Abstract
ekstracellulære matriks metalloproteinase induser (EMMPRIN), har en plasma membran protein av immunoglobulin (Ig) super, blitt rapportert å fremme kreft celle invasjon og metastasering i flere menneskelige kreftformer. Men rollene til de ulike EMMPRIN isoformer og tilhørende mekanismer i hode og nakke kreft progresjon er fortsatt ukjent. Ved hjelp av kvantitativ real-time PCR, fant vi at EMMPRIN isoform 2 (EMMPRIN-2) var den eneste isoform som ble overuttrykt i både hode og nakke kreft vev og cellelinjer, og at det var forbundet med hode og nakke kreft metastasering. For å fastslå effekten av EMMPRIN-2 på hode og nakke kreft progresjon, transfektert vi hode- og nakkekreftceller med en EMMPRIN-2 uttrykk vektor og EMMPRIN-2 siRNA til eksogent modulere EMMPRIN-2 uttrykk og undersøkt den funksjonelle betydningen av EMMPRIN-2 i hode- og halskreft invasjon og metastasering. Vi fant ut at EMMPRIN-2 forfremmet hode og nakke kreft celle invasjon, migrasjon, og heft in vitro og økt lungemetastaser in vivo. Mekanistiske undersøkelser viste at EMMPRIN-2 overekspresjon fremmet utskillelsen av ekstracellulære signalmolekyler, inkludert matriks-metalloproteinaser-2 (MMP-2), urokinase-type plasminogen aktivator (uPA) og Cathepsin B, i hode- og halskreft celler. Mens MMP-2 og uPA har vist seg å være viktige formidlere av EMMPRIN signalering, ikke er etablert rolle Cathepsin B i EMMPRIN-medierte molekylære kaskader og tumorigenesis. Vi fant at EMMPRIN-2 overekspresjon og Cathepsin B nedregule vesentlig hemmet invasjon, migrering og adhesjon av Tca8133 celler, noe som antyder at Cathepsin B er nødvendig for EMMPRIN-2 forbedret celle migrering og invasjon i hode- og halskreft. Resultatene fra vår studie viser den viktige rollen EMMPRIN-2 i hode og nakke kreft progresjon for første gang, og avslører at økt ekstracellulært sekresjon av Cathepsin B kan være en ny mekanisme underliggende EMMPRIN-2 forbedret tumorprogresjon i hode- og halskreft.
Citation: Huang Z, Tan N, Guo W, Wang L, Li H, Zhang T, et al. (2014) Overuttrykte EMMPRIN isoform 2 er assosiert med hode og nakke kreft metastasering. PLoS ONE 9 (4): e91596. doi: 10,1371 /journal.pone.0091596
Redaktør: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, USA
mottatt: 04.11.2013; Godkjent: 12 februar 2014; Publisert: 04.04.2014
Copyright: © 2014 Huang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (# 81101592, til Z. Huang) og Guangdong-provinsen Natural Science Foundation (# S2013010014794, til Z. Huang), og etter tildelingene fra Flight Attendant Medical Research Institute (# 062 545, til Z. Guo) og med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (# 81272951, til J.Li). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
hode- og halskreft (HNC) er den sjette vanligste kreftformen i verden [1], og har blitt mer utbredt i utviklingsland i løpet av det siste tiåret [2]. Mer enn 650.000 nye tilfeller av HNC er diagnostisert hvert år over hele verden [3], [4]. I Europa alene, ca 143 000 nye tilfeller og større enn 68.000 dødsfall oppstå på grunn av sykdommen hvert år [4]. Kirurgi kombinert med kjemoterapi og strålebehandling er nå akseptert som den mest effektive behandlingen for pasienter med hode og hals plateepitelkarsinom. Imidlertid har dødeligheten på grunn av hode og nakke kreft ikke endret seg vesentlig de siste 30 årene, og den 5-års overlevelse fortsetter å være mindre enn 50% [2]. Behandlingssvikt har i hovedsak vært knyttet til lokalt tilbakefall og fjernmetastaser [5]. I dag er terapeutiske avgjørelser basert på clinicopathologic parametere, inkludert alder, tumormetastaser scenen, og histologisk grad. Selv nyttig, disse faktorene ofte ikke klarer å gi nøyaktig informasjon om de biologiske funksjonene i svulster [3]. Derfor vil innsikt i de molekylære endringer i forbindelse med hode og nakke kreft metastase gi kritiske innsikt i de grunnleggende mekanismene bak hode og nakke kreft progresjon og videre bidra til forbedringer i den kliniske behandlingen av hode og hals kreftpasienter.
ekstracellulære matriks metalloproteinase induser (EMMPRIN), også kjent som CD147 eller basigin, er et plasmamembranprotein av immunoglobulin (lg) superfamilien, og ble navngitt på grunnlag av sin funksjon å fremkalle produksjon av ekstracellulære matriks-metalloproteinaser (MMP), de viktigste enzymer som er involvert i å opprettholde integriteten og omsetning av den ekstracellulære matriks (ECM) [6]. EMMPRIN deltar i en rekke av normale celle physiologies, inkludert lymfocytter reaksjonsevne, kvinnelige reproduktive prosesser, og intracellulær transport [7] – [9]. Forhøyet EMMPRIN uttrykk har blitt korrelert med tumorprogresjon hos hjernesvulst, gigantiske celle svulster i ben, laryngeal plateepitelkarsinom, serøs ovarialcancer og melanomer [10]. EMMPRIN fremmer kreft progresjon ved å styrke kreftcelle invasjon og metastasering. Den funksjonelle betydningen av EMMPRIN i løpet av tumorprogresjon har i hovedsak blitt tilskrevet dets evne til å stimulere produksjon av MMP [8] – [10]. I tumorceller, fremmer EMMPRIN produksjon av MMP-1, MMP-2 og MMP-9 og muliggjør syntesen av MT1-MMP og MT2-MMP [11] – [13]. I tillegg til å mediere nedbrytning av ECM, spiller EMMPRIN multifunksjonelle rolle i progresjon av kreft. Ved opp-regulerer ekspresjonen av VEGF og dens viktigste reseptor, VEGFR-2, både tumorceller og endotelceller, kan EMMPRIN fremme angiogenese, noe som er en kritisk hendelse, ikke bare i løpet av tumorvekst, men også i løpet av cancercellemetastase [14], [15]. EMMPRIN kan også fungere som et adhesjonsmolekyl og samhandle med β1-integrin [16], [17]. Mange andre molekyler som har blitt rapportert å samhandle med EMMPRIN, inkludert caveolin-1, uPA, monokarboksylat transportører (MCT), og CYP450s [18].
På grunn av alternativ spleising, minst 4 forskjellige varianter av EMMPRIN mRNA som koder forskjellige EMMPRIN protein isoformer (EMMPRIN-1 til -4) har blitt identifisert. Blant disse fire varianter, er EMMPRIN-2 den mest tallrike isoform uttrykt i tumorceller [19]. EMMPRIN-en koder for det lengste, retina-spesifikk isoform, som utmerker seg ved en ytterligere Ig-lignende domene (tre Ig-lignende domener i totalt) i den ekstracellulære delen [20]. De to andre varianter, EMMPRIN-3 og EMMPRIN-4, ble først identifisert i humane endometriale stromale celler og cervikale karsinom-cellelinjer [19]. EMMPRIN-3 er den korteste isoform, som består av bare en Ig-lignende domene i sin ekstracellulære delen [21], og den kommuniserer med internalisert EMMPRIN reseptor-ligand-komplekset [19].
Vår tidligere studie identifisert EMMPRIN som en effektiv mål for immunterapi for tunge plateepitelkarsinom [22]. Men presise karakteristikker av EMMPRIN isoformer og deres roller i initiering og progresjon av hode og nakke kreft er fortsatt ukjent. Mens EMMPRIN isoform 3 er en påvist negativ regulator i spredning og invasjonen av kreftceller [23], isoformene EMMPRIN 1, 2 og 4 har blitt foreslått å spille en onkogen rolle i menneskelige maligniteter inkludert kreft i munnhulen. I denne studien undersøkte vi de grunnleggende roller EMMPRIN isoformer i hode og nakke kreft progresjon. Våre funn viser den viktige rollen EMMPRIN-2 og tilhørende mekanismer i hode- og halskreft invasjon og metastasering for første gang.
Materialer og metoder
1. Menneskelig vev og cellelinjer
Totalt 51 par av hode og nakke kreft vev og tilsvarende tilstøtende nontumorous vev ble samlet 2009-2011 ved Institutt for oral og maxillofacial kirurgi, Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Yat-Sen University, Guangzhou, Kina. Vevsprøvene ble umiddelbart hurtigfrosset i flytende nitrogen etter reseksjon og lagret ved -80 ° C. Både tumorous og tilstøtende nontumorous vev ble histologisk undersøkt. Skriftlig informert samtykke ble innhentet for innsamling av alle menneskelige materialer, og studien ble godkjent av Medical Ethics Committee of Sun Yat-sen Memorial Hospital ved Chinese University. Alle prøvene ble samlet fra pasienter før klinisk behandling. Kliniske trekk ved pasientene ble oppsummert i tabell 1.
Tca8113 og ACCM hode- og nakkekreftcellelinjer ble vennlig levert av College of Tannbehandling, Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, Kina) [24 ], [25]. TSCCA celler ble vennlig levert av Sun Yat-Sen universitetet Cancer Center [26] og kilden til SCC25 celler ble beskrevet i forrige publisering [27]. De Tca8113 og ACCM cellelinjer ble dyrket i RMPI-1640 medium (Invitrogen, Carlsbad, CA), mens TSCCA3 og SCC25 cellelinjer ble dyrket i DMEM (Invitrogen Carlsbad, CA). Alle media ble supplert med 10% føtalt bovint serum (Gibco), ble 100 IU /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin-sulfat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), og cellene ble dyrket i 37 ° C inkubatorer som inneholder 5% CO
2 og en fuktig atmosfære.
2. Revers transkripsjon og kvantitativ real-time PCR
Totalt RNA ble ekstrahert fra vev eller celler ved anvendelse av TRIzol reagens (Invitrogen) i følge produsentens anbefalte protokoll. Komplementær DNA ble syntetisert med stats-Script RT Reagent Kit (Takara, Dalian, Kina). Kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) analyser ble utført med SYBR Premiks Ex-Taq (Takara). Primerne anvendt er vist i tabell S1.
3. Western blotting
Cellene ble lysert i NP-40 lysis buffer som inneholder en proteasehemmer cocktail og en fosfatase inhibitor cocktail (Roche, Rotkreuz, Sveits). Etter separasjon ved hjelp av SDS-PAGE ble proteinene overført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad, Hercules, USA). Deretter ble membranene blokkert med 5% ikke-fettholdig melk i Tris-bufret saltvann (TBS) inneholdende 0,1% Tween-20 i 1 time ved romtemperatur. Blottene ble probet med de aktuelle primære antistoffer over natten ved 4 ° C, vasket og probet med et artsspesifikt pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Cell Signaling, Beverly, USA). En forbedret kjemiluminescens påvisningsmetoden (Pierce ECL Western Blotting Substrate, Thermol, Beverly, MA, USA) ble anvendt for å visualisere blot. De primære antistoffene som ble anvendt anti-EMMPRIN, anti-MMP-2, anti-uPA, anti-Cathepsin B (Santa Cruz Biotechnology, USA), og anti-β-aktin (Sigma-Aldrich, MO, USA).
4. EMMPRIN-2 Plasmid konstruerer, transfeksjon, lentivirus produksjon og etablering av stabilt uttrykker cellelinjer
EMMPRIN-to lentiviral uttrykk vektor pWPXL-EMMPRIN-2 ble konstruert ved å erstatte GFP fragment av pWPXL vektor (Addgene plasmid 12257 : Didier Trono) med den kodende sekvens av EMMPRIN-2 (deponeringsnummer NM_198589), som ble amplifisert fra human lever-cDNA-bibliotek ved å bruke EcoRI og BamHI som kloning enzymer. Oligonukleotider ble syntetisert for å generere varmebehandlings shRNAs at målrettet sekvensen av EMMPRIN-2 fra posisjon 430-449 (5′-GTCGTCAGAACACATCAAC-3 «), og sekvensen av Cathepsin B fra posisjon 670-689 (5»-GTGGCCTCTATGAATCCCA- 3 «). Sekvensene til oligonukleotidene for plasmidkonstruksjoner er oppført i Tabell S2. Fragmentene ble klonet seg inn i pLVTHM vektor (Addgene plasmid 12247, Didier Trono) ved hjelp av Mlul og Clal restriksjonsseter. Lentiviral partikler ble høstet 48 timer etter ko-transfeksjon av pWPXL-EMMPRIN-2 eller pLVTH-shRNA med psPAX2 og pMD2.G i HEK-293T celler ved hjelp Lipofectamine 2000 Transfeksjon Reagens (Invitrogen). Målceller (Tca8113 og ACCM) ble transdusert med rekombinant lentivirus pluss 6 ug /ml polybrene (Sigma-Aldrich). Etter 2 uker med kultur i en 37 ° C inkubator med 5% CO
2 og en fuktig atmosfære, total RNA og proteiner ble hentet og uttrykk for EMMPRIN-2 eller Cathepsin B ble ytterligere bekreftet ved hjelp av western blot og kvantitativ RT PCR [28].
5. In vitro migrasjon og invasjon analyser
For Transwell migrasjon analyser, 2 × 10
4-celler ble sådd ut på toppen kammeret til hver innsats (BD Biosciences, NJ). For invasjonen assays, 1 x 10
5-celler ble sådd ut på det øvre kammer av hvert innlegg, som var blitt belagt med 150 ug av Matrigel (BD Biosciences, MA). Cellene i begge analysene ble trypsinisert og resuspendert i DMEM, og 700-900 ul medium som var blitt supplert med 10% føtalt bovint serum ble tilsatt til de nederste kamre i hver brønn. Etter 12 timers inkubering ved 37 ° C ble cellene gjenværende i de øverste kammere eller på de øvre membraner av innsatsene forsiktig fjernet, og cellene som hadde migrert eller invadert inn i de nedre kamre ble fiksert og farget med et fargestoff oppløsning innehold 0,1% krystallfiolett og 20% metanol. De trekkende og invaderende celler ble fotografert og telles ved hjelp av en IX71 invertert mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan). De samme forsøk ble utført minst tre ganger.
6. Celleadhesjonsanalyse
A celleadhesjon Analysen ble utført i henhold til protokollen som ble beskrevet i en tidligere publikasjon [29]. For denne analysen, ble 96-brønns flatbunnede dyrkningsplater belagt med 30 ug av Matrigel (BD Biosciences, MA) i DMEM i 3 timer ved 37 ° C. Plater som var blitt belagt med 0,2% bovint serumalbumin (BSA) i 2 timer ved romtemperatur tjente som negative kontroller. Cellene ble høstet ved bruk av trypsin /EDTA, vasket to ganger med PBS og resuspendert i DMEM. Celler (2,5 x 10
4) ble tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37 ° C i 30 minutter. Platene ble ristet ved 1000 rpm i 30 sekunder og vasket tre ganger med DMEM for å fjerne ubundne celler. Cellene som forble festet til platene ble kvantifisert ved hjelp av celletellingsleder-8 (CCK-8) analyse (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) i henhold til produsentens anbefalte instruksjoner. Etter subtraksjon av bakgrunnscellebinding fra BSA-belagte brønner, ble prosentandelen av adherente celler beregnes ved å dividere den optiske tetthet av de adherente celler ved at av den opprinnelige cellen inngang. Endelig ble celler som hadde blitt fiksert og farget i et fargebad oppløsning inneholdende 0,1% krystallfiolett og 20% metanol avbildes ved hjelp av en IX71 invertert mikroskop (Olympus). Alle de adhesjons-eksperimenter ble utført på triplikate brønner og gjentatt minst tre ganger.
7. Musemodeller for in vivo analyser av metastaser
For
in vivo
analyser av metastatiske kapasitet cellelinjer, hver naken mus (ti per gruppe, BALB /c-nu /nu ) ble hale-intravenøst injisert med 1 x 10
6 Tca8113 celler som stabilt uttrykker EMMPRIN-2 eller Tca8113 celler som uttrykker den tomme vektoren. Musene ble avlivet etter 6 uker, og lungene ble dissekert, fiksert med fosfatbufret nøytral formalin og innleiret parafin. Metastaser i lungene ble talt mikroskopisk på H E-fargede vevssnitt. Musene ble manipulert og plassert i samsvar med protokoller som hadde blitt godkjent av Shanghai Medical Experimental Animal Care komité og studien ble godkjent av forskningsetiske komité for Shanghai Medical College, Fudan University.
8. Gelatin zymografi assay
gelatin zymografi Analysen ble utført for å bestemme aktiviteten til MMP-2 [30]. Kort fortalt ble cellene inkubert i serumfritt medium, og mediet ble samlet opp etter 24 timer. Medium fra et likt antall celler ble separert ved anvendelse av 10% akrylamidgeler som inneholdt 1 mg /ml gelatin type A (Sigma-Aldrich). Gelene ble inkubert i en 2,5% Triton-X-100 oppløsning ved romtemperatur med forsiktig omrøring for å fjerne SDS og re-natur MMP-2. Gelene ble deretter inkubert i utvikling av buffer (50 mM Tris-HCl, 0,2 M NaCl, 5 mM CaCl
2, og 0,02% Brij35) i 24 timer ved 37 ° C for å indusere gelatin lysering av renaturert MMP-2. Etter reaksjon, ble gelene farget med fargeløsning (0,1% Coomassie Brilliant Blue R 250, 30% metanol og 10% eddiksyre) i 1 time og avfarget i en oppløsning inneholdende 30% metanol og 10% eddiksyre. Bilder av geler ble anskaffet ved hjelp av ChemiDoc XRS + System (Bio-Rad). De samme forsøk ble utført minst tre ganger.
9. ELISA-analyser
Prøvepreparering: Celler (2 × 10
6) ble satt til hver 10 cm tallerken og dyrket i 24 timer. For å fjerne de ikke-bundne cellene, ble de retter vasket tre ganger med serumfritt medium. Deretter ble cellene inkubert med 15 ml serumfritt medium, og mediet ble oppsamlet ved anvendelse av en Amicon ultra 15 ml 10K-kolonne (Millipore) etter 24 timer. uPA aktivitet, MMP-2 og Cathepsin B konsentrasjoner ble kvantifisert ved hjelp av en uPA Activity Assay Kit (Millipore), Human MMP-2 Quantikine ELISA Kit (R 0,05 ble satt som nivået på statistisk signifikans. Alle de statistiske analysene ble utført ved hjelp av SPSS 17.0.
Resultater
1. EMMPRIN-2 er overuttrykt i hode og nakke kreft og er assosiert med hode og nakke kreft metastase
Selv om endret uttrykk for ulike EMMPRIN isoformer har vært innblandet å spille en rolle i HNC tumorigenesis, de individuelle bidragene fra de ulike EMMPRIN isoformene til initiering og progresjon av HNC fortsatt uklare. For ytterligere å belyse rollene til EMMPRIN isoformer i HNC, undersøkte vi uttrykket av ulike EMMPRIN isoformer i HNC vev og cellelinjer. Uttrykket av alle 4 EMMPRIN isoformer ble først undersøkt i 12 tilfeller av oral cancer vev ved hjelp av kvantitativ real-time PCR. Mens EMMPRIN isoformer 1, 2 og 4 viste relativt rikelig ekspresjon, EMMPRIN isoformen 3 var nesten ikke påvisbar i de testede oral cancer vev (Figur S1). Derfor vår kontinuerlige Studien fokuserte på rollene til EMMPRIN isoformer 1, 2 og 4 i hode og nakke kreft progresjon. Ekspresjonen av EMMPRIN isoformer 1, 2 og 4 ble ytterligere analysert i 51 HNC tumorer og deres matchede normale orale vev ved hjelp av kvantitativ RT-PCR. Som vist i figur 1A, EMMPRIN-2 og EMMPRIN-4 syntes å være de viktigste isoformene som ble uttrykt i hode og nakke vev, mens EMMPRIN-1 vises bare meget lave nivåer av ekspresjon. Vi observerte at EMMPRIN-2 var den eneste EMMPRIN isoform hvor mRNA-ekspresjonsnivåene var signifikant økt i tumorene sammenlignet med de tilpassede tilstøtende ikke-cancerøse vev (Fig. 1A). Omtrentlige 2-gangers økninger (C /A, 1,90) i gjennomsnittlig EMMPRIN-2-ekspresjonsnivåer ble detektert i tumorvev, i løpet av de tilstøtende normale kontroller. ble påvist noen signifikante forskjeller i EMMPRIN-en og EMMPRIN-4 mRNA uttrykk mellom svulster og de tilstøtende ikke-kreft vev (Fig. 1a).
(A) EMMPRIN mRNA uttrykk i 51 hode og nakke kreft vev og de tilstøtende ikke-cancerøse vev ble analysert ved hjelp av qPCR. EMMPRIN-2-mRNA-ekspresjon i hode og nakke tumorvev er høyere enn i tilstøtende ikke-cancervev (
p
0,01). Ingen signifikante forskjeller ble observert i EMMPRIN-1 og EMMPRIN-4-mRNA-ekspresjon mellom tumorvev og tilstøtende ikke-cancerøse vev (
p
0,05). (B) Sammenligning av EMMPRIN-2 mRNA uttrykk mellom 26 tilfeller av metastatiske svulster og 25 tilfeller av svulster uten noen tegn til lokal og fjernmetastaser. EMMPRIN-2 mRNA ekspresjon ble betydelig økt i metastatiske hode- og halskreft vev sammenlignet med ikke-metastatisk hode og nakke kreft vev (
p
0,05). (C) qPCR påvisning av EMMPRIN mRNA uttrykk i hode og nakke kreft cellelinjer. (D) Påvisning av EMMPRIN uttrykk i hode- og halskreft cellelinjer ved hjelp av Western blot. Høye nivåer av protein kodet av EMMPRIN-2-genet ble påvist i alt fire av kreftcellelinjer.
For å kunne fastslå sammenhengen mellom EMMPRIN-2 uttrykk og progresjon og metastasering av HNC, vi sammenlignet EMMPRIN-2 mRNA uttrykk i 26 tilfeller av metastatiske svulster og 25 tilfeller av svulster uten noen tegn til lokal og fjernmetastaser. Mens marginalt økte EMMPRIN-2-ekspresjon ble påvist i tumorer sammenlignet med de tilstøtende normale vev fra pasienter med ikke-metastatiske tumorer (Fig. 1B), markerte forskjeller i EMMPRIN-2-ekspresjon ble observert mellom svulster og de normale kontroll vev fra pasienter med metastatisk tumorer (fig. 1B). Videre EMMPRIN-2 uttrykk var betydelig høyere i metastatiske svulster enn hos ikke-metastatiske svulster (Fig. 1B). Ingen signifikante forskjeller i kjønn eller alder av pasienter med metastaserende og ikke-metastatiske svulster ble funnet.
Funn fra HNC vev ble ytterligere bekreftet av analysene utført i HNSCC cellelinjer (ACCM, Tca8113, TSCCA og SCC25). EMMPRIN-2 og EMMPRIN-4 var de store isoformene som ble uttrykt i alle 4 cellelinjer, og de relative ekspresjonsnivå av EMMPRIN-2 var mye høyere i kreftcellelinjer (som strekker seg 0,05 til 0,15, fig. 1 C) enn i de ikke-kreft HNC vev (som i gjennomsnitt omtrent 0.01, fig. 1A). Høye nivåer av protein som ble kodet av EMMPRIN-2-genet ble også påvist i alle fire kreftcellelinjer ved hjelp av western blot (Fig. 1 D).
2. EMMPRIN-2 fremmer hode og nakke kreft celle invasjon, migrasjon og vedheft in vitro, og metastasering in vivo
For å finne de funksjonelle roller EMMPRIN-2 over-uttrykk i invasjonen, migrasjon og vedheft av HNC celler vi eksperimentelt over-uttrykt og nedregulert EMMPRIN-2 uttrykk ved hjelp av en eksogen EMMPRIN-2 uttrykk vektor og siRNA (siEMMPRIN-2) i hode og nakke cellelinjer, ACCM og Tca8113. Som vist i figur 2, forsterket ekspresjon av EMMPRIN-2 fremmet hode og nakkekreft celle invasjon, adhesjon og migrering i både ACCM og Tca8113 cellelinjer. I motsetning til dette, eksperimentell nedregulering av EMMPRIN-2 ved anvendelse av siRNA dempes celle invasjon, migrering og adhesjon i de testede cellelinjer (fig. 2A, B og C).
Eksogent overekspresjon av EMMPRIN-2 ved hjelp av et uttrykk konstruere forbedret hode og nakke kreft celle invasjon (A), migrasjon (B) og heft (C), mens nedregulering av EMMPRIN-2 ved hjelp av siRNA (siEMMPRIN-2) trykt hode og nakke kreft celle invasjon (A), migrasjon ( B) og adhesjon (C). Forskjellene i celle invasjon, migrasjon og vedheft mellom om bygging eller siRNA-transfektert grupper og mock kontrollene var statistisk signifikant (
p
0,05). Virkningene av EMMPRIN-2 uttrykk på tumormetastaser in vivo ble videre undersøkt i nakne musemodeller. (D) Tca8113 hode og nakke kreft cellelinjer med stabilt uttrykt EMMPRIN-2 eller en mock-kontroll vektor ble intravenøst injisert i nakne mus. Metastatiske foki i lungene hos nakne mus ble beregnet ved uke 6 etter injeksjon. Det gjennomsnittlige antallet metastatiske foki i lungene fra musene med de EMMPRIN-2-uttrykkende celler var 28,4 sammenlignet med 6,4 i lungene fra musene injisert med celler som bærer styrevektor (
p
0,01).
Vi ytterligere utvidet våre in vitro observasjoner for å undersøke effekten av EMMPRIN-2 på HNC celle metastasering in vivo. Tca8113-celler som stabilt over-uttrykker EMMPRIN-2 eller kontrollvektor ble intravenøst injisert inn i nakne mus gjennom halevenen. Musene ble avlivet 6 uker etter injeksjonene, og lungene ble dissekert, fiksert med fosfatbufret nøytral formalin og parafin-innleiret. Metastatiske foki i lungene til de nakne mus ble tellet mikroskopisk på H 0,05). (B) Et mRNA-ekspresjon ble bekreftet ved å analysere proteinet ekspresjon ved hjelp av western blot. (C) Påvisning av ekstracellulære MMP-2, Cathepsin B og uPA ved hjelp av ELISA. MMP-2, Cathepsin B og uPA sekresjon til kulturmediet ble øket i celler som var blitt transfektert med EMMPRIN-2-ekspresjonsvektoren, mens sekresjon ble redusert i EMMPRIN-2 siRNA-transfekterte celler (
p
0,05). (D) Analyse av ekstracellulære MMP-2 aktivitet ved anvendelse av en gelatin zymografi assay. Ekstracellulære MMP-2 aktivitet ble økt etter EMMPRIN-2 uttrykk ble forbedret, mens MMP-2 aktiviteten ble redusert etter EMMPRIN-2 uttrykk knockdown.
I tillegg har vi undersøkt de ekstracellulære nivåer av alle tre proteiner ved hjelp av ELISA. De ekstracellulære nivåer av MMP-2, uPA og Cathepsin B i cellekulturmediet ble økt med EMMPRIN-2 ekspresjonsvektor transfeksjon og ble redusert med EMMPRIN-2 siRNA transfeksjon i både ACCM og Tca8113 celler (Fig. 3C). Disse funnene tyder på at EMMPRIN-2 fremmer spesielt ekstracellulære sekresjon, snarere enn uttrykk, av uPA, MMP-2 og Cathepsin B i hode og nakke kreft celler. Virkningene av EMMPRIN-2 på MMP-2 ekstracellulære sekresjon ble ytterligere bekreftet ved hjelp av en gelatin zymografi analysen. Som vist i figur 3D, økt ekstracellulær MMP-2 aktivitet i både ACCM og Tca8113 celler som hadde blitt transfektert med EMMPRIN-2-ekspresjonsvektoren, mens ekstracellulære MMP-2 aktivitet ble redusert i de cellelinjer som var blitt transfektert med EMMPRIN-2 siRNA (fig. 3D).
4. Cathepsin B er en viktig formidler av effektene av EMMPRIN-2 på invasjon, migrasjon og vedheft av hode- og nakkekreftceller
For å bestemme den funksjonelle rollen cathepsin B i EMMPRIN-2-indusert invasjon, migrasjon og vedheft, vi nedregulert Cathepsin B uttrykk i Tca8113 celler som overuttrykker EMMPRIN-2 bruker Cathepsin B siRNA. Behandling med Cathepsin B siRNA resulterte i tilsvarende reduksjoner i Cathepsin B mRNA og proteinnivåene i både paren og EMMPRIN-2 overekspresjon Tca8113 celler, mens EMMPRIN-2 og MMP-2 var upåvirket av Cathepsin B transfeksjon (fig. 4A og B). Ekstracellulær sekresjon av Cathepsin B ble også redusert ved siRNA behandling i Tca8113 celler, både i nærvær og fravær av EMMPRIN-2 overekspresjon (fig. 4C). Som observert i forsøkene ovenfor angitte, Tca8113-celler overuttrykkende EMMPRIN-2 vises øket celle invasjon, migrering og adhesjon sammenlignet med foreldre Tca8113 celler (Figur 4D). I motsetning til dette, nedregulering av Cathepsin B ved hjelp av siRNA vesentlig hemmet invasjon, migrering og adhesjon av Tca8113-celler overuttrykkende EMMPRIN-2 (fig. 4D), impliserer den funksjonelle betydning av Cathepsin B i EMMPRIN-2-mediert signalisering for tumor invasjon og . metastase
(A) Behandling med Cathepsin B siRNA resulterte i tilsvarende reduksjoner i Cathepsin B mRNA nivåer i både EMMPRIN-2 overekspresjon og foreldre Tca8113 celler (
p
0,05), mens EMMPRIN -2 og MMP-2 var upåvirket av Cathepsin B siRNA transfeksjon (
p
0,05). (B) Effekten på Cathepsin B, EMMPRIN-2 og MMP-2 ekspresjon følgende Cathepsin B siRNA transfeksjon i EMMPRIN-2 overekspresjon og paren Tca8113 celler ble ytterligere bekreftet ved hjelp av Western blot-analyser. (C) Det ekstracellulære sekresjon av Cathepsin B ble også redusert ved siRNA behandling i Tca8113 celler både i nærvær og fravær av EMMPRIN-2 overekspresjon (
p
0,05). (D) Som observert i forsøkene ovenfor, Tca8113 celler overekspresjon EMMPRIN-2 vises økt celle invasjon, migrasjon og vedheft i forhold til foreldre Tca8113 celler. I motsetning til nedregulering av Cathepsin B ved hjelp av siRNA vesentlig hemmet invasjon, migrasjon og vedheft av Tca8113 celler overekspresjon EMMPRIN-2.
Diskusjoner
Til tross for den fremgangen som har blitt gjort i behandling av lokalt fremskreden hode- og nakkekreft, forblir prognose sturen, og 5-års overlevelse ikke overstiger 40% [34]. Lokalt residiv og metastaser er ansvarlig for de fleste av dødsfall på grunn av hode- og halskreft.
