Abstract
leverkreft (HCC) er en av de viktigste årsakene til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis. Kirurgisk reseksjon og konvensjonell kjemoterapi og strålebehandling til slutt mislykkes på grunn av svulst tilbakefall og HCC motstand. Utviklingen av nye behandlingsformer mot HCC er derfor presserende behov. De cyclin-avhengig kinase (CDK) trasé er viktige og godt etablerte mål for kreftbehandling. Spesielt er CDK2 en nøkkelfaktor som regulerer cellesyklusen G1 til S overgang og et kjennemerke for kreft. I denne studien benyttet vi vår gratis og open-source protein-ligand docking programvare, iDock, prospektivt for å identifisere potensielle CDK2 hemmere fra 4,311 FDA-godkjente bioteknologiske legemidler ved hjelp av en fornyer strategi og et ensemble docking metodikk. Sortert etter gjennomsnittlig iDock poengsum, ble ni forbindelser kjøpt og testet
in vitro
. Blant dem, anti-psykotisk legemiddel fluspirilene utstilt høyeste anti-proliferativ effekt i menneskelig leverkreft HepG2 og Huh7 celler. Vi demonstrerte for første gang at fluspirilene behandling betydelig økt prosentandelen av celler i G1 fase, og redusert uttrykk for CDK2, cyklin E og Rb, så vel som de phosphorylations av CDK2 på Thr160 og Rb på Ser795. Vi undersøkte også en anti-kreft effekt av fluspirilene
in vivo
i BALB /c nakne mus subkutant xenopodet med human leverkreft Huh7 celler. Våre resultater viste at oral fluspirilene behandling signifikant hemmet tumorvekst. Fluspirilene (15 mg /kg) utviste sterk anti-tumor aktivitet, sammenlignbar med den ledende kreft legemiddel 5-fluoruracil (10 mg /kg). Videre er cocktail behandling med fluspirilene og 5-fluorouracil utviste den høyeste terapeutiske effekt. Disse resultatene antydet for den første gang at fluspirilene er en potensiell CDK2-inhibitor og en kandidat anti-kreft legemiddel for behandling av human leverkreft. I lys av det faktum at fluspirilene har en lang historie med trygg bruk på mennesker, kan vår oppdagelse av fluspirilene som en potensiell anti-HCC narkotika presentere en umiddelbart gjeldende klinisk terapi
Citation. Shi XN, Li H, Yao H, Liu X, Li L, Leung KS, et al. (2015)
I Silico
Identifisering og
In Vitro Hotell og
In Vivo
Validering av Anti-psykotiske Drug Fluspirilene som en potensiell CDK2 Inhibitor og en kandidat Anti-Cancer Drug. PLoS ONE 10 (7): e0132072. doi: 10,1371 /journal.pone.0132072
Redaktør: Yu-Jia Chang, Taipei medisin Universitetet, TAIWAN
mottatt: 20 januar 2015; Godkjent: 09.06.2015; Publisert: 06.07.2015
Copyright: © 2015 Shi et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Hsiang-fu Kung akademiker arbeidsstasjon fra Kunming Medical University, National Natural Science Foundation of China (NSFC) 81272549, Key Lab prosjekt av Shenzhen (ZDSY20130329101130496) fra Kina, direkte Grant fra det kinesiske universitetet i Hong Kong, GRF Grant (prosjekt Referanser 414 413, 772 910 og 470 911) fra Stipend Council of Hong Kong.
Konkurrerende interesser : forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
leverkreft (HCC) er den vanligste typen av leverkreft.. Kun 30% til 40% av HCC pasienter er kvalifisert for kurativ behandling, som inkluderer kirurgisk reseksjon som det første alternativet, levertransplantasjon og perkutan ablasjon. Imidlertid er det en høy frekvens av tilbakefall tumor etter kirurgisk reseksjon, og de fleste HCCs synes resistent til konvensjonell kjemoterapi og radioterapi. Derfor utvikling av nye behandlingsformer mot HCC er svært etterspurt.
Årsaken til HCC involverer flere veier. De cyclin-avhengig kinase (CDK) trasé som viktige terapeutiske mål for kreftbehandling har blitt godt etablert. CDK er enzymer involvert i celle replikering, og deres rolle i tumorvekst har lenge gjort dem til attraktive narkotika mål. Men tidlige industri forsøk på å hemme CDK å gjenopprette cellevekst til normale har møtt toksisitet spørsmål. Første generasjons CDK hemmere var uspesifikke, begrenser mange forskjellige CDK (det er mer enn 20, hvorav mange har vært innblandet i en rekke krefttyper), og som resulterer i den type toksisitet og dempet effekt sett med eldre chemotherapies.
Cyclin-avhengig kinase 2 (CDK2) er en av de serin /treonin proteinkinaser. Det spiller en sentral rolle i regulering av cellesyklusen overgang fra G1 til S-fasen, og således i å kontrollere celleformering. Derfor, CDK2-inhibitorer er potensielt effektive anti-kreftmidler. Selv om en rekke CDK2-inhibitorer er blitt beskrevet i litteraturen [1], og noen har kommet inn i kliniske forsøk faser, f.eks Flavopiridol [2], roscovitine [3] og olomoucin [4], har ingen av dem blitt godkjent for klinisk anvendelse på grunn av ulike årsaker, for eksempel toksisitet og multi-target-spesifisitet. Videre har ingen av de rapporterte CDK2 hemmere for behandling av HCC.
I denne studien brukte vi vår gratis og open-source protein-ligand docking programvare iDock [5, 6] til skjermen FDA-godkjente liten bioteknologiske legemidler mot CDK2, og dermed unngår toksisitet problem. Vi vedtok
i silico
tilnærming av struktur-baserte virtuelle screening og ensemble docking å gjenbruke godkjente legemidler for behandling av kreft som involverer CDK2 regulering, med stort fokus på menneskelige leverkreft (HCC). Vi testet ni beregningsmessig favorisert forbindelser
in vitro
i HCC cellelinjer HepG2 og Huh7, og hell identifisert antipsykotisk legemiddel fluspirilene som en potensiell CDK2 inhibitor. Vi utførte
in vivo
eksperimenter i nakne mus xenopodet med Huh7-celler, og viste at fluspirilene oppviste sterk anti-tumoraktivitet kan sammenlignes med den ledende kreft legemiddel 5-fluoruracil, karakterisert ved å etablere fluspirilene som en kandidat anti kreft narkotika. Vi viste også at cocktail behandling med både fluspirilene og 5-fluorouracil kunne produsere synergistisk terapeutisk virkning. Til slutt, analyserte vi den anslåtte binding konformasjon av fluspirilene og avslørte de kritiske inter interaksjoner som muligens styrer fluspirilene binding til CDK2.
Metoder og materialer
Etikk uttalelse
Denne studien var godkjent av forsøksdyretikkutvalg av Kunming Medical University.
Ensemble docking og sammensatte utvalg
det er så mange som 346 løst X-ray krystallografiske strukturer av CDK2 fra PDB (protein data Bank ) [7, 8] med en Uniprot ID P24941 (S1 tabell). Blant dem, samlet vi 44 krystallstrukturer av CDK2 i kompleks med en bundet ligand (tabell 1; S1 fig). Disse 44 strukturene ble valgt fordi de ikke inneholder metallioner, som kan påvirke nøyaktigheten av forankrings iDock [6], og også fordi de inneholder en bundet ligand, som koordinerer bidrar til å definere et leteområdet lett. En tidligere skrevet skript [6] ble gjen brukes til automatisk å definere forankringsleteområdet ved å finne den minste kubisk boks som dekker hele den ko-krystalliserte ligand og deretter strekker seg i boksen ved 10a i alle tre dimensjoner. De 44 CDK2 strukturene ble manuelt hentet fra deres tilhørende komplekser med co-krystallisert ligander og vann fjernet, og deretter konvertert fra PDB format til PDBQT format ved hjelp av prepare_receptor4.py manus av AutoDockTools [9].
for å teste re-dokking nøyaktigheten av iDock, co-krystallisert ligander ble også manuelt hentet fra deres tilsvarende komplekser og konvertert fra PDB format til PDBQT format ved hjelp av prepare_ligand4.py manus av AutoDockTools [9]. Disse ligander ble så dokket tilbake til sine tilsvarende CDK2 struktur, og deres kvadratisk middelavvik (RMSD) fra co-krystallisert konformasjon ble beregnet.
De strukturer av FDA-godkjente legemidler ble innhentet fra DBAP og FDA kataloger av ZINC databasen [10, 11], hvor DBAP katalogen omfatter godkjente legemidler som samles inn fra DrugBank databasen [12] og FDA katalogen omfatter godkjente legemidler samlet inn via DSSTox (Distributed struktur-søkbar Toxicity) prosjekt. Den DBAP katalog av versjon 2014-03-19 med 1,738 forbindelser og FDA katalog av versjon 2012-07-25 med 3,176 forbindelser ble lastet ned. Blant disse 4,914 forbindelser, 4311 var unik i form av ZINC ID. Disse 4,914 forbindelser i Mol2 format ble deretter omgjort til PDBQT format ved hjelp av prepare_ligand4.py manus av AutoDockTools [9].
Vår fri og åpen kildekode docking programvare iDock v2.1.2 [6] ble deretter henrettet for å forutsi bindings conformations og bindingsaffinitetene av 4,914 forbindelser når dokket mot 44 CDK2 strukturer ved hjelp av et ensemble docking strategi [13-15]. For hver proteinstruktur, kart fri energi rutenett med en finjustering på 0,08 Å ble bygget parallelt, og for hver forbindelse, ble 256 Monte Carlo conformational optimalisering oppgaver parallelt i flere prosessorkjerner.
Etter docking, iDock avgis et maksimalt antall av ni spådd conformations for hver inngang sammensatte. Den dokket konformasjon med den beste iDock Poengsummen ble valgt fordi det var tidligere vist seg å være den mest sannsynlige er nærmest krystall konformasjon med en re-dokking suksessrate på mer enn 50% på tre forskjellige benchmarks [6]. De 4,914 forbindelser ble sortert i stigende rekkefølge av deres spådd bindende fri energi i gjennomsnitt over 44 CDK2 strukturer, og de topp-scoring som ble visuelt undersøkt ved hjelp iView [16] i sammenheng med CDK2 hjelp av røntgenkrystallstrukturen av høy oppløsning, dvs. PDB ID 1GZ8 i dette tilfellet (tabell 1). Deretter kommersielt tilgjengelige forbindelser ble spørres og kjøpes via Chemical Book nettstedet https://www.chemicalbook.com/og senere validert
in vitro Hotell og
in vivo
.
kjemikalier, antistoffer, cellelinjer og cellekultur
de utvalgte kjemikalier og den ledende kreftmedisinen 5-fluorouracil ble kjøpt fra Sigma-Aldrich, USA. Anti-cyclin D, B1, E, CDK2, Rb, pho-CDK2 (Thr160), ble pho-Rb (Ser795) og GAPDH hentet fra Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, Massachusetts, USA.
hepatom cellelinjer HepG2 og Huh7 ble oppnådd fra American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA. Disse cellelinjene ble dyrket i RPMI 1640 medium inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen, Rockville, Maryland, USA) ved 37 ° C i 5% CO
2 og 95% fuktet luft.
Celler ble sådd ut i 96-, 24- eller 6-brønners plater med 0,125% FBS medium i 24 timer og deretter behandlet med 10% FBS medium inneholdende testforbindelser ved forskjellige konsentrasjoner på 1, 3, 10, 30
u
M, og inkubert i 24, 48 eller 72 timer.
MTT-analysen
celler ble sådd ut ved en initial densitet på 9 x 10
3 celler /brønn i 96-brønners plater og inkubert med 0,5 mg /ml 3- (4,5-metyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid i 4 timer. Mediet ble deretter fjernet, og 200
μ
l av formazan i dimetylsulfoksyd (DMSO) ble tilsatt. Absorbansen ble målt ved 570 nm i henhold til standardprotokollen. IC
50 verdier ble beregnet ved GraphPad Prism 5.
Cell syklus analyse
HepG2 eller Huh7 celler (4 × 10
4) ble sådd i 24-brønners plater i RPMI 1640 medium inneholdende 0,125% FBS, og dyrket i 24 timer. Cellene ble inkubert i medium inneholdende 10% FBS og forskjellige doser av fluspirilene (1, 3, 10, 30
μ
M) for 12, 24, 36 timer ved 37 ° C, deretter fiksert i iskald 70% etanol og farget med en Coulter DNA-Prep Reagenser kit (Beckman Coulter, Fullerton, California, USA). Cellulært DNA-innhold av 1 x 10
4 celler fra hver prøve ble bestemt med anvendelse av et EPICS ALTRA strømningscytometer (Coulter Beckman). Cellesyklus fase fordeling ble analysert med ModFit LT 2.0-programvare (Verity Software House, Topsham, Maine, USA). Alle resultater ble oppnådd fra to separate eksperimenter som hver ble utført i tre eksemplarer.
celle apoptose analyse
HepG2 og Huh7-celler ble sådd ut i 24-brønners plater med 0,125% FBS medium for 24 timer og deretter med 10% FBS-medium innehold fluspirilene i konsentrasjoner på 3, 10 og 30
μ
M. Etter produsentens instruksjoner for å kvantifisere de apoptotiske celler, ble forekomsten av apoptose bestemt ved farging celler med både annexin V og propidiumjodid (PI) (Life Technologies). I korthet ble cellene trypsinert med 0,25% trypsin i fravær av etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). Cellene ble vasket to ganger med PBS og resuspendert i 500
μ
l av bindingsbuffer ved en konsentrasjon på 2 x 10
5 – 10
6 celler /ml. To mikroliter av annexin V-EGFP og 5
μ
l PI ble tilsatt til suspensjonen etterfulgt av 5 til 15 minutters inkubering i mørket. Cellene ble så analysert ved hjelp av strømningscytometri (CyFlow Space /Partec, Tyskland).
Western blotting
HepG2 og Huh7-celler ble sådd ut i 6-brønns plater med 0,125% FBS medium i 24 timer og deretter med 10% FBS-medium innehold fluspirilene ved konsentrasjon 3, 10, 30
μ
M. Cellene ble høstet etter 6 timers inkubasjon. Celler ble lysert med RIPA-buffer inneholdende 1 mM PMSF og protease-inhibitor cocktail ved 4 ° C i 30 minutter. Etter sentrifugering ved 13 000 rpm i 15 minutter, ble supernatantene isolert og proteinkonsentrasjonen ble målt ved BCA Protein Assay Kit (Thermo). Like mengder cellelysater ble løst i 10% SDS-PAGE og overført på nitrocellulosemembraner (Sigma). Etter blokkering, ble membranene inkubert sekvensielt med passende fortynnede primære og sekundære antistoffer. Proteiner ble påvist ved den forbedrede kjemiluminescens påvisningssystem (Amersham, Piscataway, New Jersey, USA). For å sikre lik lasting av prøvene, membraner ble re-analysert med en anti-GAPDH antistoff (Cell signale Technologies).
Fluspirilene behandling
in vivo
Kvinne BALB /C nakne mus, 4 til 5 uker gamle fra Vital River Laboratory Co Ltd, Peking, Kina, ble holdt under patogenfrie forhold. For xenopodet tumorvekstanalyse, ble 1 x 10
6 /0,2 ml PBS Huh7-celler injisert subkutant i høyre flanke av musene. Tumorstørrelse ble målt hver dag. Tre uker etter inokulering når tumorene vokste til et volum på 80 til 100 m
3, ble musene tilfeldig delt i grupper på 5 mus pr gruppe, og mates ved oral gavage med 0,5% CMC-NaCl inneholdende fluspirilene (15 mg /kg) og ved intraperitoneal injeksjon av 5-fluoruracil (10 mg /kg) daglig i 21 dager. Karsinom volum ble målt hver 3 til 4 dager etter tumor utseende. Tumor volum ble beregnet ved formelen
V
=
ab
2/2, der
en
er den lengste aksen og
b
er korteste akse. Musene ble deretter avlivet ved cervikal dislokasjon.
Statistisk analyse
Resultatene ble oppnådd fra minst tre forskjellige eksperimenter og uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Statistisk analyse ble utført av Student t test og forskjeller ble ansett for å være statistisk signifikant hvis p 0,05. Statistisk signifikante resultater er merket med symbolet * i tallene.
Resultater
Re-dokking resultater
For de 44 CDK2 komplekser, co-krystallisert ligander var forankret mot sin tilsvar CDK2 struktur for å se om iDock kunne forutsi bindende positurer som konformasjonelt nær co-krystallisert posere som mulig. Slike re-dokking nøyaktighet ble kvantifisert ved kvadratisk middelavvik (RMSD) av de anslåtte positurer fra co-krystallisert positur. For hver av de 44 kompleksene, spådde iDock ni positurer, derav ni RMSD verdier. De RMSD verdier av de ni positurer i den 44 Re-dokking forsøkene er gitt i Tabell S2.
Fig 1 plott fordelingen av RMSD verdier av den første pose (betegnet som pose 1), som ble forutsagt å ha lavest fri energi blant de ni utgjør, så vel som fordelingen av RMSD verdier av positur som har den minste RMSD blant de ni positurer (betegnet som positur m). Detaljert forklaring og begrunnelsen for valget av disse to typer utgjør kan bli funnet i [6]. Semantisk, den RMSD verdi utgjøre en (betegnet som RMSD1) og RMSD verdien av positur m (betegnet som RMSDm) reflektere re-dokking nøyaktighet hvis bare den øverste og topp ni spådd positurer er vurdert, henholdsvis. Per definisjon er RMSDm ≤ RMSD1 alltid garantert. Ut av de 44 Re-dokking prøvelser, 10 forsøk produsert RMSD1 2A og 28 forsøk produsert RMSDm 2A. Disse re-dokking resultatene gjenspeiler til en viss grad hensiktsmessigheten av å bruke iDock å forankre forbindelser mot CDK2 strukturer.
RMSD distribusjoner av pose 1 og posere m er vist i svart og rødt, henholdsvis. 10 og 28 poeng er under grunnlinjen av RMSD = 2A for positur en og posere m hhv.
Ensemble tilkoblings resultater og valg av kandidat hemmere
Totalt 4914 FDA-godkjente legemidler var forankret og rangeres i henhold til deres gjennomsnittlige spådd bindende affinitet over 44 røntgenkrystallstrukturer av CDK2. Deres spådd gratis energiverdier er gitt i S3 tabell. De docking prediksjon resultater med iView visualisering [16] er fritt tilgjengelig på https://istar.cse.cuhk.edu.hk/idock/iview/?1GZ8-dbap og https://istar.cse.cuhk.edu.hk /iDock /iView /? 1GZ8-FDA.
fig 2 plotter fordelingen av gjennomsnittlig iDock poengsum av de 4,914 forbindelser. 15 forbindelser hadde spådd fri energi på -10 kcal /mol eller lavere, med den beste å ha -10,46 kcal /mol. Basert på kommersiell tilgjengelighet, 9 topp-scoring forbindelser (Tabell 2, fig 3, S4 Table) ble kjøpt for videre undersøkelser
842 og 783 forbindelser var i utvalgene av [-7,5, -8,0) og [. ,,,0],-7,0, -7,5), henholdsvis, som utgjør de to største binger. 15 og 63 forbindelser var i utvalgene av [-10,0, -10,5) og [-9,5, -10,0), henholdsvis, som utgjør de to binger passende for valg av kandidat narkotika.
Dette tallet ble opprettet av RDKit (https://rdkit.org/).
Fluspirilene redusert celleviabilitet av leverkreft
Vi har evaluert første anti-kreft effekt av de ni forbindelsene av MTT-analysen (fig 4). Alle ni forbindelser redusert cellelevedyktighet i HepG2 og Huh7-celler, men hadde avvik cytotoksisitet ved forskjellige konsentrasjoner. Blant dem, fluspirilene hadde lavest IC
50, dvs. 4,017
μ
M for HepG2 og 3,468
μ
M for Huh7. Fluspirilene oppviste den høyeste cytotoksisitet i forhold til kontroll med statistisk signifikans (p 0,05). En slik inhibisjon effekt var dose- og tidsavhengig. Markert hemming ble observert ved 10
μ
M og 30
μ
M, men ingen signifikant effekt ble observert ved konsentrasjoner under 3
μ
M.
(A) de ni forbindelsene måtte avvik cytotoksisitet til HepG2 og Huh7 cellelinjer ved forskjellige concentrationas, med fluspirilene som oppviser den høyeste cytotoksisitet sammenlignet med kontrollgruppen (p 0,05). (B) Fluspirilene oppviste dose- og tidsavhengig inhibering av cellelevedyktighet i HepG2 og Huh7 cellelinjer sammenlignet med kontrollgruppen (p 0,05).
Fluspirilene behandling arrestert cellesyklus i G1 fase
for å forstå hvis fluspirilene hemmet CDK2 aktiviteter i leverkreft celler, analyserte vi effekten av fluspirilene behandling med konsentrasjoner av tre, 10, 30
μ
M for 6, 12, 24 timer på cellesyklus profil i HepG2 og Huh7 celler ved flowcytometri (fig 5). Fluspirilene behandling økte signifikant prosentandelen av celler i G1 fase sammenlignet med kontrollen (p 0,05) i en dose- og tidsavhengig måte. Ved 30
μ
M eller 10
μ
M konsentrasjon, fluspirilene behandlingen økte kontinuerlig prosentandelen av G1 fase i 24 timer. Etter 24 timers fluspirilene behandling, ble økningen av G1 fase ledsaget av samtidig reduksjon av S-fasen. De sub-G1 prosenter er gitt i S5 tabell. De representative histogrammer av DNA-innhold er gitt i S5 Fig.
(A) Fluspirilene behandling dose- og tidsavhengig økning i prosentandelen av celler i G1 fase. Ved 30
μ
M eller 10
μ
M konsentrasjon, fluspirilene behandlingen økte kontinuerlig prosentandelen av G1 fase i 24 timer. (B) Celle syklus fordeling på 24 timer etter fluspirilene behandling. Økningen av G1 fasen ble ledsaget av samtidig nedgang på S-fasen.
Fluspirilene behandling indusert celle apoptose
Et stoff som bare kan indusere cellesyklus arrest er ikke god nok grunn svulstene vil lett re-vokse etter uttak av stoffet. Derfor har vi også undersøkt om fluspirilene kan indusere celle apoptose (figur 6). Fluspirilene behandling ved 30
μ
M eller 10
μ
M konsentrasjon betydelig økt prosentdelen av apoptose i Huh7 og HepG2-cellelinjer sammenlignet med kontrollen i en dose-og tidsavhengig måte (p 0,05). Scatter plott av PI mot annexin V er gitt i S6 Fig.
Fluspirilene behandling ved 30
μ
M eller 10
μ
M konsentrasjonen økt betydelig prosentandel av apoptose i Huh7 og HepG2-cellelinjer sammenlignet med kontrollen i en dose-og tidsavhengig måte (p 0,05).
Fluspirilene behandling reduserte uttrykk for CDK2, Rb, cyklin E, pho-CDK2 og pho-Rb, men ikke cyklin D1 og cyklin B1
Vi undersøkte virkningen av fluspirilene på uttrykkene for kritiske proteiner involvert i G1-til-S-overgang i HepG2 og Huh7-celler ved western blotting (fig 7) . Fluspirilene behandling reduserte uttrykk for CDK2, Rb, pho-CDK2, pho-Rb og cyclin E. I motsetning til dette uttrykket nivåer av cyklin D1 og cyklin B1 forble uendret. Disse resultatene er i samsvar med det som er forventet fra en CDK2 hemmer.
Fluspirilene behandling redusert uttrykk for CDK2, Rb, cyclin E, pho-CDK2 og pho-Rb, men ikke cyclin D1 og cyclin B1.
det er også observert at fluspirilene behandling majorly redusert ekspresjon i stedet for fosforylering av CDK2. Vi foreslår at slike forskjeller er rimelige i den forstand at etter binding, kan CDK2-fluspirilene komplekser direkte gjennomgå nedbrytning, derfor resulterer i høyere reduksjon av CDK2 uttrykk enn fosforylering. I tillegg kan fluspirilene binde til CDK2 med en høy affinitet, men etter CDK2 fosforyleres, kan bindingen av fluspirilene være svekket og bindingsaffiniteten kunne således bli svekket.
Daglig oral fluspirilene behandling reduserte tumorvekst
in vivo
Vi har evaluert effekten av fluspirilene på veksten av leverkreft
in vivo
i BALB /C naken mus subkutant injisert med Huh7 celler (figur 8). På dag 21 etter behandling, fluspirilene (15 mg /kg) resulterte i signifikant reduksjon av tumor vekt og volum sammenlignet med kontrollen (p 0,05), samtidig som ingen signifikant endring i kroppsvekt. Antitumoraktiviteten av oral fluspirilene (15 mg /kg) var sammenlignbar med den for 5-fluoruracil (10 mg /kg). Viktigere, deres kombinasjonsbehandling viste den høyeste terapeutiske effekten. Disse resultatene antydet for den første gang at fluspirilene er en potensiell CDK2-inhibitor og en kandidat anti-kreft legemiddel for behandling av human leverkreft.
Antitumoraktiviteten av oral fluspirilene (15 mg /kg) var sammenlignes med 5-fluoruracil (10 mg /kg). Videre deres cocktail terapi utstilt synergistisk terapeutisk effekt
Strukturell analyse av den anslåtte binding konformasjon av fluspirilene
Fig 9 plotter spådd konformasjon av fluspirilene i kompleks med CDK2 (PDB ID.: 1GZ8) bruker iView [16]. Fluspirilene ble spådd å binde inne i ATP-bindende lomme av CDK2 og samhandle med CDK2 hovedsakelig gjennom hydrogenbindinger, hydrofobe kontakter og kationer
π
interaksjoner. Putatively danner H8 atom en hydrogenbinding med ryggrad oksygen Ile10, og H32 atom danner ytterligere to hydrogenbindinger med ryggrad oksygen Leu83 og His84. De sidekjeder av Ile10, Ala31 og Leu134 etablere en hydrofob tunnel for den hydrofobe halen av fluspirilene å begrave inne. En av de to aromatiske ringer er plassert på halen av fluspirilene danner en kationer
π
samvirke med positivt ladede sidekjeden til Lys33. Alle disse antatte hydrogenbindinger, hydrofobe kontakter og kationer
π
interaksjoner er spredt over hodet, middels og hale fragmenter av fluspirilene, og dermed holder fast fluspirilene på sitt spådd posisjon og orientering. Til sammenligning er det kjent CDK2-inhibitor 2-amino-6- (3′-metyl-2′-okso) butoxypurine (kodenavn MBP for kort), som er en O (6) -substituert guanin-derivat, som er kjent for å etablere fire hydrogen obligasjoner med Lys33, Glu81 og Leu83 (S2 figur).
CDK2 rester gjengis som linjer farget av atom type. Fluspirilene gjengis som pinner farget av atom type. Samspill atomer og rester er merket. Cyan, grønn og rosa stiplede linjene representerer hydrogenbindinger, hydrofobe kontakter og
rc
interaksjoner, henholdsvis. Dette tallet ble opprettet av iView [16].
Vi inspisert videre spådd konformasjon av fluspirilene i nærvær av CDK2 molekylær overflate (S3 fig). Sammenlignet med guanin derivatet MBP (S4 figur), opptar fluspirilene en mye større andel av det bindende lomme, og dens form ordentlig likt det i det bindende hulrom. Basert på denne strukturell analyse sammen med vår
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimenter, antyde vi at fluspirilene kan fysisk binde seg til CDK2.
Diskusjoner
cellesyklus fremgang sekvensielt og strengt behandlet gjennom samspillet av CDK og cykliner [17]. Forskjellige cyklin-CDK-komplekser er aktivert i forskjellige faser av cellesyklusen. Når cellesyklusen går gjennom G1 til S-fasen, den cyclin D1-CDK4 /6 og cyclin E-CDK2 komplekser ordinally aktivert og retinoblastom protein (pRB) er hyper-fosforylert på serin og treonin rester [18]. Den hyper-fosforylerte pRB fremmer frigjøring av E2F transkripsjonsfaktorer, som i sin tur letter transkripsjon av en rekke gener som er nødvendige for å G1 S overgang og S-fasen progresjon [19]. Fra medisinsk perspektiv, har CDK2 lenge vært en klassisk og viktig mål for kreftbehandling.
Selv om en rekke CDK2 hemmere har angitt kliniske studier faser, ingen har blitt offisielt godkjent for klinisk bruk, sannsynligvis på grunn av deres toksisitet og multi-target-spesifisitet. Gitt hindringen at å utvikle et nytt legemiddel
de novo
er en arbeidskrevende og kostbar forsøke, gjenbruk toksisitetsfritt gamle medikamenter for nye bruksområder er en gunstig strategi.
Den kraftige synergi av
i silikoaluminofosfater
metoder i stoffet gjenbruk av struktur-baserte virtuelle screening (SBVS) ble markert i flere nyere publikasjoner [20]. For å nevne noen vellykkede Reorganisering tilfeller av SBVS, [21] gjenoppdaget 2,4-Dichlorophenoxy eddiksyre, en velkjent plante auxin, som en ny anti-inflammatorisk agent gjennom
i silico
molekylær modellering og docking studier sammen med legemiddelformulering og
in vivo
anti-inflammatorisk ettersyn; [22] forsøkt å gjenbruke FDA-godkjente medikamenter av en integrert SBVS tilnærming og rapporterte oppdagelse av piperacillin en som en inhibitor av NEDD8-aktiverende enzym (NAE) i celle-frie og cellebaserte systemer med høy selektivitet.
i tillegg til SBVS, ligand-baserte virtuelle screening (LBVS) finner også sine vellykkede søknader i gjenbruk. [23] anvendes Ultraform gjenkjenning (USR) [24] for å søke etter forbindelser med tilsvarende form til en tidligere rapportert inhibitor for protein arginin-deiminase type 4 (PAD4), en ny terapeutisk mål for behandlingen av revmatoid artritt, og identifisert en roman forbindelse som har en påfallende forskjellig struktur fra malen hemmer ennå viste signifikant hemming på den enzymatiske aktiviteten til PAD4.
Oppmuntret av disse vellykkede historier, i denne studien vi vedtatt gjenbruk strategi, og benyttet beregningsmetodikk for SBVS av protein-ligand docking til shortlist kandidater fra FDA-godkjente bioteknologiske legemidler. Spesielt har vi brukt vår raske docking program iDock [5, 6] i kombinasjon med vår praktiske visualiserer iView [16] for oppgaven med å gjenoppdage eksisterende legemidler som CDK2 hemmere. iDock er en spennende utvikling, ikke bare fordi det har blitt kraftig vist [6] til å utkonkurrere state-of-the-art docking programvare Autodock Vina [25] i form av docking fart med minst 8,69 ganger og på de fleste 37.51 tider og samtidig opprettholde sammenlign re-dokking suksess priser, men også fordi det er gratis og åpen kildekode under en ettergivende lisens. Sistnevnte garanterer at brukere fra både industri og akademia kan fritt benytte iDock i sine egne prosjekter som krever protein-ligand docking.
For å forenkle bruken av iDock, sine argumenter og utgang resultater ble designet med den hensikt å være lik til de av Autodock Vina, derfor eksisterende brukere kan enkelt transitt til iDock og dra nytte av betydelig hastighetsøkning i SBVS ytelse. Videre, for å fremme potensielle SBVS av iDock, en webserver som heter ISTAR [6] ble utviklet og gjort fritt tilgjengelig på https://istar.cse.cuhk.edu.hk/idock, hvor det er så mange som over 23 millioner kjøpes lite molekyl forbindelser klar for docking mot eventuelle protein levert av brukeren. 1. mai 2015 har det vært mer enn 1000 docking jobb innleveringer av brukere fra 98 land. Både iDock [5] og ISTAR [6] vil forhåpentligvis supplere innsatsen til medisinske kjemikere i legemiddelforskning forskning. I tillegg til forskningsformål, noen universiteter også bruke vår iDock for undervisning formål i sine bioinformatikk kurs.
Når det gjelder de strukturelle data i bruk, så langt det er så mange som 346 løst X-ray krystallstrukturer av CDK2 med en Uniprot ID P24941 (S1 tabell). Å redegjøre for deres strukturelle variabilitet og min kunnskap fra flere strukturer av CDK2, valgte vi 44 Holo strukturer av CDK2 i en bundet tilstand med en ligand i kompleks å gjennomføre ensemble docking. Sluttresultatet brukes til å prioritere forbindelsene ble designet med den hensikt å være den gjennomsnittlige poengsum av denne forbindelsen når dokket til de 44 utvalgte strukturer av CDK2 med sine co-krystallisert ligand fjernes manuelt før dokking.
