Abstract
Bakgrunn
metylering nivåer av genomiske repetisjoner som lange ispedd nucleotide elementer (LINE-1) er representative for global metylering status og spiller en viktig rolle i opprettholdelsen av genomisk stabilitet. Målet med studien var å vurdere LINE-en metylering status på tykktarmskreft (CRC) i forhold til adenomatøs og ondartet progresjon, vev heterogenitet, og TNM-stadium.
metodikk /hovedfunnene
DNA ble samlet opp ved laser-fangst mikrodisseksjon (LCM) fra normal, adenom, og kreft vev fra 25 pasienter med TisN0M0 og fra 92 primær CRC pasienter av ulike TNM-etapper. De parafininnstøpte vevssnitt ble behandlet av
in-situ
DNA natriumbisulfitt modifikasjon (SBM). LINE-en hypometylering indeks (LHI) ble målt ved absolutt kvantitativ analyse av denaturert alleler (AQAMA) realtime PCR; en større indeksen indikeres forbedret hypometylering. LHI i normal, kreft mesenchymale, adenom, og CRC vev var 0,38 (SD 0,07), 0,37 (SD 0,09), 0,49 (SD 0,10) og 0,53 (SD 0,08), respektivt. LHI var signifikant større i adenom vev sammenlignet med sammenhengende normal epitel (
P
= 0,0003) og kreft mesenchymale vev (
P
0,0001). LHI var ikke signifikant forskjellig mellom adenom og tidlig kreft vev av Tis scenen (
P
= 0,20). LHI forhøyet med høyere T-stage (
P
0,04), var signifikant større i node-positive enn nodenegativ CRC pasienter (
P
= 0,03), og var betydelig større i stadium IV enn alle andre sykdomsstadier (
P
0,05).
Konklusjon /Betydning
Ved å bruke
in-situ
SBM og LCM celle utvalget vi viste tidlig debut av LINE-en demetylering under adenomatøs endring av kolorektal epitelceller og viste at LINE-en demetylering progresjon er lineær i forhold til TNM-stadium progresjon
Citation. Sunami E, de Maat M, vu A, Turner RR, Hoon DSB (2011) LINE-en Hypomety-lering Under Primær Colon Cancer Progresjon. PLoS ONE 6 (4): e18884. doi: 10,1371 /journal.pone.0018884
Redaktør: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 12 oktober 2010; Godkjent: 24 mars 2011; Publisert: 14 april 2011
Copyright: © 2011 Sunami et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studiene ble støttet av Weil Family Foundation (Los Angeles, California) og Leslie og Susan Gonda (Goldschmied) Foundation (Los Angeles, California). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Om lag 17-18% av det menneskelige genom består av lange ispedd nucleotide element (LINE-1) gjentas. Omtrent 500.000 avkortet og 3000 til 5000 i full lengde LINE-1-sekvenser er til stede i hele genomet [1]. I normale somatiske celler, line-1s tungt metylert, begrense aktivitetene til retrotransposal elementene og dermed hindre genomisk ustabilitet [2], [3]. LINE-1 sekvenser er moderat CpG rike, og de fleste denaturert CPGs ligger i 5 «regionen og kan oppføre seg som interne arrangører [2]. LINE-en metylering status er antatt å representere det genome-DNA bred metylering status, siden LINE-1-sekvenser som er sterkt gjentatt, allment utblandet humane retrotransposons. Ulike studier har vist en sammenheng viktige genomiske hendelser i kolorektal kreft til LINE-en metylering. For eksempel, 18q tap av heterozygositet (LOH) (+) kolorektalcancer (CRC) viser en lavere gjennomsnittlig LINE-en metylering nivå [4]. En invers relasjon har vært rapportert mellom LINE-en metylering og mikro ustabilitet (MSI) + /CpG island methylator fenotype (CIMP) + /BRAF V600E mutasjon CRC [5], [6]. Det har nylig blitt rapportert en signifikant invers korrelasjon mellom nivåer av LINE-en metylering og det totale antall kromosomavvik, inkludert både tap og gevinst i gastrointestinal stromal tumor (GIST) [7]. Når det gjelder CRC, Bariol et al. avslørte at den globale DNA hypometylering nivået var høyere i neoplastiske lesjoner (inkludert hyperplastiske polypper og adenomer) enn i normal slimhinne [8].
Et viktig problem i vurderingen av LINE-en metylering status på CRC er at CRC er meget heterogent og inneholder ulike infiltrerende celler slik som stromale celler, lymfocytter og blodårer. Den stromale komponent og graden av lymfocytt-infiltrering varierer mellom CRC. Denne heterogeniteten kan forvirre molekylær analyse, særlig av LINE-en metylering status, som LINE-1 er metylert i normale celler. For å oppnå nøyaktige tolkninger, er det derfor nødvendig å isolere spesifikt tumorceller fra vevsprøver. Tidlig stadium CRC primærtumor analyse uten histopatologi styrt mikrodisseksjon for vurdering av genomisk metylering status er ikke nøyaktig. Dette er spesielt en problematisk sak ved vurdering CRC progresjon og når man sammenligner adenom til kreft vev. Robuste og nøyaktige teknikker for slike analyser ikke eksisterer; Derfor utviklet vi en praktisk tilnærming. Vi benyttet laser-capture mikrodisseksjon (LCM) for å høste cellene av interesse direkte uten forurensning av ikke-cancerceller. Natriumbisulfitt modifikasjon (SBM) av genomisk DNA er en vanlig brukt metode for å skjelne metylering status av CpG øyer [9]. Konvensjonelle metoder for SBM resultere i 84% til 96% tap av prøve-DNA [10]. Denne betydelige tap av templat-DNA nødvendig store mengder starter vevsprøve. For å redusere tap av prøve-DNA fra celler samlet av LCM, har vi utviklet en
in-situ
SBM-protokollen. DNA ble endret mens de fangede cellene er fortsatt festet på LCM cap.
Tallrike studier har blitt rapportert å identifisere CRC-forbundet epigenetiske avvik som promoter region hypermethylation av tumorsuppressorgener. Et annet karakteristisk forandring i CRC angående DNA-metylering status er global hypometylering [11], [12]. Progresjon av LINE-en hypometylering nivå under utviklingen av CRC malignitet og progresjon av sykdommen har ikke blitt grundig vurdert. Bestemme histopatologi i forbindelse med utbruddet av tap av LINE-en metylering og utviklingen av LINE-en metylering langs aksen av sykdomsstadiet progresjon ytterligere kan avklare rollen til LINE-en hypometylering i CRC sykdom. I denne studien, LCM,
in-situ
SBM, og absolutt kvantifisering av denaturert alleler (AQAMA) ble brukt i kombinasjon med prøver fra pasienter med adenomer som inneholder
in situ
invasiv adenokarsinom (Tis) og pasienter med mer avansert CRC. Dette tillot vellykket nøyaktig analyse av LINE-1 hypometylering nivåer under primær tumorprogresjon mellom progressive T-etapper, node positiv versus node negativ sykdom, og fjern metastatisk versus lokal og lokoregionalt sykdom.
Resultater
AQAMA linearitet for LINE-en metylering nivå vurdering
Først vurderte vi nøyaktigheten av AQAMA i å vurdere ulike nivåer av LINE-en metylering. Den store fordelen med AQAMA er at den kvantitative måling av denaturert og unmethylated lene er utført i et enkelt PCR-reaksjon, som gir utmerket kontroll sammenlignet med to separate PCR-reaksjoner for metylert og unmethylated allel analyse. Kvantifiseringen er absolutt med standardkurver for å bestemme antall kopier. For en negativ kontroll, det analyse reaksjonen inneholdt universell unmethylated kontroll-DNA som ble syntetisert som beskrevet i en tidligere publisert studie [13]. For en positiv kontroll, brukte vi universell metylert kontroll DNA ekstrahert fra perifere blod lymfocytter fra en frisk donor og behandlet med
SSSI metyltransferase.
For denne studien, utarbeidet vi trinnvis blandinger av denaturert og unmethylated cDNA standard og målte dem som prøver med ukjent metylering nivå. Lineariteten AQAMA assay for LINE-1-metyleringen nivå (figur 1) ble evaluert ved Pearsons koeffisient på linearitet: 0,99 (
P
0,001), noe som viste høy nøyaktighet i diskriminerende LINE-1-metyleringen nivåforskjeller.
Plot av målte (bokser) og forventet (x) verdier viser nøyaktigheten av AQAMA LINE-1-analysen.
optimalisering av
i-situ
SBM innstillinger
LCM ble utført for å høste celler av interesse (figur 2a) for å få nøyaktig representasjon av celler i spørsmålet for vellykket AQAMA måling. Tre forskjellige sample vev områder av 10
4, 10
5 og 10
6 mikrometer
2 høstet fra 4 mikrometer tykke parafin-embedded arkiv vev (torv) ble testet. Gjennom analyse, vi etablert at 2 × 10
5 mikrometer
2 av 4 mikrometer tykke torv resultater i ca 10
5 kopiantall av LINE-en DNA. Dette ga betydelige reproduserbare nivåer av DNA LINE-en metylering analysen. Etter LCM,
in-situ
SBM ble optimalisert på en lignende måte som ble utført i den tidligere studier av på-lysbilde SBM med bestemte genomiske sekvens amplifikasjon [14]. Omregningskursene for modifiserte DNA av
in-situ
SBM var 18,4 ± 14,9%, 87,8 ± 7,8% og 94,4 ± 2,1% ved inkubasjon innstilling på 60 ° C i 2, 4 og 8 timer, henholdsvis (figur 2b). Konverteringsfrekvensene økt med økning i inkubasjonsvarigheten, der etter 8 timer nådde det ca 95%. Utbyttet av total DNA (modifisert og umodifisert DNA) ikke avtar med økende inkubasjonstid opptil 8 timer (figur 2c). Fra disse resultatene, ble en inkubasjon innstilling på 60 ° C i 8 timer valgt som optimal for
in-situ
SBM.
En viser spesifikk henting av målceller ved LCM. B og C viser resultater for DNA konverteringsrate (%) og for DNA-innhold (× 10
4 kopitall), henholdsvis i 8 forskjellige prøver på 3 forskjellige ruge perioder.
line- 1 hypometylering nivåer under CRC progresjon
Tjuefem pasienter med TisN0M0 lesjoner med tilstedeværelse av normal, adenom (lav eller middels grad) og Tis kreftceller på samme vev delen ble valgt. Ved hjelp av LCM ble fire forskjellige vevsprøver (normal slimhinne, adenom, kreft og kreft mesenchymale vev) tatt fra hver pasient.
In-situ
SBM og LINE-en AQAMA analysen ble utført på hver prøve. Nivået på LINE-en hypometylering (LHI) ble beregnet som Q
unmeth /(Q
unmeth + Q
met), hvor Q
unmeth og Q
meth er de absolutt kopiantall av unmethylated og metylert henholdsvis LINE-1,. Ved normal slimhinne i tilknytning til tumorkreft og kreft mesenchyme, den gjennomsnittlige LHI var 0,382 og 0,366, respektivt. Det var ingen forskjell av LHI mellom kreft mesenchyme og normal slimhinne ved siden av tumor. LHI var signifikant større i den sammenhengende adenom og kreftvev av tidlig stadium enn i normal slimhinne (gjennomsnittlig LHI = 0,49, 0,52 og 0,38, henholdsvis) (figur 3). Fra disse resultatene, konkluderte vi med at LINE-en hypometylering skjer i den tidlige fasen av CRC tumorigenesis. Videre har disse eksperimentene demonstrerte nødvendigheten av å bruke detaljerte fremgangsmåter for DNA-samling ved analyse LINE-1 metylering nivåer, for eksempel målcellen isolert ved LCM. På bakgrunn av dette ble LCM brukt til DNA-prøve kolleksjon for alle eksperimenter i våre studier.
LINE-en hypometylering og vev heterogenitet
I analysen av LHI av normal, kreft mesenchymale, adenom, og CRC-vev, var 0,38 (SD 0,07), 0,37 (SD 0,09), 0,49 (SD 0,10) og 0,53 (SD 0,08), respektivt. For å teste om det er heterogenitet av LINE-en hypometylering innenfor en svulst ble 20 T3N0 svulster valgt for analyse. Prøve-DNA ble samlet opp fra den luminale overflaten, og det dypeste invasional området av hver tumor. LHI av disse to loci ble sammenlignet (figur 4). Den midlere LHI var 0,58 i overflaten og 0.54 i den dypeste loci. LHIs var lik i overflaten og i den dypeste loci og svulst heterogenitet av LINE-en hypometylering ble ikke observert.
Målte LHI verdier i T3N0 CRC svulster sammenligne celler hentet fra overflaten luminal tumorområdet til den dype invasjonen svulst området.
LINE-en hypometylering og CRC scenen
for å vurdere endring av LINE-1 hypometylering nivåer i henhold til tumorprogresjon, ble sammenhengen mellom Dukes stadier og lHI analysert. Dukes A (n = 38), Dukes B (n = 18), og Dukes C (n = 29) prøver ble valgt (figur 5c). Den midlere LHI i Dukes A, B og C var 0,533, 0,607, og 0,621, respektivt. Dukes B og C svulster viste signifikant større LHI enn Dukes A svulster. Forholdet mellom LINE-en metylering og T-fasen (T1 (n = 24), T2 (n = 21), T3 (n = 21), og T4 (n = 26)), så vel som N-trinn (N0 ( n = 57) og N1 (n = 35)) ble analysert. Økningen av LHI i henhold til tumorinvasjon (figur 5a), og differansen av LHIs mellom lymfeknute positive og negative tilfeller (figur 5b) ble vurdert. Den midlere LHI av T1, T2, T3 og T4 var 0,50, 0,58, 0,60 og 0,65, respektivt. LHI var betydelig større (
P
= 0,03) for tilfeller med positive lymfeknuter (LHI = 0,64) enn negative lymfeknuter (LHI = 0,54). Prediksjon av lymfeknutestatus ville være den mest klinisk relevante og derfor en mottaker driftskurve (ROC) ble analysert for å skille hvis metastaser positivt kan være en prognostisk indikator på den primære CRC ved hjelp av LHI (figur 6). T-trinns avansement korrelerte signifikant med økende LHI (
P
= 0,01). Vi har også analysert tilfeller med fjernt sykdom spredning (Dukes D, n = 6), og disse tilfellene viste betydelig større LHI forhold til Dukes C CRC (
P
= 0,05) alene og til alle andre Duke stadier (
P
0,0001). En ROC ble plottet for å vise nøyaktigheten for prediksjon av lymfeknuteaffeksjon av LHI (figur 6). Dette viste at prediktiv verdi gir en sensitivitet på 0,77 med en spesifisitet på 0,62. Det var betydelig lavere LHI for høyresidig versus kolon venstre-sidig (
P
0,05). Imidlertid ble det ikke observert signifikante forskjeller mellom LHI for differensiering status eller kjønn.
I A-, B- og C forskjeller vist mellom Duke etappe, T-scenen og N-stadium, henholdsvis.
X-aksen representerer 1-spesifisitet og y-aksen følsomhet. Arealet under kurven (AUC) ble beregnet til 0,69. P = 0,003.
Disse analysene viste en positiv lineær sammenheng mellom utviklingen av LINE-en hypometylering og CRC scenen progresjon.
Diskusjoner
endring av DNA metylering mønstre har blitt studert i mange typer kreft [15]. Hypermethylation av spesifikke kreftrelatert genet promoter regioner og global DNA hypometylering under tumorprogresjon er nå vist som en betydelig eiendom av kreft [16], [17]. Hypometylering av LINE-1 DNA gjenta som utgjør 20% av genomet har blitt foreslått som et surrogat for global DNA hypometylering [5], [18], [19], [20]. Yang et al. viste at genom-wide metylering kan estimeres ved vurdering [21]. Alu gjentar er Sines, mer kompleks, og mangfoldig enn linjer. Pålitelig metylering analyser for å studere Alu er ikke godt begrunnet. En nøyaktig analyse representant for global metylering fenomenet ikke eksisterer; Imidlertid kan LINE-en fungere godt som et surrogat.
LINE-en hypometylering er ikke spesifikke for kreftceller, og om lag en tredjedel av LINE-en er unmethylated i normal slimhinne og kreft mesenchymalceller [22], [23]. Den mulige kontaminering av prøven DNA som består av kreft sammen med mesenchymale celler, slik som fibroblaster eller lymfocytter, kan derfor føre til unøyaktige resultater. På grunn av dette, særlig med hensyn LINE-en metylering analyse, er nøyaktig isolering av målceller meget viktig. For å minimere forurensning og få celler av interesse bare, vi vellykket integrert LCM i LINE-en metylering analyser i denne studien. Vi vurderte
in-situ
SBM kombinert med LCM som en tilnærming for å forbedre DNA metylering analyse effektivitet, noe som gjør det mulig for evaluering av celler fra bestemte histopathologically definert mål regioner av svært tidlig stadium primære CRC utvikling. En fersk studie har gitt noen bevis på at resultatene er sammenlign om macrodissection eller LCM brukes [24]. Dette er imidlertid svært avhengig av analysens følsomhet. Begrepet LCM, derimot, er state-of-the-art og overlegen macrodissection når små målrettede vev inngangs prøven for DNA-analyse er ønsket. Først når et tidlig stadium i små lesjoner må vurderes, og bare små områder av spesifikke kreftceller er tilgjengelige for analyse, gir mikrosstyrt celle pick-up nøyaktighet og kontroll av inngangs prøve-DNA. For det andre er LINE-1-metylering ikke cancer-spesifikk, og som viser våre resultater, er funnet i kreft stromal vev. Med den nåværende forståelse av svulsten mikromiljøet og tumor stromal heterogenitet, er det meget viktig å utføre LCM-analyse for bestemte vev DNA henting. Dessuten ville LINE-en metylering kan forventes å variere i tilstøtende «normale» celler av en primærtumor siden lysmikroskopi patologi analyse er ikke alltid nøyaktig å identifisere tidlig fase kreft celletransformasjon.
In-situ
SBM ble designet basert på on-lysbilde SBM [14] som ble tilpasset fra et konsept som rapportert av Nuovo et al [25]. On-lysbilde SBM er en kraftig prosedyre for metylering analyse ved hjelp TORV; men blir etter on-lysbilde SBM prøven også lim på glass-slide, noe som gjør det vanskelig for LCM å effektivt fange målceller til tider.
In-situ
SBM eliminerer de mange DNA isolering og rensing av klassiske SBM, som er den viktigste årsaken til DNA tap ved vurdering av lave mengder DNA fra begrenset antall celler. Vår studie beskriver
in situ
behandling av vev /celler direkte ved sulfitt analyse integrert med LCM. En begrensning av analysen er at analyse av metylering status av enkle celler fremdeles er vanskelig på grunn av den DNA-degraderende arten av SBM-protokollen og begrenset DNA for metylering analyse.
å kombinere LCM,
in-situ
SBM, og AQAMA analysen, LINE-en hypometylering ble demonstrert i lav til middels grad adenom, et tidlig stadium av tykktarms tumorigenesis som tidligere vist [5], [6]. En signifikant reduksjon i LINE-1-metyleringen ble målt sammenligne adenom med den tilstøtende normal epitel. Ingen signifikant forskjell ble vist da den adenom ble sammenlignet med den sammenhengende kreft Tis trinn vev som også ble nylig rapportert av Kwon et al [26]. Dette resultatet skiller seg fra studier av Ibrahim et al. og ved Irahara et al. at funnet signifikante forskjeller av LHI mellom kolorektal adenom og CRC [24], [27]. Det er viktig å merke seg at disse studiene ikke har angitt TNM-stadium av prøvene. Den ikke-signifikant forskjell mellom adenom og cancervev i vårt studium forklares ved anvendelse av en heterogen gruppe av cancervev fra den tidligste stadium kreft (
in situ
karsinom, Tis). Våre resultater bekrefter at LINE-en metylering nivåene varierer i ulike TNM-etapper. Når LHI i adenomer ble sammenlignet med mer avansert stadium CRC prøvene i vårt studium forskjellene var signifikante (data ikke vist). Dette viser at unmethylated LINE-en ikke kan spille en viktig rolle i prosessen når adenom cellene får sin første invasive aktivitet.
Den økte heterogenitet finnes i større, avanserte lesjoner er en indikasjon på at det finnes undergrupper av CRC som er i stand til å opprettholde metylering av LINE-en. På den annen side, observerte vi at to Dukes stadium D tilfellene hadde en LHI på 0,9 som kun ble observert i denne undergruppe. Heterogenitet er et kjent klinisk problem som sykdom resultat varierer sterkt for CRC pasienter med samme TNM-stadium. Mangfoldet av LHIs innenfor de ulike stadiene i vår studie kan gjenspeile dette. Mekanismene som styrer vedlikehold av LINE-en metylering og hvordan de påvirker tumorprogresjon er fortsatt ukjent.
I en stor studie av Baba et al [28], en relasjon til sykdom scenen har blitt beskrevet med høyere line- 1 demetylering i mer avansert sykdom, men forskjellene var svært små. Også ifølge studiens resultater, LINE metylering nivåene var høyere i stadium II sykdommen i forhold til scenen I. Denne studien analyserte hele vevssnitt uten å bruke mikrodisseksjon. En av grunnene til at forskjeller var små og scene II viste høyere LINE-en metylering kan være graden av mesenchymale celle DNA-kontaminering i prøven DNA. Våre resultater viser at ikke bare ved normal slimhinne, men også mesenchymalceller i kreft, viser om lag en tredjedel av LINE-en hypometylering. Dette støtter vår vekt på at bestemt mål celle isolasjon er nødvendig. Prognostisk verdi av LINE-1 metylering nivåer i CRC har blitt rapportert [29]; Imidlertid kan variasjoner mellom tumorer være et resultat av stromal /mesenchymale komponent forurensning [30].
Vårt studium viser en klar trinnvis positivt lineært forhold for tap av LINE-1-metylering for å T-, N-, så vel som M-fasen. Nivåene av LINE-en demetylering kan derfor være nyttig i flere kliniske situasjoner. Preoperativ analyse av CRC biopsimateriale som kan forutsi T-stadium (Tis vs. T1 eller T1 vs T2) kan være til nytte for å avgjøre om endoskopisk reseksjon (dvs. transslimhinne eksisjon av endetarmskreft) kan forsøkes versus åpen reseksjon kirurgi, som er forbundet med mye høyere sykelighet /dødelighet. N-trinns forutsigelse kunne bli brukt til å velge CRC-pasienter for å teste effektiviteten av neoadjuvant terapi. Videre kan M-scenen prediksjon brukes som en biomarkør for å foreta ytterligere metastatisk preoperativ avbildning med PET-CT i tillegg til standard opparbeidelse. For å vurdere om preoperativ tumor biopsimateriale fra luminal side er representant, vurderes vi svulst heterogenitet. Sammenligningen mellom den dypeste del og overflaten av tumoren viste at svulst heterogenitet av LINE-en metylering status er forholdsvis subtil. Resultatene tyder på at CRC biopsiprøver samlet inn under koloskopi er representative og kan brukes for vurdering av en svulst er LINE-en metylering status analyse. Gjennomsnittlig LHI signifikant forskjellig mellom node positive og node negative CRC; hvorved ROC analyse viste diskriminerende resultater. Det var overlapping av LHI verdier mellom N + og N0 kategorier og sensitivitet og spesifisitet var relativt lav. Dette ble også sett på T- og M-scenen diskriminering. Større studier er nødvendig for å fastslå nytten av LHI som en enkelt biomarkør eller kombinasjon med andre biomarkører.
I konklusjonen, studien viste at LINE-en metylering status korrelerer med patologisk stadium av CRC. Videre er dens nøyaktig analyse med LCM eller tilsvarende teknikker er nødvendig, og som støtte mesenchymale vev som omgir tumorcellene tydelig kan påvirke resultatet. Utbruddet av LINE-en demetylering oppstår svært tidlig når normal kolorektal slimhinne utvikler seg til et adenom med lav eller middels dysplasi. Resultatene viste en klar og signifikant lineær korrelasjon av progresjon av tap av metylering LINE-ett element til progresjon av CRC sykdom (figur 7) med hensyn til T-, så vel som N- og M-fasen. Disse funnene tyder kontinuerlig tap av genomisk metylering under CRC utvikling, noe som indikerer at høye epigenomic og dermed genomiske hendelser er viktige funksjoner i tumorprogresjon.
Materialer og Metoder
Måling av linje- 1 hypometylering
metylering status for LINE-1 ble evaluert av AQAMA analyse for nøyaktig vurdering av CpG island metylering nivåer [31]. Før du utfører AQAMA analysen av LINE-en metylering status, ble SBM brukt på hver DNA-prøve som tidligere beskrevet [32]. AQAMA krever en forover og en revers primer som vil amplifisere målsekvensen uavhengig av metylering status, som de som forover og revers primer sett ikke inneholder CpG. Metylering status er vurdert av to mindre-groove-binding (MGB) molekyl som inneholder prober (Applied Biosystems): en metylering spesifikke og en unmethylation spesifikke. Den 5 «primer, 3′ primer, metylering-spesifikk probe og unmethylation-spesifikke probe er oppført som følger: 5»-GGGTTTATTTTATTAGGGAGTGTTAGA-3 «(fremover), 5′-TCACCCCTTTCTTTA ACTCAAA-3» (revers), FAM-5 « -TGCGCGAGTCGAAGT-3′-MGB-BHQ og VIC-5′-TGTGTG AGTTGAAGTAGGG-3»-MGB-BHQ. Reaksjonsblandingen for hvert AQAMA PCR bestod av DNA-templat, 0,4 umol /L av den forover og revers primer, 1,4 enheter av
iTaq
DNA-polymerase (Bio-Rad, Hercules, CA), 350 umol /L hver deoksynukleotidtrifosfat og 0,025 pmol av hver MGB sonde med 5 mmol /l Mg
2+. PCR-amplifikasjon ble utført med pre-syklus varmeaktivering av DNA-polymerase ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder, annealing og forlengelse ved 60 ° C i 60 sek. Det absolutte kopi-antall i hver prøve ble bestemt ved anvendelse av en standard kurve etablert ved å forsterke seks alikvote duplikater av maler med kjente kopiantall (10
* 6 til 10
* 1 kopier). Vi har tidligere beskrevet fremgangsmåter for syntese av de standardprøve med kjent kopiantall i AQAMA analyse [31]. For en negativ kontroll, det analyse reaksjonen inneholdt universell unmethylated kontroll-DNA som ble syntetisert som beskrevet i en tidligere publisert studie [13]. For en positiv kontroll, brukte vi universell metylert kontroll DNA ekstrahert fra perifere blod lymfocytter fra en frisk donor og behandlet med
SSSI metyltransferase
. I korthet
SSSI metyltransferase
behandles, bisulfitt modifisert, ble PBL donor-DNA amplifisert ved PCR med primeren satt til å lage standard-prøven for fullt metylert LINE-1. For konstruksjon av standardprøven for unmethylated LINE-en vi brukte universal unmethylated kontroll-DNA, fremstilt som tidligere beskrevet [13]. Det fullstendig denaturert og unmethylated PCR-produkt ble ligert inn i en pCR 2.1-TOPO kloningsvektor (Invitrogen); klonene ble forvandlet til
Escherichia coli
DH5a-a celler; og kulturer ble ekspandert som tidligere beskrevet [33]. Plasmider som inneholder mål-genet ble renset og kvantifisert ved UV-spektrofotometri. Dette ble brukt til å lage fortynningsserie av kjent kopitall for å konstruere standardkurver for absolutt mengdebestemmelse. Alle kvantitative PCR-analyser ble utført på en blindet måte uten kjennskap til prøven identitet. Gjennomsnittsverdier ble beregnet ut fra triplikate reaksjoner. LINE-en hypometylering indeks (LHI) av hver prøve ble beregnet som følger: LINE-en LHI = unmethylated kopiantall /(metylert kopiantall + unmethylated kopi nummer)
LCM
LCM var. brukes til DNA-prøve kolleksjon for alle eksperimenter i vår studie. Prinsipper og teknisk grunnlag av LCM er beskrevet i detalj ved å avverge F et al. [34]. Celler ble samlet inn med LCM system som havner et digitalt kamera system som oppdager de valgte cellene. Dette gjør at den samme mengden kvadrat mikrometer av celler kan bli plukket opp for hver prøve.
In-situ
SBM analysen optimalisering
For å måle LINE-en hypometylering index etter mikrodisseksjon bruker LCM, vi utviklet
in-situ
SBM prosedyre basert på tidligere innført på lysbildet SBM teknikk.
In-situ
SBM er designet for å analysere metylering status av gener i små mengder DNA hentet fra formalinfiksert torv.
In-situ
SBM har som mål å eliminere DNA isolering og rensing trinn som utføres før selve SBM i den klassiske prosedyre som er den viktigste årsaken til DNA-tap.
In-situ
SBM inneholder tre trinn; denaturering av DNA, SBM og samling av modifiserte DNA. Først ble cellene microdissected fra deparaffinized og rehydratiserte vevssnitt som stikker på hetten som brukes i LCM inkuberes i 0,2 mol /L NaOH ved romtemperatur i 15 min. Da prøvene på hetten blir inkubert i 3 mol /l natriumbisulfitt-løsning med 0,5 mmol /l hydrokinon (pH 5) i mørket. Tre inkubasjon innstilling ble testet angående konverteringsfrekvenser (frekvensen av endring av cytosin til uracil) og avkastning av modifiserte DNA og inkubasjon innstilling på 60 ° C i 8 timer ble valgt som optimalt (se resultater avsnitt). Etter inkubering ble prøvene på hetten skylt med destillert vann, dyppet i 0,3 mol /l NaOH i 15 min for å desulfonate de modifiserte cytosines, og deretter avsaltet i destillert vann ved 60 ° C i 2 timer. Til slutt ble 50 ul lyseringsbuffer inneholdende 4 pg proteinase K, 2,5% Tween 20, 50 mmol /liter Tris, og 1 mmol /L EDTA tilsatt på hetten og inkubert ved 50 ° C i 24 timer etterfulgt av varme deaktivering av proteinase K ved 95 ° C i 10 min. I hver påfølgende AQAMA reaksjon ble 1-2 mL lysat brukes som en mal uten DNA rensing.
Etikk erklæringen
Torv prøver av CRC ble innhentet fra pasienter som gjennomgikk kolektomi eller proctectomy mellom 1995 og 1998 på Saint John Health Center /John Wayne Cancer Institute, Santa Monica, CA. Studien ble gjennomgått og godkjent av Saint Johns Health Center /John Wayne Cancer Institute «Institutional Review Board (IRB) og Vest IRB. Skriftlig samtykke ble innhentet fra pasientene.
TORV CRC prøver
Alle vevsprøver hadde blitt fikset i 10% bufret formalin i 24 timer og parafin-embedded. For LCM etterfulgt av
in-situ
SBM og LINE-en metylering analyse av AQAMA, seksjoner (4 mikrometer) ble kuttet med en mikrotom fra hver TORV blokk. Cellene ble samlet inn med Veritas® automatiserte LCM system (Life Technologies). En av fordelene med dette systemet er at det muliggjør kontroll av de firkantede mikrometer av celler som er hentet opp for hver prøve. For å vurdere forskjellene i LINE-en metylering status mellom normal slimhinne, adenom, kreft og kreft mesenchymale bindevev, ble 25 prøver av tidlig CRC i adenom (TisN0M0) valgt av en patolog (RRT) spesialisert seg på CRC som inneholdt alle fire av disse vev kategorier. Å studere ondartet forandring, ble 94 kirurgisk resected CRC prøver anskaffet for å undersøke endring av LINE-en metylering status i henhold til kreft progresjon. LCM ble utført på begge studiegrupper. Korrelasjonen mellom klinisk-patologisk stadium som T scenen, lymfeknutestatus og Dukes stadium og LINE-en metylering indeksen ble analysert.
Statistisk analyse
Alle data er uttrykt som gjennomsnitt +/- SD, og prosenter etter behov.
