Abstract
For å utforske effektiv utnyttelse av anlegget ressurser fra konstruerte våtmarker, de potensielle anti-metastatiske effekten av flavonoider fra
Potamogeton crispus
L. ble undersøkt på humane eggstokkreft celler (ES-2). To store flavonoider, luteolin-3′-O-β-D-glukopyranosid og flavon-6-C-β-D-glukopyranosid, ble isolert fra
P
.
crispus Hotell og identifisert. Effektene av disse flavonoider på celleproliferasjon, cellemorfologi, cellesyklus, apoptose og cellemigrering og invasjon ble deretter undersøkt. Videre revers transkriptase polymerasekjedereaksjon analyser og western blotting-analyse ble utført for å undersøke ekspresjonen nivået av mRNA og protein. Resultatene indikerte at Luteolin-3′-O-β-D-glukopyranosid hemmet ES-2 cellemigrasjon og invasjon og undertrykket ekspresjon av to matriks-metalloproteinaser (MMP), MMP-2 og MMP-9, og flavon-6-C-β -D-glukopyranosid hadde ingen signifikante hemmende effekt på ES-2 celler. Dermed denne studien viser de potensielle anti-metastatiske egenskaper til en
P
.
crispus
flavonoid, og gitt en vitenskapelig tilnærming for screening av lovende naturressurser fra konstruerte våtmarker å identifisere nyttige produkter for bruk i den farmasøytiske og helsesektoren
Citation. Du Y, Feng J Wang R, Zhang H, Liu J (2015) Effekter av flavonoider fra
Potamogeton crispus
L. på spredning, migrasjon og invasjon av menneskelige eggstokkreft celler. PLoS ONE 10 (6): e0130685. doi: 10,1371 /journal.pone.0130685
Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korea, Republikken
mottatt: 03.02.2015; Godkjent: 24 mai 2015; Publisert: 22 juni 2015
Copyright: © 2015 Du et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av National Natural Science Foundation of China (No. 31200426), National Water Special Project (No. 2012ZX07203-004), Science og teknologi Planning Project i Shandong-provinsen (No. 2011GGH21605) og Science Foundation Natural i Shandong-provinsen i Kina (No.ZR2014YL001). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Planter spiller en nøkkelrolle i byggingen av konstruerte våtmarksmiljøer, og de bør håndteres strengt for å opprettholde våtmarks effektivitet mens risikoen for sekundær forurensning og negative økologiske effekter på økosystemet minimere. Effektiv utnyttelse av høy biomasse våtmarks anlegget ressurser er viktig fordi det oppmuntrer høsting og bærekraftig forvaltning av konstruerte våtmarker.
Potamogeton crispus
L. er en av de viktigste plantene ansatt i konstruerte våtmarksøkosystemer [1]. Tidligere rapporter har identifisert karotenoider, fettsyrer, lignan, labdane diterpenoids, flavonoider og phytosterins i
P
.
crispus product: [2-5], og karotenoid utdrag fra
P
.
crispus
ble rapportert å indusere apoptose i HeLa celler
in vitro product: [6]. Vår foreløpige studie viste anti-tumor aktivitet av en
P
.
crispus
ekstrakt i human bryst- og eggstokk-kreft-cellelinjer [7], og kjemiske analyser antydet flavonoider å være de viktigste bestanddeler av denne ekstrakt.
Det er vel etablert at flavonoider har et stort utvalg av biokjemiske aktiviteter og de spiller en viktig rolle i den menneskelige helsesektoren [8-9]. Epidemiologiske og kliniske data tyder på at kosttilskudd flavonoider gjør viktige bidrag til å forebygge og /eller behandling av kroniske sykdommer som kreft, diabetes, hjerte- og karsykdommer og humant immunsviktvirus infeksjon, [10-14]. Nyere forskning på flavonoid egenskaper har vært fokusert på sine cytotoksiske antitumor aktivitet, og eksperimentelle studier har indikert at flavonoider undertrykke migrasjon og invasjon, påvirker cellesyklusprogresjon, og indusere apoptose i flere tumorcellelinjer [15-16].
Kreft metastasering er den ledende årsaken til dødelighet hos pasienter med maligne svulster, og er anslått til å være ansvarlig for 90% av humane kreftrelaterte dødsfall [17]; gjenstår det derfor en viktig utfordring for kreftbehandling. Degradering av den ekstracellulære matriks (ECM) er en viktig funksjon av metastatiske svulster, og denne fremgangsmåten er forbundet med over-ekspresjon av matriks-metalloproteinaser (MMP) [18-19]. Det har blitt rapportert at luteolin og baicalein flavonoider hemme metastase ved å undertrykke ekspresjon og sekresjon av MMP2 og MMP9 i humane brystkreftceller (MCF-7 og MDA-MB-231) og i hepatocellulære karsinom-celler (MHCC97H) [20-22] . Det er imidlertid uklart om flavonoider har anti-metastatiske virkninger på eggstokkreft celler.
I denne studien har vi renset to flavonoider fra
P
.
crispus
og undersøkt deres virkninger på den menneskelige eggstokkreft ES-2 cellelinje. Utbredelsen, morfologi, cellesyklusprogresjon, apoptose, migrering og invasjon av disse celler ble undersøkt med det formål å belyse virkningene av
P
.
crispus
flavonoider på ES-2 celler og mekanismene som er involvert.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Feltundersøkelsen og prøvetaking involvert i denne studien ble utført med den offisielle tillatelse fra Environmental Protection Bureau of Weishan County og forvaltningskomiteen i Xinxue River konstruert våtmark. Feltarbeidet ikke innebærer noen utrydnings beskyttede plantearter eller andre dyrearter. Laboratoriet protokollen ble godkjent av Shandong University etikkomité.
Utarbeidelse av plantemateriale
P
.
crispus
materialet ble samlet i Xinxue River konstruert våtmark (117,16 ° E, 34.78 ° N), ved Nansisjøen, Weishan fylke, Kina. Samlingen ble gjennomført i begynnelsen av juli, når
P
.
crispus
hadde maksimal biomasse. Hele planten ble tørket, pulverisert og ekstrahert med etanol under oppvarming tilbakeløp tre ganger, i 90 minutter pr ekstraksjon. Etanolen ekstraktet ble deretter suspendert i vann før den ble skilt med petroleter (PE), etylacetat (EtOAc), og n-butanol i rekkefølge; Disse ble konsentrert under vakuum for å gi en PE-ekstrakt, en EtOAc-ekstraktet, og en n-butanol ekstrakt. Basert på våre tidligere studier [7], EtOAc-ekstraktet valgt for videre separasjon. EtOAc-ekstraktet ble kromatografert på en MCI-gel-kolonne, etterfulgt av Sephadex LH-20-kolonne-kromatografi, de to viktigste forbindelser ble deretter fremstilt ved hjelp av høy-ytelse væskekromatografi (HPLC) (Agilent 6270, USA). De to forbindelser ble identifisert ved hjelp av HPLC, kjernemagnetisk resonans (NMR) (AVANCE 600, Bruker, Tyskland), og høy oppløsning elektrospray ionisering-massespektrometri (HR-ESI-MS) (LTQ Orbitrap XL, ThermoFisher, USA).
celle~~POS=TRUNC kultur~~POS=HEADCOMP og behandling
ES-2 human eggstokkreft cellelinjen ble hentet fra Shandong Analyse og Test Center i august 2014. Cellene ble dyrket i RPMI-1640 medium (HyClone, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco, Life Technologies, USA) og antibiotika (100 ug /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin) (HyClone). Cellekulturer ble holdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO
2. Forbindelser ble oppløst ved en konsentrasjon på 0,1 M i 100% dimetylsulfoksyd (DMSO) (Solarbio, Kina) for å danne stamløsninger, lagret ved -20 ° C, og fortynnet til de angitte konsentrasjoner med mediet før hvert eksperiment. Den endelige DMSO-konsentrasjonen ikke overskred 0,1% i løpet av studien, og alle kontrollgruppene ble utsatt for 0.1% DMSO.
celleproliferasjonsanalyse
flavonoid effekter på celleproliferasjon ble evaluert ved å bruke MTT (tiazolyl blå tetrazolium-bromid) (Solarbio) assay. ES-2-celler ble sådd ut (1 x 10
4 per brønn) på en 96-brønns plate i RPMI-1640 supplert med 10% FBS. Etter inkubering over natten ved 37 ° C i 5% CO
2, forskjellige konsentrasjoner (15-240 ug /ml) av forbindelsene ble tilsatt i triplikate brønner. Etter inkubering i 48 timer ble MTT tilsatt til hver brønn for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 0,5 mg /ml og inkubasjon ble utført i ytterligere 4 timer. Mediet ble deretter erstattet med en stoppløsning (DMSO, 150 ul per brønn), og absorbansen ved 490 nm ble målt på en plateleser (enspire, Perkin Elmer Corporation, USA). De 0,1% DMSO-kontroller ble målt parallelt. Cytotoksisitet ble uttrykt som inhibering hastigheten, som ble beregnet som følger: hvor A
kontroll = absorbansen til kontrollbrønner; Et
sample = absorbans av behandlede brønner; Et
0 = absorbans av blanke brønner. Origin 7.5 programmet ble brukt til å analysere dataene og beregne IC
50 verdier. Analyser ble gjentatt minst tre ganger.
Observasjon av cellemorfologi
ES-2-celler ble dyrket som beskrevet for den celleproliferasjonsanalyse. Cellene ble behandlet med 30 eller 60 ug /ml luteolin-3′-O-β-D-glukopyranosid (LU3’O-GP) eller 100 ug /ml flavon-6-C-β-D-glukopyranosid (FL6C-GP ). Cellemorfologi observasjoner ble utført etter inkubasjon i 48 timer, ved bruk av et invertert mikroskop fluorescerende (Ti-S, Nikon, Japan).
cellesyklusprogresjon assay
ES-2-celler (5 x 10
4 per brønn) ble sådd ut på en 6-brønns plate og inkubert over natten ved 37 ° C i 5% CO
2 før tilsetning av de angitte forbindelsene fremstilt i komplett medium i 48 timer. Cellene ble deretter oppsamlet ved trypsinering, vasket i fosfat-bufret saltvann (PBS), og fiksert i 70% etanol ved 4 ° C i 2 timer. Cellene ble vasket to ganger med PBS og sentrifugert ved 2000 rpm i 5 min; supernatanten ble kastet. Cellene ble resuspendert i 100 ul PBS inneholdende RNAse (50 ug /ml) og inkubert ved 37 ° C i 30 minutter; reaksjonen ble deretter stoppet ved å plassere på is i 2 min. ES-2-celler ble farget ved inkubering med 10 ug /ml propidiumjodid (PI) med 0,1% Triton X-100 i mørke ved 4 ° C i 30 minutter. Prøvene ble analysert ved strømningscytometri (FACSAria, BD, USA), og resultatene ble analysert ved FlowJo 7.6.1.
celle apoptose assay
annexin-V-PE /7-AAD apoptose deteksjon kit (BD Pharmingen, USA) ble anvendt for å undersøke effekten av testforbindelsene på apoptose i ES-2-celler. Annexin V er et protein som har en høy affinitet for fosfatidylserin (PS). I løpet av apoptose, translocates PS fra den indre overflate av plasmamembranen til celleoverflaten, hvor det kan detekteres ved hjelp av en fluorescerende annexin V-konjugat. ES-2-celler ble dyrket og sådd ut som beskrevet ovenfor for cellesyklusprogresjon assay. Etter inkubasjon med
P
.
crispus
flavonoider i 48 timer ble cellene oppsamlet ved trypsinering, vasket to ganger med PBS, og re-suspendert i 400 ul bindingsbuffer før tilsetningen av 5 ul av annexin V-PE, inkubering i mørket ved 4 ° C i 15 minutter og farging med 10 ul av 7-AAD-løsning. Prøvene ble analysert ved strømningscytometri (FACSAria, BD) etter inkubering i mørke ved 4 ° C i 15 minutter, og resultatene ble analysert ved FlowJo 7.6.1 programvare. Apoptotiske og nekrotiske celler ble identifisert ved annexin V positive /7-AAD negativ farging og annexin V positive /7-AAD positiv farging, henholdsvis.
Cell migrasjon analysen
Cell migrasjon analysene ble utført ved hjelp av Transwell kamre (Corning Costar, USA) Transwell kammeret ble fylt med medium og 0,1% bovint serumalbumin (BSA) (Gibco, Life Technologies) ble inkludert i serumfritt medium i det øvre kammer, for å opprettholde det osmotiske trykk. ES-2-celler ble utsatt for de angitte flavonoid konsentrasjoner i et serumfritt medium i 48 timer før tilsetning av cellene (2 x 10
5) til den øvre Transwell kammeret. Den nederste kammer inneholdt medium med 5% FBS for å tjene som en chemo-lokkemiddel. Kamrene ble inkubert i 24 timer og de ikke-migrerings celler på oversiden av Transwell membranen ble fjernet ved anvendelse av bomullspinner. Membranen ble fiksert i 100% metanol; de migrerte celler ble deretter beiset med 0,1% krystallfiolett i 10 min, og vasket tre ganger med PBS. Membranen ble fotografert under et mikroskop før den ble vasket med 33% eddiksyre; absorbansen av elueringsmidlet ble målt ved 590 nm på en plateleser (enspire, Perkin Elmer Corporation).
celle invasjon assay
celle invasjon ble analysert ved anvendelse av protokollen beskrevet ovenfor for cellemigrering analysen, bortsett fra at Transwell kammeret ble belagt med Matrigel (BD Pharmingen) og mediet var fri for BSA.
Isolering av total RNA og revers transkriptase polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) -analyse
ES-2-celler ble sådd ut i en 6-brønns plate (4 x 10
5 celler per brønn) og inkubert over natten før behandling med forskjellige konsentrasjoner av LU3’O-GP (0, 30, 60, 90 ug /mL ) i 48 timer. Celler ble oppsamlet ved trypsinering og vasket i PBS. Total RNA ble isolert ved hjelp Trizol (Invitrogen, Life Technologies) og 5 mg ble brukt til å syntetisere cDNA ved hjelp av M-MLV (Invitrogen, Life Technologies). CDNA ble forsterket ved hjelp av følgende primer sekvenser (BGI, Kina):
MMP2, fremover, 5′-GTTCATTTGGCGGACTGT-3 «, revers, 5′-AGGGTGCTGGCTGAGTAG-3»;
MMP9 , fremover, 5′-AATCTCACCGACAGGCAGCT-3 «, revers, 5′-CCAAACTGGATGACGATGTC-3»;
glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH), fremover, 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 «, revers, 5» -CATGGGTGGAATCATATTGGAA-3 «
PCR ble utført ved bruk av følgende program:. 95 ° C i 5 min; deretter 45 sykluser med 95 ° C i 10 s; 55 ° C i 15 s; og 72 ° C i 10 sek. Prøvene ble deretter oppvarmet (72 ° C i 10 minutter) og avkjølt til 4 ° C. GAPDH ble anvendt som RNA lasting kontroll. PCR-produktene ble separert på 1% agarosegeler og påvist ved etidiumbromid-farging. Resultatene ble analysert ved BandScan5.0.
Western blot-analyse
ES-2-celler ble sådd ut i en 6-brønns plate (4 x 10
5 celler per brønn) og inkubert over natten før behandling med forskjellige konsentrasjoner av LU3’O-GP (0, 30, 60, 90 ug /ml) i 48 timer. Cellene ble suspendert i 500 ul lyseringsbuffer ved 4 ° C (40 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 150 mM KCl, 100 mM NaVO3, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, pH 7,5). Proteinene ble separert ved 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese og overført til PVDF-membraner. Membranene ble deretter blokkert ved bruk av skummet melk i 5% Tris-bufret saltvann med Tween-20 (TBST) ved 37 ° C i 1 time og inkubert over natten med primære antistoffer (MMP-2-antistoff: Santa Cruz Biotechnology, USA; MMP-9 antistoff: RabMab, Abcam, UK) i TBST inneholdende 5% skummet melk ved 4 ° C. Membranene ble deretter inkubert med et sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. Båndene ble oppdaget av forsterket kjemiluminescens og fotografert; resultatene ble analysert ved hjelp av bilde J programvare.
Statistisk analyse
For hver analyse ble triplikate eksperimenter ble utført, og resultatene er presentert som gjennomsnitt ± standard avvik (SD). Betydningen av gruppeforskjeller ble undersøkt ved hjelp av Student tosidige t-test (Microsoft Excel-programvare).
Resultater
Identifikasjon av to hoved
P
.
crispus
flavonoider
HPLC, NMR, og HR-ESI-MS ble utført for å isolere og identifisere de to viktigste forbindelsene i
P
.
crispus
EtOAc ekstrakt. Disse forbindelser ble identifisert og karakterisert som Luteolin-3′-O-β-D-glukopyranosid (LU3’O-GP) og flavon-6-C-β-D-glukopyranosid (FL6C-GP) ved å sammenligne deres spektrale data (HPLC , HR-ESI-MS,
1 H og
13C NMR) og fysiokjemiske egenskaper med de som er rapportert i litteraturen [23-25]. Dette er den første rapporten fra utvinning av disse to flavonoider fra
P
.
crispus
. Den molekylære struktur av to forbindelser ble vist i figur 1, og renheten av begge forbindelsene var over 90% (figurene a og b i S1-fil).
LU3’O-GP hemmet ES- 2 celleproliferasjon
ES-2 eggstokkreft celler ble inkubert i 48 timer med fem ulike konsentrasjoner av LU3’O-GP eller FL6C-GP. De MTT-assay-resultatene indikerte en konsentrasjonsavhengig reduksjon i celleviabilitet i nærvær av LU3’O-GP (fig 2). Cellenes levedyktighet ble redusert med 63,8% og 73,6% etter 48 timers eksponering til 120 og 240 mikrogram /ml LU3’O-GP, henholdsvis, og IC
50 verdien var 57,1 ug /ml. De samme konsentrasjoner av FL6C-GP hadde en betydelig lavere påvirkning på cellenes levedyktighet, og denne forbindelsen hadde en IC
50 verdi på 182,7 ug /ml. Disse resultatene indikerte at LU3’O-GP inhiberte proliferasjonen av ES-2-celler på en konsentrasjonsavhengig måte
Celler ble inkubert med fem forskjellige flavonoid konsentrasjoner eller dimetylsulfoksyd. (DMSO; kontroll) i 48 timer. Data representerer midlene tredoble eksperimenter ± standardavvik (SD) *
p
0.01.
LU3’O-GP påvirket ES-2 morfologi
Morfologiske undersøkelser ble gjennomført for å ytterligere undersøke effekten av LU3’O-GP på ES-2 celler. ES-2-celler ble behandlet med konsentrasjoner av LU3’O-GP assosiert med lav cytotoksisitet (30 og 60 ug /ml) eller 100 ug /ml FL6C-GP. Bilder som oppnås ved omvendt mikroskopi etter 48 timer inkubering er vist i figur 3. Styre og FL6C-GP-celler sammenligning viste det klassiske spindelen cellemønster observert i ovarietumorceller. Cellene behandlet med LU3’O-GP viste en signifikant tap av mobilitet og endringer i cellemorfologi; den store morfologiske endringen var til cytomere form, som ble sfærisk, med en forkortet tentakkel. Disse endringene skjedde på en konsentrasjonsavhengig måte. Den FL6C-GP behandling produserte ingen signifikant endring, sammenlignet med kontrollceller. Resultatene indikerte at LU3’O-GP kan endre mobilnettet morfologi ES-2 celler og foreslo organisasjonens innflytelse på celle mobilitet.
ES-2-celler ble behandlet med den angitte
P
.
crispus
flavonoider i 48 timer, og avbildes med en invertert fluorescerende mikroskop.
LU3’O-GP indusert cellesyklus arrest i ES-2 celler
Å avgjøre om
P
.
crispus
flavonoider påvirket cellesyklusen, ES-2 celler behandlet med enten LU3’O-GP eller 100 mikrogram /ml FL6C-GP for sammenligning, før analyse av flowcytometri. Resultatene (figur 4) viste at LU3’O-GP behandling forårsaket konsentrasjonsavhengige økninger i antallet celler i G0 /G1 fase, og reduksjon i antallet celler i S-fasen, mens FL6C-GP behandling hadde ingen signifikante effekter på cellesyklusprogresjon i ES-2-celler. Disse resultatene viste at LU3’O-GP påvirket ES-2 cellesyklusprogresjon ved å forårsake cellesyklus-stans ved fasegrensen av G1 fase og i S-fasen
(a) negativ kontroll.; (B) celler behandlet med 100 ug /ml flavon-6-C-β-D-glukopyranosid (FL6C-GP); (C) celler behandlet med 30 ug /ml luteolin-3′-O-β-D-glukopyranosid (LU3’O-GP); og (d) celler behandlet med 60 pg /mL LU3’O-GP. Celler ble fiksert med etanol og farget med propidiumjodid før cellesyklusfordelingen analyse ved flowcytometri. Antallet av celler i G0 /G1 fase er representert ved den første topp, og de i G2 /M fasen er representert ved den andre topp. Celler i S-fasen er tilstede i området mellom G0 /G1 og G2 /M-topper. Disse dataene representerer gjennomsnittet av triplikate eksperimenter. *
p
0,01 sammenlignet med kontroll
P
..
crispus
flavonoider hadde ingen effekt på apoptose i ES-2-celler
Apoptose er en aktiv og fysiologisk måte celledød som vanligvis gjenopprettet ved hjelp av anti-kreftmidler. Strømningscytometri ble anvendt for å bestemme hvorvidt LU3’O-GP påvirket ES-2 apoptose. Som vist i figur 5, cellepopulasjonen i Q3 sonen representerte de apoptotiske celler, som var annexin V positiv og 7-AAD negativ. Denne populasjonen viste ingen åpenbare endringen i nærvær av LU3’O-GP eller FL6C-GP, noe som tyder på at
P
.
crispus
flavonoider hadde ingen effekt på apoptose i ES-2-celler
(a) negativ kontroll.; (B) celler behandlet med 100 ug /ml flavon-6-C-β-D-glukopyranosid (FL6C-GP); (C) celler behandlet med 30 ug /ml luteolin-3′-O-β-D-glukopyranosid (LU3’O-GP); (D) celler behandlet med 60 mikrogram /ml LU3’O-GP. Apoptotiske celler er vist i Q3.
LU3’O-GP hemmet migrasjon og invasjon av ES-2 celler
Cell motilitet anses å være en viktig faktor for den metastatiske potensialet kreftceller. Effekten av LU3’O-GP på motiliteten av ES-2 cancerceller ble undersøkt ved anvendelse av en cellemigrering assay. Som vist i figur 6, ble den migrering av ES-2-celler signifikant redusert på en konsentrasjonsavhengig måte etter eksponering for LU3’O-GP. Denne inhibering var ca 67,7% og 88,1%, sammenlignet med kontrollceller, i nærvær av 30 og 60 mikrogram /ml LU3’O-GP hhv. Cellene behandlet med FL6C-GP viste ingen signifikant forandring i migrering aktivitet, sammenlignet med kontrollceller.
Celler ble utsatt for de angitte konsentrasjoner av luteolin-3′-O-β-D-glukopyranosid (LU3 « O-GP) og flavon-6-C-β-D-glukopyranosid (FL6C-GP), og deres migrering ble kvantifisert ved anvendelse av en Transwell kammer. Verdier representerer hjelp av triplikate eksperimenter. *
p
0,01, sammenlignet med kontroll; #
p
0,05, sammenlignet med den angitte konsentrasjon.
I løpet av tumormetastase, må cellene passere gjennom ECM. For å evaluere hvorvidt LU3’O-GP påvirket ES-2 celle invasjon, ble celle invasjon analyser utført i et Transwell kammer belagt med Matrigel. Behandling av ES-2-celler med økende konsentrasjoner av LU3’O-GP førte til en betydelig konsentrasjonsavhengig reduksjon i celle invasjon hastighet, sammenlignet med kontrollen (Fig 7). Denne prosessen ble inhibert med omtrent 73,7% og 89,9% i nærvær av 30 og 60 mikrogram /ml LU3’O-GP, henholdsvis, mens inhiberingen indusert av 100 mikrogram /ml FL6C-GP var bare 6,7%. Resultatene av denne analyse viste at LU3’O-GP dramatisk hemmet invasjonen av ES-2-celler.
Celler ble behandlet med luteolin-3′-O-β-D-glukopyranosid (LU3’O-GP ) eller flavon-6-C-β-D-glukopyranosid (FL6C-GP), og deres invasjon ble kvantifisert i et Transwell kammer membran med Matrigel. Verdier representerer hjelp av eksperimenter utført i tre eksemplarer. *
p
0,01, sammenlignet med kontroll; #
p
0,05, sammenlignet med den angitte konsentrasjon.
For å kunne fastslå påvirkning av LU3’O-GP på oppstrøms faktorer som er viktige for reguleringen av tumorcelle invasjon, mRNA og protein uttrykk for MMP2 og MMP9 ble undersøkt. RT-PCR-assay-resultatene er vist i figur 8. Nivået av MMP2 og MMP9 mRNA ble redusert på en konsentrasjonsavhengig måte ved behandling med LU3’O-GP, Western blotting-analyse (figur 9) viste en tilsvarende undertrykkelse av MMP- 2 (pro-MMP2 og aktivitet MMP-2) og MMP-9 protein uttrykk ved LU3’O-GP. Disse resultatene antydet at flavonoid, LU3’O-GP, undertrykkes uttrykk for MMP2 og MMP9 på både mRNA og protein nivå
(a) LU3’O-GP effekter på MMP-2 uttrykk.; (B) LU3’O-GP effekter på MMP-9 uttrykk. mRNA-nivåer ble undersøkt ved revers transkriptase polymerasekjedereaksjon (RT-PCR), under anvendelse glyseraldehyd 3-fosfat-dehydrogenase som laste kontroll. RT-PCR-produkter ble påvist ved etidiumbromid-farging. Verdier representerer hjelp av triplikate eksperimenter. *
p
0,05, sammenlignet med kontroll
(a) LU3’O-GP effekter på MMP-2 (pro-MMP-2 og MMP-aktivitet-2).; (B) LU3’O-GP effekter på MMP-9 uttrykk. Protein nivåer ble undersøkt av vestlige boltting analyse. Verdier representerer hjelp av triplikate eksperimenter. *
p
0,05, sammenlignet med kontrollgruppen.
Diskusjoner
I denne studien, to store flavonoider, LU3’O-GP og FL6C-GP, ble isolert og identifisert fra
P
.
crispus
med sikte på å utforske de potensielle anti-metastatiske effekten av denne konstruerte våtmarksanlegg ressurs. Metastase er den viktigste dødsårsaken hos kreftpasienter og utvikling av nye behandlingsregimer som hemmer tumor spredning er avgjørende for vellykket kreftbehandling og forebygging. Men mest cytotoksiske syntetiske anti-kreft medikamenter har en lav spesifisitet; dette produserer effekter på normale vev, i tillegg til tumorceller, noe som fører til dårlige kliniske resultater. Betydelig vekt er derfor gitt til identifisering av nye anti-kreft-midler fra naturlige kilder, og spiselige ressursene er spesielt verdifulle på grunn av deres høye sikkerhetsmargin; mange naturlige kosttilskudd agenter er for tiden i tidlig fase kliniske studier [26]. Flavonoider gir en av de mest fremragende naturressurser i denne sammenhengen. Dietary flavonoider nesten alt eksisterer som glykosider i naturen og de mest tallrike plante flavonoid glykosider er flavone O /C-glykosider og flavonol O-glykosider [27].
LU3’O-GP er en flavone O-glykosid og FL6C-GP er en flavone C-glykosid. Men denne studien indikerte at LU3’O-GP produsert signifikante effekter på ES-2 spredning, morfologi, cellesyklusprogresjon, migrasjon og invasjon, mens FL6C-GP hadde ingen åpenbare effekter på disse cellene. Vi antok at denne forskjell ble knyttet til to forskjeller mellom disse forbindelser. For det første kan flavonoid aglycones viser ulike bioaktivitet. Luteolin, de aglycones av LU3’O-GP, og noen luteolin C-glykosider er blitt demonstrert å hemme tumorcelleoverlevelse og metastase i forskjellige humane epiteloide kreftceller inkludert MCF-7, MDA-MB231, og LNM35 celler [21, 28- 29]. Dernest, flavonoid glykosider er også vannløselige til å diffundere over cellemembranen, mens det aglycones er mer hydrofob og kan lett gå inn celler ved passiv diffusjon; deglykosylering av flavonoid glykosider til sine aglycones anses derfor å være den første fasen av metabolisme, produsere effekter
in vivo product: [30]. Derfor kan forskjellige sukkerdelene er bundet til flavonoid aglycones påvirke deres deglykosylering og metabolisme til en viss grad og resultere i forskjeller i bioaktivitet [31]. I denne studien, gjorde LU3’O-GP ikke induserer apoptose i ES-2 celler, selv om luteolin ble tidligere rapportert å indusere apoptose i noen menneskelige kreftceller og mus neuroblastom celler [32-33]. Dermed kan våre resultater også gi bevis for flavonoid glykosylering relatert variasjon i aktivitet.
Det er imidlertid mulig at effekten av glykosylering på flavonoid bioaktivitet
i vitr
o kan avvike fra de som ble observert
in vivo
. Flavonoid glykosider har blitt rapportert å vise tilsvarende eller enda større anti-diabetiker, anti-inflammatorisk, anti-degranulating, anti-stress, og anti-allergi aktiviteter enn sine flavonoid aglycones
in vivo product: [31]. Samlet sett er det svært vanskelig å trekke generelle konklusjoner om effekten av glykosylering på flavonoid bioaktivitet og videre forskning er nødvendig for å forstå forholdet mellom flavonoid glykosylering og bioaktivitet
in vivo Hotell og
in vitro
.
MMP-2 og MMP-9 er avgjørende enzymer som anses å være viktige bidragsytere til prosesser av invasiv metastase og angiogenese i ulike tumorer [34-37]. MMP-9 og MMP-2-ekspresjonsnivåer er signifikant forhøyet i en rekke karsinomer [36, 38]. Derfor er inhibering av MMP-2 og MMP-9 uttrykk skal ha høy prioritet i kreftterapi. I den foreliggende studien ble ES-2-celler ble behandlet med LU3’O-GP ved konsentrasjoner som er forbundet med lav cytotoksisitet for å evaluere den anti-metastatisk aktivitet av denne forbindelse, og en apoptose analyse ble også foretatt. Disse funn indikerte at LU3’O-GP signifikant hemmet ES-2 cellemigrasjon og invasjon og disse effektene var nær knyttet til en undertrykket ekspresjon av MMP-2 og MMP-9 i mRNA og proteinnivå i fravær av cytotoksiske eller apoptotiske virkninger. I tillegg, gitt at den metastatiske spredning av tumorceller er en flertrinnsprosess som involverer en rekke kompliserte fysiologiske hendelser, MMP-2 og MMP-9 ekspresjon er regulert av et komplisert nettverk av signalveier som kan aktiveres av en rekke vekst faktorer, cytokiner, og kjemikalier som for eksempel PI3K /Akt, p38-MAPK, NF-kB, EGFR, ERK1 /2, og TPA, som virker via en rekke veier, slik som MAPK /ERK-reaksjonsveien [39-45]. Dette indikerer at mekanismene bak metastase kan være spesifikke for forskjellige typer av tumorceller. Den klare LU3’O-GP-indusert hemming av ES-2 metastaser bør derfor bli undersøkt i andre typer kreftceller.
P
.
crispus
er en mye brukt arter i konstruerte våtmarker og det bør høstes på riktig tidspunkt for å opprettholde effektiv fjerning forurensende og for å unngå sekundær forurensning og negative økologiske effekter. Den store mengden av
P
.
crispus
biomasse kan gjøre post-harvest prosedyrer utfordrende. Naturlige produkter og urte medisiner er lovende kilder til nye terapeutiske midler for menneskelige helsevesenet [46]. I denne studien ble flavonoider med anti-metastatisk aktivitet isolert fra
P
.
crispus
, noe som indikerer at denne arten hadde potensielle helsefordeler. Vår studie gitt et vitenskapelig grunnlag for screening av lovende naturressurser som kilder til medisiner og foreslo en potensiell tilnærming til effektiv og bærekraftig utnyttelse av anlegget ressurser i konstruerte våtmarker.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 fil. Væskekromatografi (HPLC) analyse av to flavonoider isolert fra
P
.
crispus
.
Luteolin-3′-O-β-D-glukopyranosid (LU3’O-GP) (figur a). flavon-6-C-β-D-glukopyranosid (FL6C-GP) (fig b). HPLC anvendes en Agela C18-kolonne (symmetri R 4,6 x 250 mm) med metanol og H
2O (40%: 60%) som den mobile fase, ved en strømningshastighet på 1 ml /min i 40 min og brukt . UV /V deteksjon
doi: 10,1371 /journal.pone.0130685.s001 plakater (TIF)
Takk
Vi er takknemlige til faglig redaktør og anmelderne for deres verdifulle forslag. Vi ønsker også å takke den profesjonelle redaktører av Editage for sine engelsk redigering.
