOG1 eller TAOS2) er nylig blitt identifisert som en kalsium-aktiverte klorid kanal (CACC) og er rapportert å være overuttrykt i mange ondartede sykdommer; imidlertid fortsatt sitt uttrykk og funksjon i tykk- og endetarmskreft (CRC) uklart. I denne undersøkelsen, fant vi ekspresjon av TMEM16A mRNA og protein i høyt metastatisk potensial SW620, HCT116 og LS174T celler, men ikke i primær HCT8 og SW480-celler, ved hjelp av RT-PCR, western blotting og immunfluorescens merking. Patch-clamp opptak oppdaget CACC strømmer regulert av intracellulært Ca
2 + og spenning i SW620 celler. Knockdown av TMEM16A av korte hårnål RNA (shRNA) resulterte i undertrykkelse av vekst, migrasjon og invasjon av SW620 celler som oppdaget av MTT, sårhelende og Transwell analyser. Mekanistisk, ble TMEM16A utarming ledsaget av feilregulering av fosfor-MEK, fosfor-ERK1 /2 og cyclin D1 uttrykk. Strømningscytometri-analyse viste at SW620-celler ble hemmet fra G1 til S-fasen av cellesyklusen i TMEM16A shRNA-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen. I konklusjonen, våre resultater tyder på at TMEM16A CACC involvert i vekst, migrasjon og invasjon av metastatiske CRC cellene og gi bevis for TMEM16A som en potensiell narkotika mål for behandling av metastatisk kolorektal kreft
Citation. Sui Y, Sun M Wu F, Yang L, Di W, Zhang G, et al. (2014) Hemming av TMEM16A Expression Undertrykker Vekst og invasjon i Human tykktarmskreftceller. PLoS ONE 9 (12): e115443. doi: 10,1371 /journal.pone.0115443
Redaktør: Hong Wanjin, Institutt for molekylær og cellebiologi, Biopolis, USA
mottatt: 17 juni 2014; Godkjent: 23 november 2014; Publisert: 26.12.2014
Copyright: © 2014 Sui et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Natural Science Foundation of China (No. 81173109, 31471099, og 31301179), Kina Postdoktor Science Foundation (No. 2014M551198), og Jilin-provinsen helse og Family Planning Commission Project (No. 2014Q024). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje vanligste kreftformen i verden [1], [2], og metastasering er en avgjørende faktor for dårlig prognose av CRC pasienter [3]. Endringer på multippel-genet, så som aktivering av onkogener og inaktivering av tumorsuppressorgener, er involvert i utviklingen av normal kolonepitelet inn i adenom og inn i ondartet adenokarsinom [4], [5] Det er imidlertid begrenset informasjon om de molekylære endringer konferere med kolorektal kreft metastase [6], [7]. Derfor er det nødvendig å identifisere metastase-relaterte gener og deres molekylære reaksjonsveier som kan gi nye mål for behandling av metastatisk CRC.
kromosomale bånd 11q13 fragment er en av de mest hyppig forsterkede områder i humane maligniteter , slik som hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) og bryst, blære og kreftfaren [8]. Analysen av differensial uttrykket av gener som ligger i denne regionen førte til identifisering av
TMEM16A
, som også kalles
ANO1 plakater (anoctamin-1),
DOG1 product: ( oppdaget på gastrointestinal stromal tumor protein 1),
ORAOV2 plakater (oral cancer overexpressed 2) og
TAOS2 plakater (tumor-forsterket og overexpressed sekvens 2) [9], [10], [11] , [12], [13]. TMEM16A består av 26 eksoner og inneholder åtte trans segaments med N- og C-endene møtt cytoplasma og en innadgående sløyfe ligger mellom TM5 og TM6 muligens danner pore region [14].
TMEM16A har nylig vært vist seg å være en kalsiumaktiverte kloridkanal [14], [15], [16] og er mye uttrykkes i forskjellige vev, inkludert sekretorisk epitel, glatt muskulatur, sensoriske nerveceller og andre vev [17], [18]. TMEM16A spiller mange viktige fysiologiske rolle i kontrollen av epiteliale fluidtransport, vaskulær glatt muskelkontraksjon, spyttproduksjon og mage-tarm motilitet [19], [20], [21], [22]. Feilregulering av TMEM16A forårsaker menneskelige sykdommer, inkludert cystisk fibrose, hypertensjon, lungesykdommer og diaré [23], [24], [25]; knockout av TMEM16A er embryonically dødelig på grunn av tracheomalacia [26].
uttrykk for TMEM16A er oppregulert i flere krefttyper, inkludert HNSCC og esophageal, bryst og prostata kreft. Dets overekspresjon er også korrelert med utviklingen av fjern metastase og dårlig prognose av kreftpasienter med HNSCC [27], [28], [29]. Nylig TMEM16A er blitt funnet å fremme HNSCC tumorgenese og invasjon via aktivering av mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) signalveien. I tillegg har TMEM16A blitt rapportert å bidra til progresjon av kreft ved å indusere aktivering av epitelial vekstfaktor reseptor (EGFR) og kalmodulin-avhengig protein-kinase II (CAMK II) og etterfølgende aktivering av AKT og MAPK signalering i brystkreft og HNSCC [30] , [31]. Selv TMEM16A er allestedsnærværende uttrykt i gastrointestinal stromal tumor [32], er dens rolle i CRC metastaser lite undersøkt.
I denne studien, må vi først demonstrerte uttrykk for TMEM16A kalsiumaktiverte klorid kanaler (CaCCs) i forskjellige metastatics potensielle kolorektal kreft cellelinjer. Vi undersøkte videre rolle TMEM16A i SW620 celler metastaser og dens mulige molekylære mekanismen ved hjelp av korte hårnål RNA in vitro.
Materialer og metoder
Cell kultur
Den menneskelige tykktarmskreft cellelinjer HCT8, SW480, SW620, HCT116 og LS174T celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC). SW480 og SW620 ble dyrket i L15-medium (Sigma, USA). HCT8 og HCT116 ble dyrket i RPMI medium 1640 (Sigma, USA). LS174T celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Sigma, USA). Fisher rotte skjoldbruskkjertelen (FRT) celler og FRT celler transfektert stabilt med menneskelig TMEM16A ble hentet fra Alan Verkman (University of California, San Francisco, CA, USA) [33] og ble dyrket i Coon modifiserte F12 medium. Alle media ble supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Celler ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 og 95% luft.
RNA-ekstrahering og RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra cellene ved hjelp av TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens introduksjoner. Konsentrasjonen, renhet og integritet av RNA ble målt ved anvendelse av et spektrofotometer NanoDrop2000 (Thermo Scientific). Fem hundre nanogram av total RNA ble revers transkribert til cDNA ved hjelp av revers transkriptase med PrimeScriptTM RT reagenssett (Takara). CDNA-produkt ble anvendt som et templat for PCR-amplifikasjon i et totalt volum på 30 pl, og PCR-betingelsene var som følger: 94 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 30 sykluser ved 94 ° C i 30 s; 60 ° C i 30 s; og 72 ° C i 60 sek. For TMEM16A cDNA-amplifisering ble de følgende primere anvendt: forstand primer, 5′–AACGGGA CCATGCACGGCTT-3 «; antisense-primer, 5»–TGTTGTGGTGGTTGCACGGC-3 «. PCR-produktene (424 bp) ble analysert ved agarosegel-elektroforese, og β-actin tjente som en endogen kontroll for å normalisere ekspresjonsdata.
Western-blotting
Cellene ble vasket to ganger med is- kald fosfat-bufret saltvann (PBS) og løst i lyseringsbuffer (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 7,5, 1% Triton X-100 og supplementert med 1 mM PMSF). Etter protein kvantifisering, prøver inneholdende 100 ug proteiner ble denaturert og underkastet elektroforese under anvendelse av 10% SDS-PAGE og deretter overført til PVDF-membraner. Etter blokkering med 5% (vekt /volum) fettfri melk og vasking med Tris-bufret saltvann-Tween-løsning (TBST), ble membranene inkubert over natten ved 4 ° C med primært anti-TMEM16A polyklonalt antistoff (Abcam, ab53212; 1:100 ) og muse anti-β-aktin-antistoff (Cell Signaling, 1:500), respektivt. Alle andre primære antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology. Etter vasking, ble blottene inkubert med sekundært antistoff konjugert til pepperrotperoksidase (Sigma; 1:5,000) i 1 time ved romtemperatur og visualisert ved hjelp av en forbedret kjemiluminescens kit (Amersham, Little Chalfont, UK) på røntgenfilm (Millipore Corporation , Billerica, USA).
Immunofluorescensanalyse
Immunofluorescent farging ble gjennomført for å lokalisere uttrykk for TMEM16A. Kolorektal kreft celler ble dyrket over natten på foretrukne dekkglass (Fisher, USA) og faste i 15 min i 4% (w /v) Paraformaldehyde (PFA). Cellene ble deretter skylt 3 ganger med PBS i 5 minutter, permeabilisert med 0,5% Triton X-100 /PBS i 20 min og deretter inkubert i 1 time i 3% BSA /PBS-blokkeringsløsning. For å detektere TMEM16A, ble celler inkubert ved 37 ° C i 3 timer med muse-anti-humant DOG1 monoklonalt antistoff (zhongshanjinqiao, Kina; 1:50), etterfulgt av eksponering til en Cy3-konjugert anti-mus IgG sekundært antistoff (Sigma, 1 :1,000) ved 37 ° C i 1 time. For å visualisere kjerner ble cellene farget med DAPI (Sigma, St. Louis, MO, USA; 40,6- diamidino-to-phenylindole), og Dekkglass ble montert på lysbilder med antifade løsning (Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA) . Fluorescent bilder ble undersøkt og fotografert under et konfokal mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan).
Patch klemme opptak
Menneskelige kolorektal kreft celler ble sådd på dekkglass, og patch clamp opptakene ble utført ved hjelp av en EPC10 forsterker (HEKA, Lambrecht /Pfalz, Tyskland) i kombinasjon med Patchmaster (HEKA) ved romtemperatur. Pipettene ble fremstilt fra borosilikat kapillær glass ved hjelp av en mikropipette avtrekker (PC-10, NARISHIGE, Japan) og deretter brann-polert med en microforge (MF-900, NARISHIGE, Japan). Motstanden av pipettene i badoppløsningen var 2-5 Megohm. Celler ble perfusert med en badoppløsning inneholdende: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl
2, 1 mM CaCl
2, 5 mM glukose, 5 mM HEPES og 20 mM sukrose (pH 7,4 med NaOH) . For det hel-celle-konfigurasjon er null Ca
2 + intracellulære oppløsningen inneholdt følgende: 146 mM N-metyl-D-glukamin-klorid (NMDG-Cl), 2 mM MgCl
2, 5 mM EGTA og 8 mM HEPES (pH 7,4 med NMDG). Den høye Ca
2 + pipette løsning inneholdt 5 mM Ca
2 + -EGTA istedenfor EGTA (gratis Ca
2 + ca 25 mm). Forskjellige frie [Ca
2+] oppløsninger ble fremstilt ved å blande den null-Ca
2+ og høy-Ca
2 + løsninger. Cellen ble fastspent fra holdepotensialet (0 mV) til spenninger mellom -100 til +100 mV i 20 mV trinn. For innsiden ut konfigurasjon, pipetten løsningen inneholdt: 140 mM NMDG-Cl, 2 mM MgCl
2, 5 mM CaCl
2 og 10 mM HEPES (pH 7,4 med NMDG); og perfusjon oppløsningen inneholdt: 150 mM NMDG-Cl, 2 mM MgCl
2, 10 mM EGTA, 8 mM Tris og 10 mM HEPES (pH 7,4 med NMDG). Etter forseglingen motstand nådd 40 GΩ, ble membranen skåret ut, og membranpotensialet ble holdt på -50 mV. Dataene ble filtrert ved 100 Hz med en åtte-pols Bessel-filter (LPF-8, Warner Instruments, LLC, Hamden, CT, USA) og digitalisert ved hjelp av en datamaskin ved en samplingsfrekvens på 500 Hz. Nifluminsyre (NFA) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich. Alle innvendige-out patch eksperimenter ble utført ved hjelp av en rask løsning utveksling perfusjon system (SF-77B, Warner Instruments). Dødtiden av løsningen endringen var 30 ms, og dataanalyse ble utført for opptak som inneholder hele celler i en enkelt kanal med Igor programvaren som beskrevet tidligere [34].
RNA interferens
TMEM16A /ANO1 kort hårnål RNA (shRNA) og negativ kontroll shRNA plasmid ble konstruert ved GeneChem Co., Ltd (Shanghai, Kina). Området for siRNA målretting av den humane TMEM16A /ANO1 gen (GenBank NM_018043) var som følger: # 1, CGTGTACAAAGGCCAAGTA (1077-1095 nt); og # 2, CGAAGAAGA TGTACCACAT (837-855 nt). RNA interferens ble gjennomført i henhold til produsentens instruksjoner.
Celleproliferering analysen
celleproliferasjon priser ble målt ved hjelp av MTT analysen. I korthet ble 5000-celler sådd i hver 96-brønners plate i 24 timer, transfektert med TMEM16A shRNA eller egge shRNA og videre inkubert i 1, 2, 3 og 4 d, respektivt. MTT-reagens (10 pl, 500 pg /ml) ble tilsatt til hver brønn, og cellene ble ytterligere inkubert i 4 timer. Deretter ble 150 ul DMSO tilsatt for å oppløse de formazankrystaller. Antall levedyktige celler ble kvantifisert ved hjelp av absorbansen målt ved 570 nm med en mikroplateleser (Thermo Scientific, USA).
In vitro
sårheling
Cell mobilitet ble vurdert av en ripe sår analyse in vitro. Celler ble sådd ut i en 6-brønns plate inntil sammenflytende, skrapet med en steril 200-ul spiss og vasket to ganger med PBS. Etter inkubasjon med L15 medium inneholdende 1% føtalt bovint serum cellene ble fotografert ved 0 timer, 24 timer, 48 timer eller 72 timer under et invertert mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) ved en forstørrelse på 100 x. Disse forsøk ble utført i tre eksemplarer. Avstandene mellom sårkantene ble målt med en gradert linjal, og relativ scratch bredde ble bestemt av forholdet gjennomsnittlig bredde i behandlings celler versus gjennomsnittlig bredde i kontrollceller.
Cell migrasjon og invasjon analyser
in vitro
kreft celle migrasjon og invasjon aktiviteter ble evaluert i transwells, som beskrevet tidligere, med modifikasjoner [23]. SW620-celler ble dyrket i L15-medium med 10% FBS inntil konfluens i 6-brønners plater, transfektert med TMEM16A shRNA eller kryptert shRNA i 24 timer, og deretter trypsinert, vasket og tellet. For cellemigrasjon, 1 × 10
5 celler i 200 ul medium med 1% FBS ble sådd i den øvre transwellinnsatsen kammer som inneholder en polykarbonat filter (6,5 mm diameter, 8-mikrometer porer, Corning Costar, Corning, NY , USA). L15 medium (600 ul) med 10% FBS (kjemotiltrekkende) ble tilsatt til det nedre kammer, og platene ble inkubert i 72 timer ved 37 ° C i 5% CO
2. For celle invasjon, ble transwells belagt med Matrigel. Cellene som ikke vandrer ble fjernet fra toppen av transwell filtrene ved skraping. De gjennomtrenges Cellene ble fiksert med paraformaldehyd, farget med Coomassie blå og tellet under et invertert mikroskop (100 x forstørrelse). Cellen tall representert migreringsaktivitet.
Cell-syklusanalyse
Etter transfeksjon av cellene med TMEM16A eller kryptert shRNAs i 3 dager, ble cellene løsnet ved hjelp av trypsin, resuspendert i dyrkningsmedium og telt. Deretter, 1 x 10
6-celler ble vasket med PBS og fiksert over natten med 70% (vol /vol) etanol ved 4 ° C. Etter vasking to ganger med PBS, ble cellene farget med en oppløsning inneholdende 50 ug /ml PI og 100 ug /ml RNase A i 30 minutter i mørket ved romtemperatur. De fargede celler ble analysert ved flowcytometri (Beckman Coulter, Epics XL).
Statistisk analyse
Den statistiske analysen ble utført ved hjelp av SPSS statistikk (versjon 17.0) med en to-tailed Student
t
-test.
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ±
SD
.
Resultater
Uttrykk av TMEM16A i CRC cellelinjer
I denne studien, vi først oppdaget
TMEM16A
mRNA nivåer ved RT-PCR i tykktarmskreft cellelinjer HCT8, SW480, SW620, HCT116 og LS174T celler. Som vist på fig. 1A, en 424 bp-fragment av humant
TMEM16A
ble amplifisert fra SW620, HCT116 og LS174T celler og positive kontroll FRT-celler transfektert stabilt med humane
TMEM16A
, men ikke fra HCT8, SW480 celler og negativ-kontroll-null-FRT-celler. Immunoblot-analyse ved anvendelse av anti-TMEM16A polyklonalt antistoff identifiseres et omtrent 110 kDa-proteinbånd i SW620, HCT116 og LS174T celler (Fig. 1B). I motsetning til dette, TMEM16A proteinbånd var fraværende i SW480, HCT8 og negative kontroll null-FRT-celler. Vi videre undersøkt uttrykk og subcellulære lokalisering av TMEM16A protein i CRC celler ved hjelp av immunfluorescens farging. Immunfluorescens merking viste at TMEM16A ble sterkt uttrykt på cellemembran og plasma av SW620, HCT116 og LS174T celler (S1 fig.), Mens TMEM16A ble nesten ikke observert i HCT8 og SW480-celler (fig. 2). Et celle, isogene modell (SW480 og SW620-cellelinjer) av human CRC metastase overgang ble utvalgt for videre studium.
A, RT-PCR avslører TMEM16A mRNA-ekspresjon i SW620, HCT116 og LS174T celler, men ikke i HCT8 og SW480 celler. B, TMEM16A protein uttrykk i HCT8 og SW480, SW620, HCT116 og LS174T celler ble oppdaget av Western blotting. Null FRT-celler virker som negativ kontroll. FRT celler transfektert med humant TMEM16A tjene som positiv kontroll.
Celler ble dyrket på Dekk og farget med anti-TMEM16A antistoffer. Venstre kolonne, anti-TMEM16A immunfluorescens (Cy3, rød). Middle kolonnen til DAPI farging visualisere kjerner. Høyre kolonne, fusjonerte bilder er kompositter av anti-TMEM16A immunfluorescens og DAPI farging (200 ×).
Funksjonell uttrykk for TMEM16A kanal i CRC celler
For å validere den funksjonelle uttrykk for den TMEM16A kanal i CRC cellelinjer utførte vi hel-celle patch clamp opptak av SW480 celler og inne-out patch clamp opptak av SW620 celler. Fig. 3A viser en familie av strømmene som reaksjon på de spenningstrinn stimuli i nærvær av 1 uM Ca fra en SW480 celle. Strøm-spenningskurve (Fig. 3B) viste at reversering potensial (V
rev) av denne strømmen er omtrent -50 mV, men det V
rev av kloridet kanal ble estimert til å være ca 0 mV ved hjelp Nernst-ligningen i henhold til det ekstracellulære og intracellulære Cl
-. Dette resultatet viser at strømmene registrert fra SW480 celle er ikke fra kloridkanalene.
A, Representative hel-celle strømmer i SW480 celler ble aktivert av en mikrometer Ca. Strømningene ble registrert ved en beholdning potensial fra 0 mV fulgt av pulserende spenning mellom ± 100 mV i trinn på 20 mV. B, Current-spenningskurve fra panel A indikerer at strømmen er ikke fra kloridkanalene. C, A representant nåværende spor spilt inn fra en inside-out patch av en SW620 celle. En CACC strøm ble utløst med en mikrometer Ca
2 +, som merket. Stiplede linjer representerer null strøm. Membranen spenningen ble holdt på -50 mV; og oppover nedbøyninger representerer kanalåpningen. D, A stabil strøm spor etter en CACC strøm fra panelet C kjøre ned. E, En kontinuerlig strøm opptak viser aktivering av CaCCs og anvendelser av spennings ramper i fravær (a og c) eller nærvær (B) av Ca. Spenning ramper: +50 til -100 mV for en varighet på 2000 ms. F, Current-spenningskurver fra panelet E viser typiske ytre retting kjennetegn CaCCs. Legg merke til at minimal ledningsevne ble observert i fravær av Ca. G og H, CaCCs strømninger ble redusert separat av 100 mikrometer NFA og 50 mikrometer T16Ainh-A01.
Inside-out patch clamp eksperimenter SW620 celler manifestert at membranen nåværende var avhengig av kalsium og spenningen , som er typiske karakteristika for endogene CaCCs (fig. 3C-F). I tillegg ble de detekterte strømmer sterkt inhibert av Cl
– kanalblokker nifluminsyre (NFA) (figur 3G.) Og den TMEM16A -spesifikk inhibitoren T16Ainh-A01 (fig 3H.)
. også tilsettes TEME16A spesifikk hemmer T16Ainh-A01 til SW620 celler og SW480-celler hver for seg, og det observert vekst endring av disse cellene etter 24 timer. Resultatene viste at T16Ainh-A01 kunne spesifikt redusere proliferasjonen av SW620-celler, men ikke SW480-celler (Fig. 4).
Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av T16Ainh-A01 i 24 timer og cellelevedyktigheten ble målt ved MTT-analyse. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD (n = 3).
knockdown av TMEM16A hemmet spredning av SW620 celler
For å avsløre funksjonene TMEM16A i tykktarm kreft celler, vi transfektert to TMEM16A shRNA sekvenser (# 1 og # 2) i SW620 celler til å dempe uttrykk for TMEM16A. Western blot Resultatene viste at TMEM16A shRNA # 1 forårsaket 63,4% reduksjon i TMEM16A proteinekspresjon og TMEM16A shRNA # 2 forårsaket 71,7% reduksjon sammenlignet med kontrollen shRNA. TMEM16A knockdown førte til en betydelig endring i hel-celle kalsiumaktiverte klorid strømmer og immunofluorescene tetthet (Fig. 5).
A, Western blot analyse av TMEM16A protein uttrykk i SW620 celler som ble transfektert med shRNA # 1 og # 2. B, oppsummerer søylediagram den relative ekspresjonsnivået av TMEM16A protein fra panel A. Ekspresjon av TEMEM16A protein ble normalisert med ekspresjonsnivået av β-aktin (n = 3). C, er representative immunofluence bilder av SW620 celler vises etter TMEM16A er knockdown av shRNA # 1 og shRNA # 2, sammenlignet med kontroll shRNA (200 ×). D, oppsummerer Søylediagrammet peak strøm registrert ved 100 mV spenning i SW620 celler etter TMEM16A ble slått ned, sammenlignet med kontroll shRNA. ** P 0,01. Alle data er vist som gjennomsnitt ± SD. E, Whole-celle-strømmer ble registrert fra SW620 celler transfektert med kontroll shRNA, shRNA # 1 og # 2 ved et holdepotensial fra 0 mV fulgt av pulserende spenning mellom ± 100 mV i trinn på 20 mV.
for å undersøke effekten av TMEM16A på spredning av SW620 celler, brukte vi to shRNA sekvenser for å forstyrre uttrykket av TMEM16A. MTT analyse viste at TMEM16A knockdown sterkt undertrykket cellevekst i en tid -avhengig måte sammenlignet med kontroll shRNA-uttrykke SW620 celler
in vitro plakater (Fig. 6).
A, Veksten i SW620 -celler ble hemmet av TMEM16A shRNA # 1 og # 2 sammenlignet med kontrollgruppen (gjennomsnitt ± SD; n = 3; * P 0,05). B, Representative immunoblotter bekrefter knockdown av TMEM16A. Ctrl, kontroll.
Undertrykkelse av migrasjon og invasjon av SW620 celler ved stanse endogen TMEM16A
For ytterligere å observere effekten av TMEM16A på cellemotilitet, vi utførte sårhelende analyser etter silencing endogen TMEM16A. Sårhelende bildene viste at såret nedleggelse av TMEM16A shRNA # 1 og # 2 celler var tregere enn i kontrollgruppen shRNA-behandlede celler etter skrape cellene (Fig. 7). Dette resultat viste at deregulering av TMEM16A forsinket sårheling sammenlignet med kontrollen.
A, Migrering av SW620-celler ble bestemt ved en sårhelende assay i nærvær av TMEM16A shRNA # 1 og shRNA # 2, sammenlignet med kontroll shRNA. Representative bilder av sår nedleggelse ble tatt ved 0 timer, 24 timer, 48 timer og 72 timer etter såret etter 100 × forstørrelse. B, Bar grafer av panel A vist. Verdiene er middelverdi ± SD; n = 3; ** P 0,01. Ctrl, kontroll.
Vi neste undersøkt rollene TMEM16A i metastase i SW620 celler. Transwell migrasjon og invasjon analyser av TMEM16A knockdown celler ble utført. I transwellmigrasjonsanalysen var antall celler transfektert med TMEM16A shRNA som gjennomtrenges av membranen i stor grad redusert sammenlignet med SW620-celler transfektert med den negative kontroll. Resultatene viste også at SW620 celler transfektert med TMEM16A shRNA # 1 og # 2 viste betydelig svekkelse av trekkfugl evne. På tilsvarende måte det tilsvarende rolle TMEM16A shRNA # 1 og # 2 for invasive egenskaper ble også observert i en parallell invasiv assay (fig. 8).
a, migrasjon (uten Matrigel) og invasjon (med Matrigel) av SW620-celler i betydelig grad undertrykkes ved knockdown av TMEM16A sammenlignet med kontrollgruppen gjennom Transwell penetrasjon analyser. Non-migrerte celler ble skrapt med en bomullspinne. Celler som gjennomtrengt transwell filtrene ble farget med Coomassie-blått. Representative bilder vises. B og C, Bar grafer av panel A vises. Verdiene er middelverdi ± SD; n = 3; ** P 0,01. Ctrl, kontroll.
Nedbryting av TMEM16A hemmet aktivering av MAPK signale
For å belyse de molekylære mekanismer som TMEM16A påvirker menneskelig CRC vekst og metastasering, utforsket vi korrelasjonen av TMEM16A med cyclin D1 og MAPK signalveien. Som vist på fig. 9, knockdown av TMEM16A betydelig redusert ekspresjon av cyclin D1 og fosforylering av MEK og ERK1 /2, mens det ikke påvirker den totale MEK eller ERK1 /2 ekspresjonsnivåene.
Western blot resultatene viser hemming av TMEM16A ført til en reduksjon i fosfo-MEK, fosfo-ERK1 /2 og cyklin D1. Ctrl, kontroll.
Nedbryting av TMEM16A forårsaket retardasjon av cellesyklus prosesjon
Vi målte ytterligere cellesyklus distribusjon av flowcytometri for å undersøke mulig mekanisme TMEM16A i regulering CRC celle spredning. Som fig. 10 viste en økning i celletallet ved G0 /G1 fase og reduksjon i celletallet i G2 /M fasen ble observert etter endogene TMEM16A ble slått ned. Prosentandelen av G1-fase celler i TMEM16A-shRNA # 1 celler (50,3% ± 1,83) og TMEM16A-shRNA # 2 celler (51,8 ± 1,13) var betydelig høyere enn i kontrollceller (33,95 ± 2,05) (P 0,01). Disse resultatene bekreftet at TMEM16A knockdown førte til retardasjon av cellesyklusutvikling i SW620-celler ved å arrestere cellene ved Go /G1 fase, som forårsaket vekstinhibering av TMEM16A shRNA-celler.
A, B og C, Strømningscytometrisk analyse av cellesyklusfordelingen av SW620-celler transfektert med kontroll shRNA, TMEM16A shRNA # 1 og # 2 henholdsvis i 72 timer. D, søylediagram som viser den relative prosentandelen av celler i de angitte faser av cellesyklusen etter knockdown av TMEM16A. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD; n = 3; * P .. 0.05
Til sammen våre resultater viser at utarming av TMEM16A trykkes aktivering av MAPK signalveien og forsinket progresjon av cellesyklus
Diskusjoner
TMEM16A proteiner ble nylig funnet å danne Ca
2 + -aktiverte Cl
– kanaler som ble transient aktivert av intracellulært kalsium [15], [16], [26], [35]. Disse kanalene spiller en viktig rolle i epitelial Cl
– sekresjon, kontraksjon av glatt muskulatur og olfaktorisk signaltransduksjon [17], [36], [37], [38], [39]. Tidligere studier har vist at TMEM16A er ofte over-uttrykt i flere maligniteter, inkludert SCCHN, spiserørskreft og gastrointestinal stromal tumor (GIST) [28], [36], [40]. Imidlertid er det fortsatt uklart uttrykk for TMEM16A i CRC.
Våre funn gir det første bevis på at TMEM16A forsterkes og høyt uttrykt i SW620, HCT116 og LS174T celler, men ikke i HCT8 og SW480 celler. Vi fant ut at TMEM16A protein var ca 110 kD og ligger i cellemembranen og plasma av SW620, HCT116 og LS174T celler, som er konsistent med tidligere rapporter [39], [41]. Tykktarmskreft cellelinje SW480 stammer fra primær adenokarsinom i tykktarmen fra en 50 år gammel mannlig pasient, og SW620 celler er hentet fra en metastatisk mesenteriske lymfeknute på samme pasient. Så SW620 celler har høyt metastasepotensiale sammenlignet med SW480-celler [42]. LS174T og HCT116 har høyere potensial enn metastase HCT8 celler [43], [44], [45]. Disse resultater viser at opp-regulering av TMEM16A var assosiert med øket potensiale av metastaser i de fem CRC-cellelinjer. Vi spekulerer i at endring av TMEM16A uttrykket var forbundet med oppkjøpet av mer aggressive egenskaper i CRC cellelinjer, som induserer tumorer å bli metastatisk. Forholdet mellom TMEM16A uttrykk og CRC tumorprogresjon må undersøkes nærmere i flere CRC cellelinjer og i en annen klinikk studie.
På grunn av sin isogen funksjonen, SW480 og SW620 cellelinjer tjene som en verdifull modell for å studere den genetiske alter i tykktarm kreft metastatisk progresjon [46]. Derfor velger vi dette paret av cellemodell for senere studie.
Elektro bevis validert at TMEM16A fungerer som CaCCs i SW620 celler. For det første er den gjeldende avhengig av konsentrasjonen av kalsiumioner i cytoplasma og spenning (fig. 3 C-F). Videre både klorid kanal blocker NFA og TMEM16A-spesifikk hemmer T16A
inh-A01 [47] kan effektivt undertrykke strømmer opp fra en SW620 celle patch (Fig. 3G, H). Interessant, observerte vi at etter en celle lapp ble skåret ut, redusert CACC strømmen raskt til å begynne med og deretter ble forholdsvis stabil (fig. 3C, D). Dette fenomenet viste at andre proteiner, for eksempel calmodulin eller calmodulin-avhengig kinase, kan være involvert i reguleringen av TMEM16A CaCCs i SW620 celler.
Det er dokumentert at kloridkanalene bidra til tumorigenesis og tumorprogresjon [48] , [49], [50], [51]. TMEM16A CaCCs har nylig blitt rapportert å fremme vekst og metastase i HNSCC, prostata- og brystkreft [27], [30], [31]. I samsvar med disse funnene, fant vi at TMEM16A knockdown resulterte i undertrykkelse av spredning, migrasjon og invasjon av SW620 celler. Våre data gir bevis for at TMEM16A bidrar trolig til tumorigenesis og metastaser i high-metastatisk potensial CRC. Små molekylære hemmere som kan redusere uttrykket av TMEM16A kan tjene som nye terapeutiske legemidler for metastatisk CRC.
Til dags dato den mekanismen som TMEM16A påvirker tykktarmskreft holdt seg relativt uutforsket. Tallrike studier har vist at den ERK-reaksjonsveien ikke bare regulerer cellulær proliferasjon og overlevelse, men påvirker også tumorcellemigrering, invasjon og progresjon [52], [53], [54]. Nyere studier har rapportert at TMEM16A fremmer HNSCC tumorigenesis og kreft progresjon ved å aktivere MAPK signalveien [30]. Derfor har vi fokusert på å studere forholdet mellom TMEM16A og MEK-ERK1 /2 pathway i CRC. Endringer i denne veien ble undersøkt etter TMEM16A uttrykk ble hemmet ved hjelp av western blotting. Våre resultater viser at knockdown av TMEM16A inhiberte signifikant aktivering av MEK og ERK1 /2. På grunnlag av dette resultat, har vi undersøkt videre ekspresjon av cyclin D1, en cellesyklus-regulerende protein som er assosiert med pErk1 /2 uttrykk. Resultatene viste at ekspresjon av cyclin D1 er positivt forbundet med pErk1 /2 og TMEM16A uttrykk. I tillegg strømningscytometri (FCM) analyser viste at cellesyklusutvikling fra G1 til S-fasen ble hemmet, som var i samsvar med deregulering av cyclin D1 uttrykk etter TMEM16A var oppbrukt. Disse resultatene gir en mulig forklaring på den observerte inhibering av celle proliferasjon, migrering og invasjon av CRC da TMEM16A ble undertrykket og indikerte at TMEM16A bidrar til vekst og metastasering av CRC eventuelt ved regulering av MAPK-reaksjonsveien.
I konklusjonen
